m6A甲基化对邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯诱导小鼠睾丸间质细胞自噬的作用

目的 探讨邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]致小鼠睾丸间质(TM-3)细胞自噬中m6A甲基化的作用。方法 将对数生长期的TM-3细胞暴露于浓度梯度(0、5、10、20、40、80μmol·L^(-1))的m6A甲基化抑制剂3-脱氮腺苷(3-Deazaadenosine,DAA)24 h,CCK-8法检测细胞活力,确定3-脱氮腺苷的染毒剂量后,梯度稀释为对照组(0μmol·L^(-1))、MEHP低剂量组(200μmol·L^(-1))、MEHP中剂量组(400μmol·L^(-1))、MEHP高剂量组(800μmol·L^(-1)),将TM-3细胞分别暴露于0、200、400、800μmol·L^(-1)MEHP,40μmol·L^(-1)DAA+400μmol·L^(-1)MEHP和40μmol·L^(-1)DAA染毒组24 h,光镜下观察TM-3细胞形态。CCK-8法检测细胞存活率;m6A RNA甲基化定量检测试剂盒检测m6A修饰水平;丹酰尸胺(MDC)荧光染色检测自噬形成情况;Western blot检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的蛋白表达水平。结果 与对照组相比,DAA浓度为5、10、20、40μmol·L^(-1)时,细胞活力均无明显变化(P均>0.05);DAA浓度为80μmol·L^(-1)时,细胞活力下降(P<0.01);各MEHP染毒组TM-3细胞活力和m6A甲基化水平均降低(P均<0.01),细胞空隙变大,圆形细胞增多,贴壁细胞的数量明显减少;DAA组m6A甲基化水平较对照组降低(P<0.01);与MEHP中剂量组相比,DAA+MEHP组细胞活力和m6A甲基化水平均下降(P均<0.01),细胞发生皱缩,细胞间隔稍有增大。与对照组相比,各MEHP染毒组、DAA+MEHP组和DAA处理组LC3-Ⅱ的蛋白表达水平均升高(P均<0.05),MEHP低剂量组MDC荧光信号强度、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的蛋白表达量均无明显变化(P均>0.05);MEHP中、高剂量组和DAA+MEHP组荧光强度、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表达量均升高(P均<0.01);DAA组荧光强度和Beclin-1的表达水平均升高(P均<0.01),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ无明显变化(P均>0.05)。DAA+MEHP组荧光强度和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较MEHP中剂量组呈上升趋势(P<0.05)。结论 MEHP可能通过降低RNA甲基化m6A修饰的水平来诱导TM-3细胞发生自噬。

普罗布考对H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞内氧化应激和细胞凋亡的影响

目的探究普罗布考对过氧化氢(H_(2)O_(2))介导的小鼠睾丸间质细胞系(TM3)损伤的影响。方法体外培养TM3细胞,分为3组:对照组、H_(2)O_(2)损伤模型组和普罗布考处理组。CCK8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,活性氧(ROS)检测试剂盒检测细胞内ROS水平,ELISA测定细胞上清睾酮水平,实时荧光定量PCR检测细胞内睾酮合成酶类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)和17β-羟基类固醇脱氢酶(HSD-17β)、细胞凋亡指标Bax、Caspase3和氧化应激相关指标核因子E2相关因子2(NRF2)、血红素加氧酶-1(HO-1)的mRNA水平,Western blot检测细胞内Bax和Caspase3蛋白表达改变。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)损伤模型组细胞存活率显著降低、凋亡率显著升高(P<0.05),Bax和Caspase3表达显著上调(P<0.05),细胞内ROS水平显著升高、NRF2和HO-1水平显著降低(P<0.05),睾酮分泌量和睾酮合成酶表达显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)损伤模型组比较,普罗布考处理组细胞存活率显著升高、凋亡率显著下降(P<0.05),Bax和Caspase3表达显著下调(P<0.05),细胞内ROS水平显著下降、NRF2和HO-1水平显著升高(P<0.05),睾酮分泌量和睾酮合成酶表达增高(P<0.05)。结论普罗布考可以减轻H_(2)O_(2)诱导的TM3细胞凋亡和睾酮合成异常,这种保护作用可能与普罗布考的抗氧化和抗凋亡效应有关。

