一种操作简便的小鼠原代白色成熟脂肪细胞培养方法

目的 建立一种适合短期培养、操作简便、成本低廉的白色成熟脂肪原代细胞培养的方法。方法 本研究通过分离小鼠附睾处和肾周白色成熟脂肪细胞后,分别采用短期成熟脂肪细胞培养方法和天花板培养方法,培养原代白色成熟脂肪细胞。油红O染色鉴定并观察成熟脂肪细胞细胞形态,CCK8法测定细胞活性,并通过Western blot检测PPARγ蛋白相对表达量,qPCR检测CD36、FAS、CPT1A、FABP4 m RNA表达量。结果 油红O染色显示改良培养方法细胞形态良好、均一,而天花板法细胞形态出现变化。CCK8显示新鲜分离的白色成熟脂肪细胞与此培养方式细胞活性差异无统计学意义(P=0.959,P=0.657,P=0.694)。Western blot显示新鲜分离的白色成熟脂肪细胞与培养72 h细胞的PPARγ蛋白表达量差异无统计学意义(P=0.759),在使用GW9662处理后显著下降(P<0.001)。q PCR显示,经过GW9662处理后CD36、CPT1A mRNA表达量上调(P<0.001,P=0.003),FAS、FABP4 mRNA表达量下调(P=0.001,P<0.001)。结论 本研究建立了一种培养时间短、操作简单的原代白色成熟脂肪细胞的培养方法,为成熟脂肪细胞的相关研究提供技术保障。

姜黄素诱导小鼠皮下前脂肪细胞棕色化的作用及机制

目的:本研究探究了姜黄素促进白色脂肪细胞棕色化的作用及其潜在机制。方法:抽提小鼠皮下原代脂肪细胞,并诱导其分化成熟。予姜黄素(10、20、40μmol/L)孵育48 h,油红O染色观察脂肪细胞脂滴形态;使用线粒体绿色荧光探针(Mito Tracker Green)检测白色脂肪细胞内线粒体数量;运用线粒体超氧化物红色荧光探针(Mito SOX Red)测定细胞线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;应用ATP试剂盒检测细胞内ATP含量;Real-time PCR检测棕色化相关标志性基因的表达水平;最后利用β3肾上腺素能受体(β3 adrenergic receptor,β3-AR)拮抗剂(SR59230A)进行阻断实验。结果:姜黄素能够减小脂肪细胞脂滴大小,增加脂肪细胞线粒体数量(P<0.001)。同时,低剂量姜黄素(10、20μmol/L)可减少线粒体ROS产生(P<0.01),提高细胞内ATP含量(P<0.05)。姜黄素干预能上调棕色脂肪标志性基因[β3-AR基因、PPARγ共激活因子-1α(PPARγcoactivator-1α,PGC1α)、解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,Ucp1)]的mRNA表达水平(P<0.05)。而阻断β3-AR则能抑制姜黄素促进白色脂肪细胞棕色化的作用。结论:姜黄素通过β3-AR促进白色脂肪细胞线粒体生物合成并改善其功能,诱导白色脂肪细胞棕色化。

小檗碱通过抑制脂肪酸摄取降低小鼠原代肝细胞脂质沉积

目的观察小檗碱对小鼠原代肝细胞脂质沉积的影响及其是否依赖于磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)通路,探讨小檗碱治疗非酒精性脂肪肝的作用机制。方法用不同浓度白蛋白偶联的油酸(OA)孵育小鼠原代肝细胞,确定OA诱导脂肪变的具体浓度,同时以二甲双胍为阳性对照,给予小檗碱处理24 h,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测确定小檗碱的安全剂量;油红染色定性判断细胞内脂质水平;酶法定量检测细胞内甘油三酯含量;Western blot法检测AMPK以及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)磷酸化水平。AMPK的特异性阻断剂Compound C(CC)孵育原代肝细胞1 h后,再用小檗碱处理细胞24 h,油红染色及甘油三酯检测判断AMPK被抑制时小檗碱对脂质沉积的作用。生化分析仪检测OA组、小檗碱组、鱼藤酮(线粒体复合物I抑制剂)组细胞上清液中脂肪酸的含量,观察细胞对脂肪酸的摄取情况与复合物I抑制之间的关系。结果小檗碱在无细胞毒性的剂量下可明显降低小鼠原代肝细胞中油酸所致脂质沉积。同时,小檗碱可使AMPK及ACC的磷酸化水平增加。此外,在加入CC即AMPK活性被抑制的情况下,小檗碱降低肝细胞脂质沉积的作用不受影响。小檗碱和鱼藤酮分别使肝细胞的油酸摄取减少约31.2%和23.6%。结论小檗碱通过抑制电子传递链线粒体复合物I抑制脂肪酸摄取,进而降低小鼠原代肝细胞脂质沉积,这一作用并不依赖于AMPK通路。

