肝癌细胞核蛋白对白蛋白增强子／启动子序列的体外转录调控作用

目的：研究肝癌细胞核蛋白调控白蛋白＂持家基因＂转录调控序列对目的基因转录的作用。方法：分别从小鼠肝癌细胞、肝细胞和黑色素瘤细胞中提取核蛋白组分，用于体外启动白蛋白增强子／启动子的转录作用。结果：发现某些肝癌细胞和肝细胞核蛋白组分具有明显的转录作用，而细胞浆蛋白和其他肿瘤核蛋白组分没有转录作用，将同一肝癌细胞某些核蛋白组分合并可使转录活性增强。结论：本研究在基因转录调控水平部分解释了应用白蛋白增强子／启动子调控目的基因于肝癌细胞中特异表达的机理。

小鼠ALB启动子/增强子驱动HSV-tk对肝脏细胞的杀伤效应(英文)

利用小鼠白蛋白 (ALB)启动子 /增强子及单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶 (HSV tk)DNA构建了载体pLLTK ,以研究该载体对肝脏细胞的特异性杀伤效应。首先 ,为了比较载体的肝脏细胞特异转录活性 ,以绿色荧光蛋白 (GFP)基因为报告基因构建了载体 pLE (仅含小鼠ALB启动子 )、pLLE(含小鼠ALB启动子和上游增强子 )和 pLEL(含小鼠ALB启动子和下游增强子 ) ,分别转染到人肝细胞株Hep G2与小鼠乳腺上皮细胞株HC 11,荧光显微镜与流式细胞术分析GFP的表达。然后将载体pLLTK转染到Hep G2研究对细胞的杀伤效应。结果发现 :小鼠ALB启动子 /增强子能驱动GFP肝脏特异表达 ;HSV tk在Hep G2表达使细胞具有更昔洛韦 (GCV)敏感性 ,在GCV作用 7d后 ,MTT分析细胞的生存率 ,pLLTK转染细胞表现明显的细胞死亡 (5 3% ) ,而阴性对照组pcDNA3 1转染细胞没有明显变化 (仅 2 %细胞死亡 )。以上结果表明所有的载体具有肝脏细胞特异性 。

小鼠白蛋白启动子的组织特异性功能研究

以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,通过对比小鼠白蛋白启动子在不同来源细胞系中启动GFP基因的转录活性,对小鼠白蛋白启动子的组织特异性进行了研究。结果发现,小鼠白蛋白启动子在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和人肝癌细胞系HepG2均有很强的转录起始功能,荧光显微镜下可以观察到GFP表达。Hepa1-6细胞在转染早期的48h内,CMV的启动子和增强子序列是小鼠白蛋白启动子转录活性的4倍。G418加压筛选2周后,CMV的启动子的转录活性下降到只有小鼠白蛋白启动子活性的1/2。转染人肝癌细胞系HepG22周后,荧光显微镜下可以观察到GFP表达。其他的细胞如中华仓鼠卵巢细胞系CHO和人肺癌细胞系PLA801中转染的小鼠白蛋白启动子不能启动GFP的表达,而对照CMV启动子控制下的GFP基因可在CHO和PLA801中表达。以上结果说明,小鼠白蛋白启动子仅在肝脏来源的细胞中可以起始下游基因的转录,在其他组织来源的细胞中不能起始转录,这表明小鼠白蛋白启动子具有肝脏组织特异的转录活性,但没有种属特异性。

小鼠巢蛋白基因启动子及其组织特异性增强子

该发明专利提供了一种小鼠巢蛋白启动子元件和增强子元件，包括这些元件的构建物和载体，以及它们的用途。

小鼠白蛋白增强子在肝癌细胞系中无增强功能

目的 :鉴定小鼠白蛋白增强子序列在肝癌细胞系中对白蛋白启动子转录活性的影响。方法 :以绿色荧光蛋白 (GFP)基因作为报告基因 ,将小鼠白蛋白增强子序列 (_10 .2 1～_8.4 3kb)之间的不同区段与白蛋白启动子相融合 ,转染不同组织来源细胞系 ,用荧光显微镜和流式细胞仪分别对GFP的表达情况进行分析。结果 :瞬时转染小鼠肝癌细胞系Hepa 1_6 ,上游的不同增强子区段均不能增强白蛋白启动子的转录活性 ,相反 ,它们都不同程度地下调了启动子的转录活性 ;稳定转染期 ,E1E3能极弱地增强启动子的转录活性。稳定转染人肝癌细胞系HepG2 ,上游的不同增强子区段均能抑制白蛋白启动子的转录活性 ,导致报告基因不能表达。在非肝脏组织的细胞系中 ,小鼠白蛋白启动子无转录活性。结论 :只使用白蛋白启动子在肝癌细胞系中表达目的基因较同时使用白蛋白启动子和增强子效果会更好。

携带白蛋白启动子小鼠SCP2基因表达载体的构建

胆汁中胆固醇的过多分泌伴随肝细胞浆内胆固醇的浓度显著增高是形成胆固醇结石的关键因素，其中固醇携带蛋白2（SCP2）是影响肝细胞中游离胆固醇浓度的主要因素。本实验旨在构建携带白蛋白启动子小鼠SCP2基因表达载体。

C/EBPα参与小鼠胰岛β细胞囊泡谷氨酰胺转运子2基因表达的调控

目的:探讨转录调节因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在小鼠胰岛β细胞株MIN6的囊泡谷氨酰胺转运子2(VGLUT2)基因表达过程中的调控作用。方法:克隆小鼠VLGUT2基因的启动子区,并对其中C/EBPα的结合位点进行了核酸定点突变,以荧光素酶活力方法观察突变后的启动子活性改变情况。通过电泳迁移率实验(EMSA)检测C/EBPα与含有小鼠VGLUT2启动子区核酸序列的核苷核探针的结合能力,以CEBPαsiRNA特异性抑制转录调控因子C/EBPα的基因表达,通过荧光素酶,RT-PCR和Western blotting方法观察抑制C/EBPα基因表达后小鼠VGLUT2的基因表达情况。结果:在对小鼠VGLUT2启动子区C/EBPα结合位点进行核酸定点突变后,小鼠VGLUT2启动子活性下降约50%,EMSA实验表明C/EBPα可与小鼠VGLUT2启动子区结合,当以C/EBPαsiRNA特异性地下调C/EBPα的表达时,小鼠VGLUT2的启动子活性、mRNA和蛋白水平也相应各自下降约60%、40%及45%。结论:C/EBPα参与了小鼠VGLUT2的基因表达调控。

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价