绞股蓝总苷对缺氧/复氧小鼠海马HT22细胞PAK1、CREB表达及凋亡的影响

目的探讨绞股蓝总苷(Gyp)对缺氧/复氧(O/R)小鼠海马HT22细胞p21活化蛋白激酶1(PAK1)、环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(CREB)表达及凋亡的影响。方法将小鼠海马HT22细胞分为正常对照组、O/R组、70 mg/L Gyp O/R组、85 mg/L Gyp O/R组和100 mg/L Gyp O/R组后,4组细胞建立O/R模型。观察细胞形态学变化;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;Western blot法测定各组B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、PAK1、CREB蛋白表达水平。结果正常对照组细胞贴壁生长,细胞膜光滑、完整,胞体折光性强,细胞突触明显,突触之间相互交织成网状;O/R组细胞贴壁不紧,细胞膜皱缩,胞质凝聚,细胞胞体突触明显减少,细胞间连接大量减少;70 mg/L Gyp O/R组、85 mg/L Gyp O/R组、100 mg/L Gyp O/R组细胞上述现象依次缓解。与正常对照组相比,O/R组细胞凋亡率、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达水平均升高(均P<0.05),Bcl-2、PAK1、CREB蛋白表达水平均降低(均P<0.05);与O/R组相比,70 mg/L Gyp O/R组、85 mg/L Gyp O/R组、100 mg/L Gyp O/R组细胞凋亡率、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达水平依次降低(均P<0.05),Bcl-2、PAK1、CREB蛋白表达水平依次升高(均P<0.05)。结论Gyp可能通过上调小鼠海马HT22细胞PAK1、CREB蛋白表达水平来抑制细胞凋亡。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对小鼠海马神经元细胞系HT22细胞DNA甲基转移酶表达和细胞周期的影响

目的:探究5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对小鼠海马神经元细胞系HT22细胞增殖及其对DNA甲基化转移酶(DNMT)表达的影响。方法:5-Aza-CdR处理HT22细胞,采用Real-time PCR和免疫印迹检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3BmRNA及蛋白的表达;甲基转移酶活性试剂盒检测DNMTs活性;流式细胞仪对其细胞周期及凋亡进行检测。结果:5-Aza-CdR处理HT22细胞24h后,不同浓度5-Aza-CdR均显著抑制HT22细胞增殖,且使胞质空泡化。5-Aza-CdR降低了HT22细胞早期凋亡,但促进晚期凋亡,并诱导细胞周期发生S期阻滞。DNMT1和DNMT3A的mRNA和蛋白表达下降,但DNMT3B表达未发生明显变化。DNMT1和DNMT3B活性降低。结论:5-Aza-CdR可降低DNMT1和DNMT3A mRNA和蛋白表达以及DNMT1和DNMT3B活性,影响HT22细胞周期及凋亡。

苦参碱对缺氧/复氧小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡的影响及机制研究

目的探讨苦参碱对缺氧/复氧(H/R)小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡及脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路的影响。方法将处于对数生长期的HT22细胞分为对照组、H/R组及苦参碱低、中、高浓度组。对照组HT22细胞用无血清DMEM培养基在正常环境下培养28 h;H/R组HT22细胞在缺氧培养箱中维持4 h后在常氧条件下培养24 h;苦参碱低、中、高浓度组的H/R处理同H/R组,同时给予浓度分别为10、20、30μmol/L的苦参碱进行干预,培养24 h。检测HT22细胞活力、凋亡情况及凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)]和BDNF/TrkB信号通路蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平降低,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,苦参碱低、中、高浓度组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平依次升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈浓度依赖性。结论苦参碱能减轻H/R导致的神经元HT22细胞活力的降低,抑制HT22细胞凋亡,其机制可能与激活BDNF/TrkB信号通路有关。