MEHP抑制小鼠睾丸间质细胞脂噬对睾酮合成的影响

目的探讨邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]对小鼠睾丸间质细胞(TM-3)脂噬水平以及对睾酮合成的影响。方法将对数生长期的TM-3细胞分别暴露于0、200、400、800μmol·L^(-1)的MEHP中,分别为对照组、MEHP低剂量组、MEHP中剂量组、MEHP高剂量组。油红O染色及流式细胞术检测细胞脂滴水平,免疫荧光共定位检测细胞脂噬水平,游离胆固醇检测试剂盒检测细胞中游离胆固醇含量,ELISA检测上清液中的睾酮水平,Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、SIRT1、FOXO1、Rab7的蛋白表达水平。结果与对照组相比,MEHP低剂量组脂滴含量、睾酮含量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62蛋白表达水平均无明显变化(P均>0.05);MEHP中、高剂量组脂滴含量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62均升高(P均<0.05),游离胆固醇含量和睾酮的含量均降低(P均<0.01)。与对照组相比,MEHP低、中、高剂量组TM-3细胞SIRT1、FOXO1、Rab7蛋白表达水平均下降(P均<0.05)。结论MEHP可能通过SIRT1/FOXO1/Rab7信号通路抑制小鼠睾丸间质细胞脂噬,从而减少睾酮含量。

白藜芦醇通过沉默调节蛋白1-解偶联蛋白2信号通路降低小鼠睾丸间质细胞TM3的氧化损伤

本试验旨在研究白藜芦醇(RES)对氧化损伤小鼠睾丸间质细胞TM3的保护作用,并探索其可能的作用机制。首先,用不同浓度(0、150、200、250、300μmol/L)的过氧化氢(H2O2)处理小鼠睾丸间质细胞TM3 8 h,确定建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度;然后,用不同浓度(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)的RES分别处理正常细胞24 h,确定RES安全浓度;最后,用安全浓度的RES处理氧化损伤细胞24 h。在整个培养过程中采用i CELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测细胞的增殖情况;待安全浓度的RES处理氧化损伤细胞结束后采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)的含量,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blotting)法分别检测沉默调节蛋白1(SIRT1)/解偶联蛋白2(UCP2)信号通路中关键因子SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量。结果表明:1)用浓度为150μmol/L及以上的H2O2处理细胞8 h后,极显著降低细胞存活率(P<0.01),因此确定150μmol/L为建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度。2)用10.0μmol/L及以下浓度的RES处理正常细胞24 h后,细胞存活率均无显著变化(P>0.05);用2.5、5.0和10.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞存活率均显著提高(P<0.05),且各浓度RES组间无显著差异(P>0.05)。因此,选用5.0μmol/L为RES的安全浓度。3)用5.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞中ROS的含量极显著降低(P<0.01);细胞中SIRT1 mRNA和蛋白质的相对表达量极显著增加(P<0.01),而UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量则显著或极显著降低(P<0.01或P<0.05)。由此可见,适宜浓度的RES可激活SIRT1同时抑制UCP2的表达,UCP2通过负反馈调节方式减少细胞内ROS的生成,从而在一定程度上抑制TM 3细胞的氧化损伤。

二甲双胍对H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

目的探讨二甲双胍对H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞损伤的作用。方法将TM3小鼠睾丸间质细胞随机分为4组,分别为正常对照组、二甲双胍组、H_(2)O_(2)模型组以及H_(2)O_(2)+二甲双胍组。各组细胞培养24 h后,利用CCK-8法检测细胞存活率,ELISA检测TM3细胞睾酮的分泌情况,实时定量PCR检测睾酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD的mRNA表达情况,采用比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量,Western blot检测TM3细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达情况。结果与正常对照组相比,H_(2)O_(2)模型组TM3细胞的睾酮水平显著降低,睾酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表达水平显著降低,细胞内SOD和CAT活性显著降低,细胞存活率亦显著降低(P均<0.05),MDA含量及Cleaved-caspase3表达水平显著升高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)模型组相比,H_(2)O_(2)+二甲双胍组TM3细胞的睾酮水平显著升高,睾酮合成酶的mRNA表达水平显著升高,SOD和CAT活性显著升高,细胞存活率显著提高(P均<0.05),MDA含量及Cleaved-caspase3表达水平显著降低(P<0.05)。结论二甲双胍可减轻H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞功能损伤。