小鼠脂肪源间充质干细胞的培养鉴定及增强绿色荧光蛋白-慢病毒载体转染

目的探索脂肪源间充质干细胞（ADMSCs）的分离培养方法、生长特性及筛选出慢病毒载体感染间充质干细胞的最佳感染指数（MOI），并鉴定其感染后的增殖能力，为ADMSCs移植治疗急性肾小管损伤提供实验依据。方法取4周龄昆明小鼠腹股沟脂肪组织，差速贴壁法培养分离昆明小鼠脂肪源间充质干细胞。经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶，放置体积分数5％CO2孵箱中培养，24h后换液，以后每3d更换培养基，待细胞融合达到约90％时，传代培养。取第3代ADMSCs用流式细胞术（FCM）检测其表型、茜素红染色及油红O染色鉴定其多向分化潜能；用携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体（LV）感染ADMSCs，FCM检测病毒感染效率，四甲基偶氮唑蓝（MTY）比色法检测感染后的细胞活力。结果（1）差速贴壁法培养分离7-11d时细胞融合达80％以上。原代细胞融合达80％～90％进行1：4传代，细胞贴壁和生长速度快于原代细胞培养。第3代及再传代细胞形体趋于一致，细胞呈梭形。细胞连续传代10次，生长速度未见明显减缓；（2）FCM检测第3代细胞CD29阳性表达98．93％，CD34阳性表达0．17％；（3）第3代细胞成脂诱导14d油红O染色阳性，成骨诱导14d茜红染色阳性；（4）当MOI=25感染第3代细胞72h后，共聚焦荧光显微镜观察细胞EGFP阳性表达60％～70％，细胞活力不受影响；（5）MrIT法显示重组慢病毒转染细胞与未转染慢病毒细胞比较，细胞增殖能力无差异。结论从昆明小鼠腹股沟脂肪组织中分离的ADMSCs可在体外稳定传代；差速贴壁法可以简便、高效地提取ADMSCs；携带EGFP的LV可有效感染ADMSCs，并且感染后其增殖能力不受影响。

姜黄素对非酒精性脂肪肝小鼠代谢组学的调控研究

目的探讨姜黄素(CUR)对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的代谢调节作用。方法小鼠适应性饲养3 d后,随机分为3组:对照(C)组、高脂饮食模型(HFD)组、CUR(50 mg/kg)组。C组饲喂普通饲料,HFD和CUR组饲喂高脂饲料,CUR同时ig给药10周,C组和HFD组ig给予0.5%CMC-Na溶液,给药体积均为10 mL/kg。给药结束后,取血和肝脏,肝组织切片后进行HE染色和油红O染色,光学显微镜观察病理变化;采用基于气相色谱-质谱联用(GC/MS)的代谢组学方法检测血清和肝脏组织样品,数据通过Simca-P13.0及Metaboanalysis网络工具进行分析,找出代谢组变化趋势和相关差异化合物。此外,制备小鼠肝原代细胞,棕榈酸(PA)100 mmol/L诱导细胞NAFLD体外模型,观察CUR(10μmol/L)对代谢组变化的影响。结果油红O染色结果显示,HFD小鼠肝脏组织存在大量红染油滴,CUR组小鼠肝脏组织中的脂质油滴明显减少。HE染色分析显示,与C组比较,HFD组小鼠肝脏组织有空泡状,CUR组小鼠肝脏组织与C组比较没有明显区别。对血清样和肝组织样品的GC-MS数据进行PLS-DA分析发现C组与HFD组偏离较远,而CUR组与HFD组相比出现向C组偏移的趋势,进一步S-plot分析发现影响较大的代谢为胆固醇的合成、酮体的生成以及氨基酸代谢,细胞实验得到了类似的结果;经通路MetPA分析和代谢产物富集,血清和细胞中各组间差异化合物代谢主要集中在氨基酸代谢,肝脏中代谢差异主要集中在氨基酸代谢和部分脂质代谢通路;进一步进行差异代谢物的筛选,HFD组生糖氨基酸和生酮氨基酸较对照组均有不同程度的升高,CUR能够降低这些氨基酸的水平。结论高脂饮食会造成小鼠三大代谢的异常,姜黄素能够一定程度上改善小鼠代谢紊乱。

敲除Usp13促进棕榈酸诱导的小鼠肝实质细胞凋亡

目的:研究去泛素化酶Usp13对棕榈酸诱导的肝实质细胞凋亡的影响,并对其机制进行初步探究。方法:两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝实质细胞并采用棕榈酸处理;甘油三酯酶法及油红O染色检测肝实质细胞中脂质的累积;MTS和LDH试剂盒检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;qPCR检测凋亡相关基因的表达以及免疫印迹法检测Caspase-3的活化。结果:敲除Usp13基因并不影响棕榈酸诱导下肝实质细胞的甘油三酯累积,但导致细胞损伤加重,凋亡增加。机制研究显示,敲除Usp13促使肝实质细胞中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl表达下调,促凋亡基因Bid、p53表达上调,以及Caspase-3活化增强。结论:初步揭示了Usp13调控棕榈酸诱导下肝实质细胞凋亡的机制,为深入研究Usp13调控非酒精性脂肪性肝炎的发生、发展奠定了基础。