基于Nrf2/HO-1信号通路的夜关门提取物对谷氨酸诱导小鼠海马细胞HT22损伤的保护作用及机制研究

目的:基于核因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号通路研究夜关门提取物对谷氨酸诱导小鼠海马细胞HT22损伤的保护作用及机制。方法:采用谷氨酸(5 mmol/L)建立HT22细胞损伤模型后,以水溶性维生素E为阳性对照(50μmol/L),采用MTT法检测0(空白对照)、25、50、100μg/mL夜关门的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物预处理12 h后对谷氨酸诱导损伤细胞增殖的影响。以水溶性维生素E为阳性对照(50μmol/L),采用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐探针(DCFH-DA)法检测0(空白对照)、25、50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物预处理12 h后对谷氨酸诱导损伤细胞中活性氧(ROS)水平的影响;以HO-1激动剂钴-原卟啉为阳性对照,采用Western blotting法检测0(空白对照)、25、50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物处理24 h后对细胞中HO-1蛋白表达的影响;分别采用Western blotting法(药物分别处理0.5、1、1.5 h)和免疫荧光染色法(药物处理1 h)检测100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物处理后对细胞核内外Nrf2蛋白表达的影响。采用小干扰RNA(si-RNA)转染技术进行HO-1基因沉默后,考察100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸诱导损伤细胞的存活率以及细胞中ROS水平的影响。结果:与空白对照比较,50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物均可显著升高细胞的存活率(P<0.05),并降低细胞中ROS水平(P<0.05);25、50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物均可显著升高细胞中HO-1蛋白表达水平(P<0.05),100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物可显著降低细胞质中Nrf2蛋白水平并升高细胞核中Nrf2蛋白水平(P<0.05)。HO-1基因沉默后,夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸诱导损伤细胞的促增殖以及降低ROS水平的作用被逆转(P<0.05)。结论:夜关门二氯甲烷提取物可通过激活Nrf2信号通路,诱导HO-1蛋白的表达,从而发挥对谷氨酸诱导损伤HT22细胞的保护作用。

miR-132-3p靶向调控PTEN/Akt信号通路对缺氧/复氧诱导海马神经元HT22细胞损伤的影响

目的研究miR-132-3p靶向调控第10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对缺氧/复氧(H/R)诱导海马神经元HT22细胞损伤的影响。方法体外培养HT22细胞并随机分为对照组、H/R组、阴性对照(miR-132-3p mimics阴性对照+空载质粒)组、miR-132-3p mimics组(miR-132-3p mimics)、PTEN敲低组(PTEN siRNA质粒)、miR-132-3p mimics+PTEN过表达组(miR-132-3p mimics+PTEN过表达质粒),除对照组外,其余各组进行H/R处理,同时进行分组转染,然后采用qRT-PCR实验、免疫印迹法检测各组细胞miR-132-3p与PTEN/Akt通路相关蛋白表达;采用MTT法、TUNEL染色分别检测各组细胞增殖与凋亡情况;采用试剂盒测量各组细胞活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素(IL)-6、IL-18水平;采用免疫印迹法检测各组细胞凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)表达;采用双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p对HT22细胞PTEN的靶向调控。结果与对照组相比,H/R组细胞miR-132-3p表达、p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力降低(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。与H/R组相比,miR-132-3p mimics组、PTEN敲低组p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力升高(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05);阴性对照组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。与miR-132-3p mimics相比,miR-132-3p mimics+PTEN过表达组p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力降低(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。miR-132-3p可靶向下调HT22细胞PTEN表达。结论miR-132-3p可通过靶向下调PTEN表达而激活Akt信号,进而抑制H/R诱导的HT22细胞炎症与凋亡,缓解其细胞损伤。