菟丝子黄酮对BPA致小鼠睾丸间质细胞分泌雄性激素异常的保护作用

为研究菟丝子黄酮对双酚A(BPA)干扰小鼠睾丸间质细胞激素分泌的缓解作用,以TM3小鼠睾丸间质细胞为对象,采用1μg/mL～500μg/mL的菟丝子黄酮与TM3(小鼠睾丸间质细胞)细胞共同培养24 h,以MTT法检测细胞增殖,确定菟丝子黄酮对TM3细胞的安全剂量。然后采用1μmol/mL～200μmol/mL的双酚A干扰TM3细胞24 h,以MTT法检测细胞增殖,通过TM3细胞的相对存活率,确定BPA最适染毒剂量;最后先用菟丝子黄酮和TM3细胞共同培养4 h后,再用BPA干扰TM3细胞24 h。通过ELISA检测细胞上清液睾酮(T)和黄体生成素(LH)的含量,并分析菟丝子黄酮对BPA干扰小鼠睾丸间质细胞激素分泌的缓解作用。结果表明,250μg/mL～400μg/mL的菟丝子黄酮(等差法)对TM3细胞作用24 h后,有极显著的增殖效果(P<0.01);80μmol/mL的BPA对TM3细胞作用24 h后,细胞存活率为81%,可作为最适染毒剂量;菟丝子黄酮保护4 h后,再用BPA干扰12 h、24 h后,不同浓度的菟丝子黄酮可显著升高TM3细胞睾酮和黄体生成素的水平(P<0.05)。说明菟丝子黄酮对BPA致小鼠睾丸间质细胞睾酮和黄体生成素的分泌异常具有明显的保护作用。

Sox30基因敲除致小鼠睾丸间质细胞增殖异常的研究

目的探讨Sox30基因敲除对小鼠睾丸间质细胞增殖的影响。方法采用HE染色法观察10周龄Sox30基因野生型(Sox30^(+/+))、杂合型(Sox30^(-/+))及纯合缺失型(Sox30^(-/-))小鼠睾丸组织病理形态;采用免疫组化技术检测睾丸组织中间质细胞特异性表达蛋白3β-HSD的表达水平;采用慢病毒感染及siRNA干扰技术构建Sox30基因过表达及敲低TM3细胞模型,并在此细胞模型基础上分别采用CCK-8法、流式细胞术、RT-qPCR法以及Western blot法检测细胞存活率、细胞周期分布及周期相关基因的mRNA及蛋白表达水平。采用JASPAR数据库预测Sox30与周期相关基因的启动子区结合位点。结果与Sox30^(+/+)和Sox30^(-/+)小鼠比较,HE染色结果显示Sox30^(-/-)小鼠睾丸组织中间质细胞显著增生,同时免疫组化染色发现表达3β-HSD的间质细胞增多。与Vector组相比,Sox30组TM3细胞存活率降低(P<0.05),G1期细胞周期阻滞(P<0.05),同时细胞周期相关基因CyclinD1、Cdk2等mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与Sox30-NC组比较,siSox30-3组TM3细胞存活率增加(P<0.05),G1期细胞周期阻滞恢复(P<0.05),同时细胞周期相关基因CyclinD1、Cdk2等mRNA和蛋白表达水平显著恢复(P<0.05)。JASPAR预测发现CyclinD1、Cdk2的启动子区域均存在Sox30蛋白质可能的结合位点。结论Sox30基因敲除可导致小鼠间质细胞增殖异常,CyclinD1和Cdk2可能是Sox30调控细胞周期的重要靶基因。

