三种小鼠眼球组织石蜡切片固定液固定效果的比较

背景:固定液是影响病理制片质量的重要因素,为了优化眼球组织病理学观察的条件,需要相对简便、实用和可靠的固定液。目的:比较3种固定液对小鼠眼球组织石蜡切片的影响,优化小鼠眼球组织石蜡切片的固定方法。方法:取30只BALB/c小鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)眼球,随机分为3组,每组10只,分别固定于3种固定液中,即甲醛-戊二醛混合固定液、Davidson固定液和体积分数10%甲醛固定液,24 h后制作标本并进行苏木精-伊红染色,分析比较固定效果。动物实验获得山东省立第三医院伦理委员会批准,批准号:sdsldsyy-m-201801006。结果与结论:①各组大部分眼球大体标本均略有收缩变形;②苏木精-伊红染色显示,甲醛-戊二醛组眼球壁出现皱缩,晶状体结构较完整、清晰,中央区无破碎,细胞排列整齐有序;角膜成纤维细胞间出现较大空隙;视网膜组织明显脱落分离,各层细胞不清晰,细胞间可见明显空白裂隙;③苏木精-伊红染色显示,Davidson组视网膜轻微变薄,分层排列较平整,未见明显缺失,无明显脱落,各层细胞排列紧密整齐,细胞核各层核膜清晰,细胞无收缩、膨胀;角膜各层结构完整,无明显结构改变,未见脱片现象,各层结构清晰、无裂隙;晶状体结构中央区可见不同程度破碎、脱片、染色不连续;④苏木精-伊红染色显示,甲醛组角膜组织轻微收缩,角膜上皮各层结构较整齐、层次较分明,晶状体和视网膜结构基本完整,但晶状体组织皱缩破裂、空隙形成,细胞排列乱序,可见视网膜组织脱落,各层排列较平整,细胞结构基本清晰,细胞间可见明显空白裂隙;⑤结果表明对于苏木精-伊红染色,Davidson固定液对角膜和视网膜的固定效果较为理想,而甲醛-戊二酸混合固定液是固定小鼠眼球晶状体组织的较好方法。

小鼠视网膜组织石蜡切片制作方法的探讨

目的寻找一种效果好的视网膜固定方法。方法30只小鼠取出眼球后在角巩膜缘刺一小口,A组24只眼球,用体积分数10%中性甲醛固定;B组16只眼球,用FAA固定液(体积分数10%中性甲醛10mL、体积分数95%乙醇85mL、冰醋酸5mL混合)固定;C组20只眼球,置于FAA固定液中浸泡1min后用体积分数10%中性甲醛固定过夜,脱水后去除角膜、虹膜和晶状体,分别做HE染色和免疫组织化学染色,镜下观察其差异。结果大体观察A组大部分眼球皱缩变形,视网膜脱离率高;B组、C组眼球形态均无明显变化,无视网膜脱离发生。HE染色示A组标本视网膜结构疏松,有较多裂隙,且易发生视网膜碎裂;B组标本视网膜过度压缩,视网膜各层结构不清晰;C组标本视网膜结构清晰,细胞排列紧密,色泽艳丽。免疫组织化学染色3组均显示神经元特异性烯醇化酶NSE阳性,但C组标本染色效果优于A组、B组,且脱片程度低,适用于视网膜组织的固定。结论采用FAA先浸泡再用体积分数10%中性甲醛固定视网膜组织的效果优于单独使用体积分数10%中性甲醛和FAA固定液。

小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨

目的探讨一种简单且易于规范操作的小鼠血管灌注造影视网膜铺片技术。方法30只生后12～17d龄C57BL/6J小鼠麻醉后行20g.L-1伊文蓝上腔静脉灌注,5min后处死,摘取双眼眼球,40g.L-1多聚甲醛固定,A组20只眼球固定10min,B组20只眼球固定20min,C组20只眼球固定40min,手术显微镜下去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体及巩膜,并将视网膜平铺于载玻片上,荧光显微镜下照相,观察各组差异。结果大体观察:A组视网膜变大、变薄、变形,视网膜面积明显扩大;B组视网膜无变形,保持原有的形态;C组视网膜黏附黑色视网膜色素上皮层,不易分离。荧光显微镜下照相观察:A组铺片成功率为30%,视网膜血管变形,模糊不清;B组铺片成功率为90%,视网膜血管均匀规则分布;C组铺片成功率为30%,黑色视网膜色素上皮层部分黏附,血管背景成像不均匀。结论良好的规范操作技巧和恰当的多聚甲醛固定时间是保证小鼠血管灌注造影视网膜铺片成功的关键。