鹿茸多肽对冈田酸诱导的小鼠海马神经元HT22细胞损伤模型中PI3K、AKT、Caspase-9表达的影响

目的观察鹿茸多肽对冈田酸(OA)诱导的小鼠海马神经元HT22细胞损伤模型中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)表达的影响,探讨鹿茸多肽对HT22细胞损伤模型的保护作用机制。方法采用含10%胎牛血清(FBS)培养液(DMEM/F12)传代培养HT22细胞7d后,分为正常对照组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、OA细胞损伤模型组、鹿茸多肽高、中、低剂量组。正常对照组给予含10%FBS的DMEM/F12,DMSO对照组给予DMSO终浓度<0.01%的DMEM/F12,OA细胞损伤模型组给予10nmol OA的DMEM/F12,鹿茸多肽高、中、低剂量组分别给予50、500、1000μg/ml的DMEM/F12,于37℃、5%CO2条件下孵育24h。利用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,酶联免疫法(ELISA)检测各组实验细胞内PI3K、AKT含量,蛋白质印迹法(Western Blot)检测各组实验细胞内PI3K、AKT、Caspase-9表达水平。结果MTT比色法检测结果表明,与OA细胞损伤模型组比较,鹿茸多肽能够明显提高细胞存活率(P<0.05);ELISA检测结果表明,与OA细胞损伤模型组比较,鹿茸多肽能够明显提高受损HT22细胞内PI3K、AKT含量(P<0.05或P<0.01);Western Blot检测结果表明,与OA细胞损伤模型组比较,鹿茸多肽能够明显提高受损HT22细胞内PI3K、AKT、Caspase-9表达水平(P<0.05或P<0.01)。结论鹿茸多肽对OA诱导的HT22细胞损伤模型具有保护作用,作用机制可能与调节受损HT22细胞内PI3K、AKT、Caspase-9表达水平相关。

miRNA-210-3p对缺氧诱导海马神经细胞HT22凋亡的影响

目的:研究miRNA-210-3p对缺氧诱导海马神经细胞凋亡的影响及机制。方法:将海马神经元HT22细胞分成4组,分别为对照组、缺氧组、阴性对照+缺氧组、miRNA-210-3p+缺氧组,采用qRT-PCR方法检测HT22细胞中miRNA-210-3p的表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平,用硫代巴比妥酸法检测MDA含量,用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH-Px活性,用水溶性四唑盐法检测SOD活性。结果:转染miRNA-210-3p模拟物的HT22细胞经缺氧处理后,细胞中miRNA-210-3p表达水平升高(P <0. 05)。缺氧处理后的HT22细胞凋亡率升高,细胞中活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平升高,GSH-Px、SOD活性降低,MDA含量升高(P <0. 05);上调miRNA-210-3p表达可拮抗缺氧诱导的HT22细胞凋亡和活化型Caspase-3、Caspase-9蛋白表达,提高细胞中GSH-Px、SOD活性,降低细胞中MDA含量(P <0. 05)。结论:上调miRNA-210-3p能够抑制缺氧诱导的海马神经细胞凋亡,其作用机制可能与降低氧化应激有关。

连翘苷对L-谷氨酸诱导的HT22细胞及APP/PS1小鼠的保护作用

目的研究连翘苷对L-谷氨酸(L-Glu)诱导的HT22细胞损伤模型及APP/PS1小鼠的保护作用。方法用25 mmol/L L-Glu诱导HT22细胞产生神经毒性,给予5、10、20、40、80μmol/L连翘苷,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测连翘苷对细胞活力的影响。通过流式细胞仪检测5、20μmol/L连翘苷对L-Glu诱导的HT22细胞凋亡和线粒体膜电位的影响。APP/PS1小鼠口服5、20 mg/kg连翘苷7 w后进行行为学实验,8 w后小鼠吸入CO_(2)进行安乐死处理,解剖取脑组织,通过免疫组化研究脑内β淀粉样蛋白(Aβ)斑块,通过Western印迹研究连翘苷的神经保护机制。结果在HT22细胞中,10~80μmol/L连翘苷能显著提高细胞活力(P<0.001),阻止由L-Glu引起的细胞凋亡和线粒体膜电位失衡(P<0.05)。连翘苷能提高小鼠的记忆力和空间认知能力,减少脑内Aβ沉积,并改善Bcl-2蛋白家族的表达水平(P<0.01)。结论连翘苷对L-Glu诱导的HT22细胞和APP/PS1小鼠有良好的保护作用,其作用机制可能与连翘苷抗细胞凋亡活性相关。