弓形虫感染对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及机制研究

为探究弓形虫RH株速殖子体外感染对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响,构建了弓形虫与小鼠睾丸间质细胞共培养试验模型。将纯化后的弓形虫虫体与细胞按照0∶1、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例共培养6 h,筛选最佳的弓形虫和细胞共培养比例。在弓形虫与细胞比例为20∶1条件下,共培养3 h、6 h、9 h和12 h,筛选最佳共培养时间。同时,使用瑞氏-吉姆萨染色液对细胞进行染色,观察共培养情况下细胞状态。培养结束,ELISA检测细胞上清的睾酮浓度,Western blot检测细胞内睾酮分泌相关蛋白StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的表达水平。结果表明,弓形虫与细胞共培养6 h,当弓形虫与细胞比例高于5∶1时,睾酮分泌量显著增加(P<0.05)。弓形虫与细胞比例为20∶1时,睾酮分泌量随培养时间的延长而增加,且感染组明显高于对照组(P<0.05)。染色结果发现,弓形虫1 h内即可进入MLTC-1细胞,12 h细胞内出现大量空泡,60 h左右细胞大量破裂。Western blot结果显示,共培养12 h时,感染组CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的蛋白表达量较对照组显著降低(P<0.05)。说明弓形虫可在短时间内进入MLTC-1细胞并通过影响类固醇激素合成酶的表达来刺激睾酮的分泌,但随着时间的延长,弓形虫会抑制相关酶的表达,抑制细胞的正常功能。

邻苯二甲酸单己酯和邻苯二甲酸单丁酯联合染毒对小鼠睾丸间质细胞氧化应激的影响

目的探讨邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯(mono 2-ethylhexyl phthalate,MEHP)和邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)联合染毒致体外培养的小鼠睾丸间质细胞(TM3)的氧化应激损伤。方法用浓度为0(对照组)、1、10、100、500、1000μmol·L^(-1)不同浓度梯度的MEHP和MBP作用于小鼠睾丸间质细胞48h后,以MTT法测定细胞活力,比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。结果 MEHP和MBP联合染毒对TM3细胞抑制率升高,增殖抑制存在交互作用,表现为协同作用;对细胞内的SOD水平和MDA水平的影响存在交互作用,使细胞内的SOD活性降低,呈现协同作用,使细胞内的MDA水平升高,呈现协同作用。荧光倒置电镜结果显示,高剂量染毒可见大部分细胞死亡,剩余细胞肿胀堆积、变暗,间隙更大。结论 MEHP和MBP联合染毒对小鼠睾丸间质细胞的增殖有抑制作用,并诱导小鼠睾丸间质细胞发生氧化应激反应,表现为脂质过氧化水平的增高,同时伴有抗氧化水平的降低。

二甲双胍对小鼠睾丸间质细胞的体外抑制作用及其机制研究

目的探讨二甲双胍在小鼠睾丸发育中的作用及其分子机制。方法不同浓度二甲双胍作用于小鼠睾丸间质细胞(TM3),采用MTT法、Annexin V-FITC/PI法及流式细胞术检测二甲双胍对TM3细胞增殖、凋亡及周期的影响。采用real-time PCR检测细胞周期关键调节蛋白cyclin B1和cyclin D1的变化,Western Blot分析二甲双胍抑制TM3细胞增殖中AMPK蛋白的变化。结果 MTT结果显示二甲双胍可显著抑制TM3细胞的体外增殖能力;Annexin V-FITC/PI染色法显示二甲双胍未诱导该细胞发生凋亡;流式细胞术检测发现二甲双胍可诱导TM3细胞周期阻滞在G2/M期;real-time PCR显示二甲双胍可下调cyclinB1和cyclin D1 m RNA的表达;Western Blot显示二甲双胍显著增加TM3细胞中AMPK在Thr172位点的磷酸化水平。结论二甲双胍显著抑制TM3细胞的体外增殖并通过诱导TM3细胞周期阻滞在G2/M期,激活AMPK信号通路,发挥其对TM3细胞的体外抑制作用。

实时无标记细胞分析系统与台盼蓝染色法分析双酚A对小鼠睾丸间质细胞毒性作用的比较

目的分析实时无标记细胞分析系统与台盼蓝染色法分析双酚A(BPA)对小鼠睾丸间质细胞毒性作用,以确定最佳实验方案。方法采用实时无标记细胞分析系统及台盼蓝染色法测定BPA对小鼠睾丸间质细胞的细胞毒性,计算其IC_(50)。结果实时无标记细胞分析法及台盼蓝染色法结果表明,不同浓度BPA使小鼠睾丸间质细胞的活力下降,1 000μmol/L时下降最为明显,IC_(50)分别为704、745μmol/L。但实时无标记系统能够实时监测细胞生长的动态生物学反应。结论实时无标记分析法能够更直观、准确地观察细胞生长情况,弥补台盼蓝染色法的缺点,是一种新的研究细胞毒性的实验方法。