3种小鼠晶状体组织石蜡切片固定液的比较

目的比较3种固定液对小鼠晶状体组织石蜡切片的影响,优化小鼠晶状体组织石蜡切片固定方法。方法选取3种常用固定液(改良Davison’s固定液、传统Davison’s固定液和10%中性甲醛固定液),固定小鼠晶状体组织,并制成石蜡切片,经HE染色后在显微镜下观察。结果传统Davison’s固定液固定的晶状体组织切片无碎裂,改良Davison’s固定液固定的晶状体组织中央区碎裂。改良Davison’s固定液和传统Davison’s固定液固定的小鼠眼球外形均无明显变形和收缩,未见明显的视网膜脱离,镜下视网膜组织结构完整清晰,各层细胞排列紧密,无明显裂隙,染色鲜艳。采用10%中性甲醛固定液固定的小鼠眼球壁组织发生严重皱缩,晶状体组织皱缩,空隙和空泡形成。结论传统Davison’s固定液固定的小鼠眼球晶状体组织石蜡切片质量效果优于改良Davison’s固定液和10%中性甲醛固定液。

不同方法制作小鼠视网膜组织石蜡切片的比较

目的探索一种具有较小组织变形与良好定位效果的小鼠视网膜固定方法。方法 BALB/C小鼠30只,随机分为3组,每组10只,处死后取眼球。A组在体积分数分别为55%、75%、95%乙醇中各脱水1h,然后于解剖显微镜下去除角膜、虹膜、晶状体,再于无水乙醇中各脱水2次,每次1h;B组脱水步骤同A组但不去除角膜、虹膜、晶状体;C组在体积分数分别为55%、65%、75%、85%、95%乙醇中各脱水30min,同A组去除角膜、虹膜、晶状体,再于无水乙醇中各脱水2次,每次30min,其余步骤相同。各组切片染色后于光镜下比较各组视网膜结构的完整性,并统计视网膜脱离发生率。结果 B组外核层局部断裂,IS/OS层出现广泛的分离;剔除晶状体的A组外核层保持完整,但IS/OS层仍存在局部的断裂;而剔除晶状体且缩短脱水时间的C组则可保持完整的小鼠视网膜结构,且染色鲜艳,层次分明。RPE层脱落即视网膜脱离情况显示:A组视网膜脱离率为70%,主要发生在周边1/2处;B组视网膜脱离率65%,脱离位置不固定且发生不同程度的碎裂、断裂;C组视网膜脱离率10%,主要发生在周边1/4处。结论 在小鼠眼球制片时切除晶状体与增加酒精浓度梯度缩短脱水时间可有效减少视网膜组织变形,更有助于视网膜的精确定位。

小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术的探讨

目的探讨一种简便、易操作的小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术。方法 30只C57BL/6J成年小鼠行40g.L-1多聚甲醛心脏灌注固定,摘取眼球,剥离视网膜,随机分为3组:A组20个视网膜直接置于3g.L-1TritonX-100中4℃孵育1h;B组20个视网膜先置入甲醇冰上固定30min,再置于3g.L-1TritonX-100中4℃孵育1h;C组20个视网膜先置入甲醇冰上固定30min,再置于3g.L-1TritonX-100中4℃孵育过夜。各组分别行α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色,荧光显微镜下照相,观察其差异。结果荧光显微镜下观察,A组视网膜血管荧光微弱,血管模糊不清;B组视网膜可见荧光,血管分枝清晰可见,但荧光较弱;C组视网膜荧光强亮,α-平滑肌肌动蛋白特异性表达在血管内皮细胞及周细胞的胞膜上,荧光呈空泡状,背景染色轻。结论视网膜铺片免疫荧光染色是一种较好的、简便易行的视网膜组织形态学观察方法,实验过程中甲醇脱脂处理和足够的TritonX-100浸泡是保证染色成功的关键。