GABRG2基因敲除小鼠和HT22细胞通过激活PKA/NF-κB信号通路影响MMP3的表达

目的探究GABRG2基因敲除后小鼠海马和HT22细胞中基质金属蛋白酶(MMP)3的表达变化及潜在参与机制。方法动物实验:利用Cre/loxp重组酶系统所构建的GABAA受体γ2亚基(GABRG2)基因条件性敲除小鼠(GABRG2fl/wtCre+)模型为实验组,野生型小鼠作为对照组,用Western blot技术检测小鼠海马中GABRG2、PKA、p-PKA、NF-κB、MMP3蛋白的表达情况;免疫荧光技术观察海马中GABRG2、MMP3蛋白的表达情况;尼氏染色技术观察GABRG2基因缺失对小鼠海马神经元的影响。细胞实验:利用CRISPR/Cas9技术构建GABRG2基因敲除的HT22细胞为实验组,HT22细胞为对照组。Western blot技术检测各组细胞中GABRG2、PKA、pPKA、NF-κB、MMP3蛋白的表达情况;免疫荧光技术观察各组细胞中GABRG2、MMP3蛋白的表达情况。结果动物实验:Westernblot结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠海马组织中GABRG2蛋白表达降低(P<0.05),p-PKA、NF-κB、MMP3蛋白表达均升高(P均<0.05),PKA蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);免疫荧光结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠海马区GABRG2表达降低,MMP3表达升高,特别在海马CA3区表达明显升高。尼氏染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠海马神经元的结构松散,神经元离散程度提高。细胞实验:Western blot结果显示,与对照组细胞相比,实验组细胞GABRG2蛋白表达降低(P<0.05),pPKA、NF-κB、MMP3蛋白表达均升高(P均<0.05),PKA表达差异无统计学意义(P>0.05);细胞免疫荧光结果显示,与对照组细胞相比,实验组细胞GABRG2的表达降低,MMP3的表达升高。结论GABRG2基因缺失小鼠海马和HT22细胞均引起MMP3蛋白表达增高,其机制可能与上游PKA/NF-κB信号通路的调控有关。

HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制研究

目的探讨HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制。方法利用小鼠海马神经元细胞系HT22为研究对象,HT22细胞经氧糖剥夺再灌注损伤及Grasp65过表达干预后,采用MTT法检测细胞存活率;Hoechest33258荧光染色法评估细胞凋亡;并应用细胞免疫荧光技术观察高尔基体的形态;应用Western blot技术检测GM130和GAAP蛋白的表达。结果氧糖剥夺再灌注可导致HT22细胞的活性显著降低(P<0.05),凋亡率显著增高(P<0.05);并可导致高尔基体形态的异常,随着再灌注时间的延长,高尔基体逐渐发生碎裂,尤其以再灌注12 h和24 h最为明显;GM130、GAAP的表达水平在氧糖剥夺再灌注后出现下降,特别是在再灌注12 h、24 h后出现了显著下降(P<0.05)。过表达Grasp65后,HT22细胞在氧糖剥夺再灌注所致高尔基体碎裂出现减少(P<0.05),碎裂程度减轻,同时GM130和GAAP的表达均显著增加(P<0.05),HT22细胞的存活率大大提高(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05)。结论缺血再灌注损伤的细胞模型中,同样发生了高尔基体的碎裂;过表达Grasp65可以减轻氧糖剥夺再灌注损伤所致的高尔基体碎裂,并可以减少HT22细胞的凋亡,其机制可能与上调GM130和GAAP的表达有关。

小檗碱对冈田酸诱导HT22细胞损伤的保护作用

目的 本实验以冈田酸（OA）损伤的HT22细胞作为氧化应激损伤的体外模型,探讨小檗碱对OA氧化应激损伤作用的影响及其机制。方法 应用CCK-8法检测不同浓度冈田酸（0、20、40、60、80、160 nmol/L）损伤HT22细胞12 h后的细胞活力;不同浓度小檗碱（2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L）预处理HT22细胞12 h后加入OA损伤12 h,应用CCK-8比色法检测细胞的增殖状况;倒置显微镜下观察细胞形态学变化;应用试剂盒对细胞丙二醛（MDA）和抗氧化酶（SOD-1和GSH-Px）活性的进行测定;2′,7′-dichlorfluorescein-diacetate（DCFH-DA）染色检测HT22细胞内ROS水平;Western blot法检测Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果 OA（0-160 nmol/L）处理HT22细胞12 h后,细胞活力分别为（100.00±0.42）%、（91.96±1.18）%、（72.79±1.51）%、（57.89±3.18）%、（41.50±1.58）%、（33.83±1.59）%,细胞活力呈浓度依赖性下降;小檗碱（2.5-20.0μmol/L）预处理细胞12 h后,再给予OA作用12 h,细胞活力由OA单独损伤组（76.48±3.94）%,分别上升至（89.18±3.38）%、（97.06±5.56）%、（94.85±3.16）%、（87.52±4.81）%;小檗碱（5.0、10.0μmol/L）预处理组,减少了MDA的产生,抑制了细胞内ROS的积聚,提高了抗氧化酶（SOD-1和GSH-Px）活性,下调了Cleaved caspase-3蛋白表达。结论 小檗碱可以通过对抗OA诱导的HT22细胞氧化应激损伤和凋亡发挥其神经保护作用。