基于PINK1/Parkin信号通路研究MEHP对小鼠睾丸间质细胞线粒体自噬的影响

目的 探讨邻苯二甲酸单乙基己基酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]对小鼠睾丸间质(TM-3)细胞线粒体自噬的影响。方法 将对数生长期的TM-3细胞分别暴露于自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)(0、0.25、0.5、1.0、1.25、1.5 mmol·L^(-1))24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力,确定后续3-MA干预组染毒剂量;培养TM-3细胞,设置对照组、MEHP低、中、高剂量组(200、400、800μmol·L^(-1))和抑制剂组(MEHP中剂量+3-MA 1.0 mmol·L^(-1))。化学发光法检测细胞腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平;荧光探针JC-1法检测细胞线粒体膜电位(MMP)水平;免疫印迹法(Western blot)检测抗增殖蛋白2(PHB2)、同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)、帕金森蛋白(Parkin)、P-Parkin蛋白表达水平。结果 与对照组相比,3-MA浓度为1.0 mmol·L^(-1)时,细胞存活率为(99.56±2.51)%(P>0.05),确定抑制剂组3-MA干预浓度为1.0 mmol·L^(-1)。与对照组相比,MEHP中剂量组细胞存活率降低,各染毒组TM-3细胞ATP水平均下降(P均<0.05),中、高剂量组TM-3细胞MMP水平、Parkin蛋白表达水平均下降(P均<0.05),各染毒组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白表达均增高(P均<0.05);与低剂量组相比,高剂量组TM-3细胞的ATP水平下降(P<0.05),中、高剂量组TM-3细胞线粒体膜电位水平下降,PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升(P均<0.05),Parkin蛋白相对表达水平下降(P均<0.05);与中剂量组相比,抑制剂组细胞存活率降低(P<0.05),高剂量组、抑制剂组细胞ATP水平、线粒体膜电位水平均降低(P均<0.05),高剂量组TM-3细胞中PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升(P均<0.05),Parkin蛋白相对表达水平下降(P<0.05);抑制剂组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白的相对表达水平均低于中剂量组(P均<0.05),Parkin蛋白的表达水平高于中剂量组(P<0.05)。结论 MEHP可通过激活PINK1/Parkin信号通路来诱导TM-3细胞线粒体自噬。

DNA甲基化对邻苯二甲酸单乙基己酯致小鼠睾丸间质细胞损伤的作用

目的探讨邻苯二甲酸单乙基己酯[mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]染毒对小鼠睾丸间质细胞(TM-3)DNA甲基化和凋亡水平的影响。方法体外培养小鼠睾丸间质细胞至对数生长期,预实验毒物浓度梯度设为0、50、100、200、400、800μmol·L^(-1),24 h染毒后,采用CCK-8法检测细胞活性,采用Graphpad prism 6.0计算细胞半数抑制剂量(IC50),并最终确定染毒剂量为0(对照组)、200、400、800μmol·L^(-1);光镜观察细胞形态学变化,采用5-甲基胞嘧啶抗体(5-methylcytosine,5-mc)免疫荧光法检测细胞总甲基化水平;采用RT-PCR检测甲基转移酶(DNMTs)中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达水平;采用Hoechst荧光染色检测细胞凋亡水平。结果CCK-8结果显示:随着染毒剂量的增加,细胞存活率逐渐下降(P<0.05);光镜观察显示:正常细胞呈梭形、多边形等不规则形状生长,随着染毒剂量的增加,贴壁细胞数量逐渐减少,细胞核呈现空泡化,条索状细胞增多,且漂浮的死亡细胞数逐渐增加;5-mc免疫荧光结果显示:与对照组相比,200μmol·L^(-1)组荧光信号最强,400μmol·L^(-1)组次之,800μmol·L^(-1)组最弱(P均<0.01),不同浓度MEHP暴露,均可引起TM-3细胞总甲基化水平降低(P均<0.01);RT-PCR结果显示:与对照组相比,200μmol·L^(-1)组DNMT1 mRNA(1.15±0.08)、DNMT3B mRNA(2.28±0.15)相对表达水平高于对照组(P<0.05或<0.01);400μmol·L^(-1)组DNMT1 mRNA(0.83±0.05)低于对照组(P<0.01),DNMT3A mRNA(1.91±0.44)和DNMT3B mRNA(2.50±0.09)表达水平高于对照组(P<0.05或<0.01);800μmol·L^(-1)组DNMT1 mRNA(0.50±0.08)低于对照组,DNMT3A mRNA(2.40±0.51)高于对照组(P<0.01);Hoechst33258荧光染色显示:与对照组相比,不同浓度MEHP暴露,均可诱导TM-3细胞凋亡(P均<0.01);400、800μmol·L^(-1)两组可以观察到明显的染色质固缩,核浓染现象,凋亡细胞数目逐渐增多。结论MEHP可引起TM-3细胞发生异常的甲基化修饰,进而导致细胞凋亡。