姜黄醇通过抑制铁死亡途径减轻HT22小鼠海马神经元细胞损伤

目的 验证姜黄醇可抑制埃拉斯汀(Erastin)诱导的HT22细胞铁死亡并发挥细胞保护作用。方法 先通过Western blot检测观察不同时间梯度(0、4、8、12、24 h)Erastin对HT22细胞铁死亡相关蛋白表达的影响,再将HT22细胞分为正常对照组、DMSO组、Erastin处理组(0.5μmol·L^(-1) Erastin处理24 h)、姜黄醇组(0.5μmol·L^(-1) Erastin处理24 h+50μmol·L^(-1)姜黄醇处理48 h),通过Western blot检测HT22细胞铁死亡相关蛋白表达水平;细胞铁离子试剂盒、细胞亚铁含量试剂盒检测细胞内总铁、亚铁水平;CCK-8试剂盒检测细胞活力、AnnexinV/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡。结果 Erastin刺激上调了HT22细胞xCT(P<0.05)、NCOA4(P<0.001)、ASCL4(P<0.01)水平,降低GPX4(P<0.001)、FPN(P<0.01)、FTH1(P<0.05)水平。DMSO组与正常对照组间铁蛋白相关蛋白水平、铁离子水平、细胞活力、细胞凋亡率无统计学差异。相比Erastin组,姜黄醇处理组神经元细胞活力显著升高(P<0.001)、细胞GPX4酶升高(P<0.01),细胞死亡率、细胞总铁、亚铁含量降低(P<0.001);xCT(P<0.001)、NCOA4(P<0.001)、ASCL4(P<0.001)水平显著下调,FTH1(P<0.01)、GPX4(P<0.001)蛋白水平显著上调。结论 姜黄醇可抑制Erastin诱导的HT22铁死亡并发挥细胞保护作用。

氯化钴对小鼠海马神经元细胞缺氧损伤的影响

目的:研究氯化钴(CoCl2)对小鼠海马神经元细胞系HT22细胞缺氧损伤的影响。方法:实验分为3组,分别为低浓度氯化钴组(CoCl2-L)、中浓度氯化钴组(CoCl2-M)和高浓度氯化钴组(CoCl2-H)。利用不同浓度CoCl2处理HT22细胞建立细胞缺氧损伤模型,通过HE染色观察HT22细胞轴突损伤情况,CCK-8法检测HT22细胞体外增殖活性,Western Blot检测HT22细胞中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和tau蛋白的表达情况。结果:HE染色显示CoCl2可致HT22细胞轴突断裂,CCK8检测显示CoCl2对HT22细胞的增殖有明显抑制作用。Western Blot结果显示CoCl2-H组细胞中HIF-1α表达显著上调,tau蛋白表达显著降低。结论:CoCl2可致轴突损伤,并且上调HT22细胞的HIF-1α表达、降低tau的表达。

红景天苷对H_2O_2损伤后HT22细胞的保护作用

目的以H_2O_2损伤的HT22细胞为体外氧化损伤模型,探讨红景天苷对HT22细胞氧化损伤的作用和机制。方法以0、250、500、1 000μmol/L H_2O_2损伤HT22细胞24 h后,用0、100、400μmol/L红景天苷干预24 h,在倒置显微镜下观察HT22细胞形态学变化。CCK-8比色法检测HT22细胞存活率。免疫荧光组织染色检测超氧化物歧化酶-2(SOD2)的表达。结果加入不同浓度H_2O_2诱导损伤后,HT22细胞生长被抑制,受抑制程度随H_2O_2浓度变化而渐变。H_2O_2损伤后,HT22细胞存活率呈浓度依赖性下降;红景天苷可以逆转HT22细胞存活率的下降,且使细胞形态变化得到改善。染色显示H_2O_2损伤后HT22细胞的SOD2表达增加,但红景天苷干预后SOD2的表达显著降低(P<0.05)。结论红景天苷可以拮抗H_2O_2氧化损伤发挥神经保护作用。

小鼠海马神经元细胞系HT22微环境诱导BMSCs神经分化

目的探讨小鼠海马神经元细胞系HT22的微环境对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的定向诱导作用。方法分别培养HT22细胞和GFP转基因荧光小鼠的BMSCs;直接接触法和间接接触法共培养,荧光显微比较GFP标记的干细胞形态变化;收集间接接触共培养的BMSCs行Western blot检测神经相关的蛋白(GFAP,NSE)的表达和变化;利用免疫荧光法检查GFAP和NSE抗原在细胞内的表达。结果培养的骨髓贴壁细胞为CD11b、CD45阴性,CD90阳性。与HT22细胞直接接触共培养及间接接触共培养的BMSCs细胞长轴增长,轴突样突起明显;经HT22细胞培养液诱导的BMSCs内GFAP、NSE表达水平随时间增加而增强;与HT22细胞直接接触共培养诱导的BMSCs表达GFAP和NSE。结论小鼠海马神经元细胞系HT22的微环境可诱导BMSCs向神经元样细胞分化。

7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘诱发小鼠海马神经元HT22细胞铁死亡及其机制

[背景]苯并[a]芘(BaP)具有神经毒性,可诱发人和动物海马神经元死亡从而导致空间学习记忆功能障碍,但其机制尚不清楚。[目的]观察BaP活性代谢物7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)诱发小鼠海马神经元HT22细胞铁死亡的发生规律,初步探讨其潜在机制,为BaP神经毒性机制研究提供依据。[方法]选用小鼠海马神经元HT22细胞,分为溶剂对照组和低、中、高浓度BPDE染毒组(0.25、0.50、0.75μmol·L^(-1))。CCK8法测定细胞存活率。光镜和电镜观察细胞形态及超微结构。荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平和Fe^(2+)水平。试剂盒检测细胞内铁、4-羟基壬烯酸(4-HNE)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平。Western blotting法检测铁死亡特征蛋白酰基辅酶A合成长链家族成员4(ACSL4)、环氧合酶2(COX2)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达水平。用铁死亡抑制剂20μmol·L^(-1)去铁胺(DFO)和10μmol·L^(-1)3-氨基-4-环己基氨基苯甲酸乙酯(Fer-1)进行干预,观察对各浓度BPDE染毒组细胞存活率和相关铁死亡特征指标和蛋白表达水平的影响。[结果]随着BPDE染毒浓度的增加,HT22细胞存活率逐渐下降,各BPDE染毒组细胞存活率均明显低于溶剂对照组(P<0.01)。光镜下可见高浓度BPDE组细胞数量明显减少,形态萎缩变形,突触减少;电镜下可见高浓度BPDE组HT22细胞表现出线粒体皱缩,嵴减少,线粒体膜密度增加。与溶剂对照组相比,高浓度染毒组细胞内脂质ROS、Fe^(2+)、4-HNE及MDA水平明显增加(P<0.01);GSH、GSH-PX水平明显降低(P<0.01),ASCL4、COX2蛋白表达水平明显增加(P<0.01),SLC7A11、GPX4蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。铁死亡抑制剂DFO、Fer-1可明显逆转高浓度BPDE组细胞的存活率(P<0.01)、铁死亡特征指标(ROS、Fe^(2+)、4-HNE、MDA、GSH、GSH-PX水平)(P<0.01)以及铁死亡相关蛋白水平的表达(ACSL4、COX2、SLC7A11、GPX4)(P<0.01)。[结论]BPDE可诱发小鼠海马神经元HT22细胞铁死亡,其机制可能与抑制SLC7A11/GSH/GPX4轴及诱发细胞铁离子代谢紊乱有关。