p38/JNK MAPK信号通路对MEHP致小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响

目的探讨p38/c-Jun氨基末端激酶(JNK)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]致小鼠睾丸间质(TM-3)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法将对数生长期的TM-3细胞分别暴露于p38抑制剂SB203580(5、10、20、40μmol·L^(-1))、JNK抑制剂SP600125(2.5、5、10、20μmol·L^(-1))24 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,确定后续SB203580及SP600125干预组染毒剂量;将TM-3细胞分别暴露于0、200、400、800μmol·L^(-1) MEHP、10μmol·L^(-1) SB203580+400μmol·L^(-1) MEHP和10μmol·L^(-1) SP600125+400μmol·L^(-1) MEHP溶液24 h后,光镜下观察细胞形态;CCK-8法检测细胞活性;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况;荧光探针DCFH-DA法检测细胞活性氧(ROS)水平;免疫印迹法(Western blot)检测细胞p38、p-p38、JNK、p-JNK、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平。结果与对照组相比,200、400、800μmol·L^(-1) MEHP剂量组ROS水平、凋亡率均升高(P均<0.05),细胞内p38和JNK蛋白表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05),蛋白p-p38、p-JNK、Caspase-9和Caspase-3表达均增高(P均<0.05),且随着MEHP染毒剂量的升高,增高越明显(P均<0.05)。与400μmol·L^(-1) MEHP剂量组相比,SB203580干预组和SP600125干预组贴壁细胞数量增多,细胞间隙减小,细胞增殖率上升,细胞凋亡率和ROS水平均降低(P均<0.05),p38和JNK蛋白表达差异均无统计学意义(P均>0.05),p-p38、p-JNK、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达均减少(P均<0.05)。结论MEHP可通过激活p38/JNK MAPK信号通路诱导TM-3细胞凋亡。

亚硒酸钠与纳米硒对镉致小鼠睾丸间质细胞毒性的干预作用

目的 比较亚硒酸钠(Se)和纳米硒(Nano-Se)对镉(Cd)致小鼠睾丸间质细胞毒性的干预作用。方法将小鼠睾丸间质细胞分成四组,分别是对照组、镉染毒组(Cd20μmol/L)、硒+镉染毒组(Se+Cd)、纳米硒+镉染毒组(Nano-Se+Cd),每组至少3个样本,重复3次以上。CCK-8检测细胞活性,Hoechst染色检测细胞凋亡形态变化,流式细胞仪分析细胞凋亡率,Westernblot测定蛋白的相对表达含量。结果 与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组细胞活性明显上升(P<0.01);当Se和Nano-Se的浓度达20μmol/L时,Se组和Nano-Se组细胞活性最高(P<0.01),且Nano-Se与相同浓度的Se比较,Nano-Se组的细胞活性较高(P<0.01)。细胞形态观察发现,Cd染毒组细胞皱缩变圆,体积变小,细胞间距变大,荧光染色细胞核染色较多;与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组生长形态较好,荧光染色细胞核染色较少,Nano-Se组比Se组生长情况更佳。Cd染毒组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01),而与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组细胞凋亡率明显降低(P<0.01);且与Se组比较,Nano-Se组细胞凋亡率更低(P<0.01)。与对照组比较,Cd染毒组TM3细胞Bax/Bcl-2比值明显增大(P<0.01);与Se组比较,Nano-Se组的Bax/Bcl-2比值更低(P<0.05)。结论 Nano-Se与Se比较对Cd致TM3细胞毒性干预作用更好,可能与Nano-Se能更好抑制镉引起的TM3细胞凋亡有关。

活性氧在氯化镉诱导的小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用

目的探究活性氧(reactive oxygen species,ROS)在氯化镉(cadmium chloride,CdCl_(2))诱导的睾丸间质细胞毒性中的潜在作用及机制。方法以不同浓度CdCl_(2)(0、5和10μmol/L)染毒小鼠睾丸间质TM3细胞24 h。CCK-8法检测CdCl_(2)对TM3细胞活性的影响;Hoechst33342染色法检测凋亡小体;DCFH-DA探针法检测TM3细胞ROS水平;1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预处理1 h后用10μmol/L CdCl_(2)染毒TM3细胞24 h,Western blot检测细胞内促凋亡蛋白Caspase-9和cleaved Caspase-3的表达水平;RT-qPCR检测细胞内抗凋亡基因Bcl-2以及促凋亡基因Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达水平。结果CdCl_(2)染毒细胞24 h后,TM3细胞活力降低且凋亡小体数量增加。10μmol/L CdCl_(2)染毒组细胞Caspase-9蛋白表达水平为0.86±0.10,较对照组(0.56±0.07)升高(P<0.05);5和10μmol/L CdCl_(2)染毒组细胞cleaved Caspase-3蛋白表达水平分别为0.65±0.03和1.05±0.13,较对照组(0.37±0.11)升高(P<0.05);5和10μmol/L CdCl_(2)染毒组细胞内ROS含量分别为60.47±1.39和80.63±1.34,亦较对照组(46.80±1.24)增加(P<0.05)。与镉染毒组相比,NAC抑制了Caspase-9(CdCl_(2)组:0.89±0.07;CdCl_(2)+NAC组:0.28±0.02)和cleaved Caspase-3(CdCl_(2)组:1.53±0.21;CdCl_(2)+NAC组:0.66±0.07)蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);同时CdCl_(2)+NAC组ROS水平(62.64±0.93)也较CdCl_(2)染毒组(80.13±0.94)降低(P<0.05)。5和10μmol/L CdCl_(2)染毒组细胞Caspase-9 mRNA水平与对照组(0.97±0.10)相比分别升高为1.40±0.14和1.90±0.12(P<0.05),cleaved Caspase-3 mRNA水平与对照组(0.88±0.08)相比分别升高为1.42±0.11和1.59±0.12(P<0.05),但Bcl-2 mRNA水平与对照组(0.94±0.02)相比分别降低为0.60±0.02和0.50±0.09(P<0.05)。与镉染毒组相比(0.57±0.06),CdCl_(2)+NAC组镉诱导的Bcl-2 mRNA表达水平显著改善(0.92±0.03),Caspase-9(CdCl_(2)组:1.96±0.07;CdCl_(2)+NAC组:1.04±0.02)和Caspase-3(CdCl_(2)组:1.65±0.02;CdCl_(2)+NAC组:0.66±0.04)的表达水平降低(P<0.05)。结论小鼠睾丸间质细胞TM3中的Caspase级联反应可被CdCl_(2)诱导的过量ROS激活,抑制ROS可显著降低CdCl_(2)诱导的TM3细胞凋亡。

不同温补肾阳中药有效成分对TM3小鼠睾丸间质细胞生长抑制作用比较研究

目的比较不同温补肾阳中药有效成分对睾丸间质细胞生长的影响。方法以小鼠TM3睾丸间质细胞为实验对象,分别采用10、20、40、80、160和320μmol·L^(-1)淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、松脂醇二葡萄糖苷、仙茅苷、金丝桃苷、松果菊苷和耐斯糖处理细胞24h、48h和72h,并设置0.1%DMSO为对照组,运用MTT方法检测各时点细胞增殖情况。结果铺板24~72h内,对照组细胞进入快速的指数生长期;同一时点,与对照组比较,40~320μmol·L^(-1)淫羊藿苷显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05),80~320μmol·L^(-1)补骨脂素和异补骨脂素显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05),320μmol·L^(-1)松脂醇二葡萄糖苷显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05),大于160μmol·L^(-1)仙茅苷显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05)。然而,各浓度的金丝桃苷、松果菊苷和耐斯糖对TM3细胞生长无明显抑制作用。结论相同浓度的各温补肾阳中药有效成分对小鼠TM3睾丸间质细胞增殖抑制作用由强到弱分别是,淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、松脂醇二葡萄糖苷、仙茅苷、金丝桃苷、松果菊苷、耐斯糖。