蛋白酶抑制剂H89对神经元细胞氧糖剥夺再灌注后高尔基体形态及细胞凋亡的影响

目的探讨蛋白酶抑制剂H89对神经元细胞经氧糖剥夺再灌注损伤后高尔基体形态和细胞凋亡的影响。方法将体外常规培养的小鼠海马神经元细胞HT22分为对照组、模型组和H89干预组。模型组与H89干预组按再灌注时间点分6h、12h和24h三个亚组。采用MTT法检测细胞存活率;Hoechest33258荧光染色法评估细胞凋亡;细胞免疫荧光技术观察高尔基体形态;Western blot技术检测GM130与GAAP蛋白表达。结果 H89干预组较模型组细胞活力有所上升,其中12h时间点(OD值0.1467±0.0090)与同期模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。H89干预组较模型组细胞凋亡率有所下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。H89干预组在6h和12h时间点高尔基体碎裂程度较同期模型组稍有减轻。H89干预组GM130表达水平较模型组无显著升高(P>0.05)。GAAP表达水平仅在24h时间点(灰度比值0.4066±0.0288)显著升高(P<0.05)。结论 H89干预不能减轻神经元细胞经氧糖剥夺再灌注损伤后的高尔基体碎裂和细胞凋亡。

褪黑素调控自噬对高糖环境下HT22细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 构建高糖环境下缺氧复氧损伤小鼠海马神经元HT22细胞模型,探讨褪黑素(melatonin, Mel)调控自噬对高糖环境下HT22细胞缺氧复氧损伤的影响。方法 小鼠海马神经元HT22细胞分为高糖组、高糖缺氧复氧组、高糖缺氧复氧+Mel组、高糖缺氧复氧+Mel+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)组。高糖组于高糖培养基、常氧环境中培养,建立高糖模型;高糖缺氧复氧组在建立高糖模型后,进行细胞周期同步化处理,无糖无血清培养基、低氧环境中培养6 h,高糖培养基、常氧环境中培养24 h,建立缺氧复氧模型;高糖缺氧复氧+Mel组和高糖缺氧复氧+Mel+3-MA组在建立高糖模型、细胞周期同步化处理后,分别加入100μmol/L Mel、100μmol/L Mel+5 mmol/L 3-MA,于高糖培养基、常氧环境中预培养4 h,再建立缺氧复氧模型。造模后取4组细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平,TBA法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平,WST-1法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1、自噬相关蛋白14(autophagy related 14, Atg14)蛋白相对表达量并计算LC3Ⅱ/Ⅰ。结果 高糖缺氧复氧组细胞活力(0.37±0.14)、SOD水平[(51.88±11.76)u/mg]、LC3Ⅱ/Ⅰ(0.35±0.16)及Beclin1(0.31±0.15)、Atg14(0.32±0.16)蛋白相对表达量均低于高糖组[1.00±0.09、(151.54±24.25)u/mg、1.00±0.14、1.00±0.13、1.00±0.11](P<0.05),细胞凋亡率[(28.26±5.37)%]、活性氧(5.38±0.85)、MDA [(20.77±3.58)nmol/mg]水平均高于高糖组[(7.83±2.35)%、1.01±0.69、(6.13±1.40)nmol/mg](P<0.05);高糖缺氧复氧+Mel组细胞活力(0.79±0.13)、SOD水平[(112.60±17.69)u/mg]、LC3Ⅱ/Ⅰ(0.69±0.16)及Beclin1(0.75±0.12)、Atg14(0.74±0.14)蛋白相对表达量均高于高糖缺氧复氧组(P<0.05),细胞凋亡率[(15.16±3.23)%]、活性氧(2.69±0.92)、MDA水平[(10.33±2.18)nmol/mg]均低于高糖缺氧复氧组(P<0.05);高糖缺氧复氧+Mel+3-MA组细胞活力(0.43±0.11)、SOD水平[(73.92±17.23)u/mg]、LC3Ⅱ/Ⅰ(0.39±0.15)及Beclin1(0.41±0.14)、Atg14(0.41±0.15)蛋白相对表达量均低于高糖缺氧复氧+Mel组(P<0.05),细胞凋亡率[(22.85±4.36)%]、活性氧(4.72±1.02)、MDA水平[(16.05±1.98)nmol/mg]均高于高糖缺氧复氧+Mel组(P<0.05)。结论 Mel可通过增强自噬、抑制氧化应激和细胞凋亡,减轻高糖环境下小鼠海马神经元HT22细胞缺氧复氧损伤,发挥神经保护作用。

越鞠丸合甘麦大枣汤加减对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤模型的神经保护作用

目的:探讨越鞠丸合甘麦大枣汤加减(YJGZ)对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞系(HT22)细胞损伤的神经保护作用。方法:HT22细胞系无菌培养,以高浓度谷氨酸建立细胞损伤模型,并制备YJGZ水提液和含药血清,分为正常组,模型组,YJGZ含药血清组(1%,5%,10%),YJGZ水提液组(166 mg·L^(-1)),尼莫地平组(100μmol·L^(-1))。噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率及细胞内活性氧自由基(ROS)的含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位2B蛋白(NR2B),环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB),磷酸化CREB(p-CREB),细胞外调节蛋白激酶(ERK),磷酸化ERK(p-ERK)的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组细胞存活率显著下降(P <0. 01),乳酸脱氢酶(LDH)释放率明显增加(P <0. 05),细胞内活性氧(ROS)水平明显增加(P <0. 05),NR2B蛋白的表达明显升高(P <0. 05),CREB,p-CREB,ERK,p-ERK蛋白表达水平明显降低(P <0. 05);与模型组比较,YJGZ水提液组和尼莫地平组均能显著提高谷氨酸模型条件下HT22细胞的存活率(P <0. 01),减少细胞损伤,减少LDH的释放率,降低细胞内ROS水平(P <0. 05,P <0. 01),降低NR2B蛋白的表达水平(P <0. 05),增加CREB,p-CREB,ERK,p-ERK蛋白的表达(P <0. 05); YJGZ含药血清组与模型组比较,HT22细胞存活率并没有提高。结论:YJGZ水提液对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤具有显著的保护作用。

重组人Neuritin蛋白生物学活性的定量分析方法

目的建立一种快速高效地定量评价重组人Neuritin(rhNeuritin)蛋白生物学活性的新方法。方法首先建立小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)维持培养条件。在此条件下,明确rhNeuritin蛋白作用于HT22细胞的最佳检测时间。根据11组不同浓度梯度的rhNeuritin蛋白对HT22细胞存活的影响,建立标准品rhNeuritin蛋白与HT22细胞存活的量效关系曲线;并确定rhNeuritin蛋白的检测范围。在rhNeuritin蛋白的检测限内,根据标准品rhNeuritin蛋白与HT22细胞存活之间的量效关系的拟合曲线,制订标准品蛋白的活性单位,建立了针对rhNeuritin蛋白生物学活性的评价体系。利用两批测试品rhNeuritin蛋白,对该方法的重复性和准确性进行了验证。结果HT22细胞的维持培养液的浓度为0.4%FBS,rhNeuritin蛋白作用于HT22细胞的最佳检测时间为72 h,rhNeuritin蛋白浓度在62.5~1000 ng·mL^(-1)的检测限内,HT22细胞的存活与rhNeuritin蛋白的浓度呈正相关。在rhNeuritin蛋白的检测线内,拟定标准品的EC50为一个活性单位。两组测试品rhNeuritin蛋白的量效关系曲线与标准品呈现相同趋势,3者R 2均大于0.9,说明该方法的重复性很好。通过拟订的标准品的活性单位,计算得到500 ng·mL^(-1)时测试品1和测试品2的活性单位分别为1.059、1.069,而实验实际测得测试品1和测试品2的活性单位分别为1.074和1.088,与测定的活性单位相比,两组测试品计算得到的活性单位的误差小于2%,说明该实验方法具有较好的准确性。结论成功建立了重组人Neuritin蛋白的定量检测方法,并制定了明确的活性单位。