双酚A对小鼠睾丸间质细胞毒性及miR-203-3p表达的影响

[背景]双酚A(BPA)作为一种重要的增塑剂原料被广泛应用,其对机体健康产生的损伤作用越来越被人们所重视;而生殖毒性是损伤作用中的重要一方面,研究BPA所导致的生殖损伤及其机制已成时下热点。微小RNA(miRNA)的生物学作用及早期损伤标志的意义也被人们所重视。[目的]研究BPA对小鼠睾丸间质细胞毒性及miR-203-3p表达的影响。[方法]通过不同浓度的BPA(0、1、10、100、1000μmol/L)处理小鼠睾丸间质细胞(TM3)24h后,运用CCK-8法检测细胞活力情况,采用流式细胞术检测细胞凋亡指标;应用realtimePCR对miR-203-3p的表达水平进行检测。然后通过TargetScan数据库及miRDB数据库对miR-203-3p的靶基因进行预测,并通过DAVID数据库对靶基因情况进行GO分析及Pathway分析。[结果]随着染毒浓度增加,各组的TM3细胞活力出现不同程度的下降趋势,但仅1000μmol/L浓度组与对照组差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,1000μmol/L组的细胞总凋亡率[(31.33±7.12)%]升高(P<0.05);miRNA的检测结果显示,与对照组相比,miR-203-3p在1、100μmol/L两个浓度组出现升高(均P<0.05);而当浓度为1000μmol/L时,该miRNA表达水平出现了下降(P<0.05)。通过两个数据库生物信息学预测的其可能调控靶基因为278个;通过David数据库进行GO分析的富集结果显示,排在第一位的生物过程、分子功能和细胞组分分别是转录DNA模板、蛋白结合和核;Pathway分析富集的信号通路排在首位的是FoxO信号通路。[结论]不同浓度的BPA可以导致小鼠睾丸间质细胞出现不同程度的损伤现象,这种损伤现象可能与miR-203-3p的改变有关,且该miRNA可能成为重要的早期损伤检测指标。

MBP、MEHP诱导小鼠睾丸间质细胞自噬过程中PTEN的相关研究

[目的]目前对于邻苯二甲酸酯的研究多集中于其原型,但有学者认为,邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二乙基己基酯的毒性作用可能是其在体内的代谢产物邻苯二甲酸单丁酯(MBP)和邻苯二甲酸单乙基己酯(MEHP)所致。本研究拟探讨MBP和MEHP对小鼠睾丸间质细胞(TM-3)自噬的影响以及与第10号染色体缺失的同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)的相关研究。[方法]体外培养TM-3并取其对数生长期,预实验设置毒物浓度梯度为0(对照组)、50、100、200、400、800μmol/L,染毒24 h后,利用改良寇氏法计算MBP、MEHP的半数致死浓度(IC50)后,确定实验染毒浓度为0(对照组)、200、400、800μmol/L。分别采取CCK-8法检测不同毒物剂量和不同染毒时间对细胞存活率的影响;透射电镜观察400μmol/L的MBP、MEHP诱导24 h后具有双层膜状结构的自噬小体;单丹黄酰尸胺(MDC)免疫荧光法检测细胞自噬囊泡的荧光信号强度;采用Western blot技术检测自噬标志蛋白LC3、p62和自噬调节相关蛋白PTEN的表达水平。[结果] CCK-8结果显示:与对照组相比,随着MBP、MEHP染毒剂量增高,细胞存活率降低(P<0.05)。透射电镜结果显示:400μmol/L MBP、MEHP染毒24 h后细胞内可见具有双层膜状结构的自噬小体。MDC法检测结果显示:与对照组相比,200μmol/L MBP、MEHP染毒组荧光信号强度差异无统计学意义(P>0.05);400、800μmol/L MBP染毒组荧光信号强度分别增加了9.0、16.8倍;400、800μmol/L MEHP染毒组荧光信号强度增加了16.3、26.4倍,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示:200μmol MBP、MEHP染毒组LC3II/LC3I、PTEN表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);400、800μmol/L MBP染毒组LC3II/LC3I蛋白表达水平分别增加了7.5、13.6倍,PTEN表达水平增加了4.8、15.4倍;400、800μmol/L MEHP染毒组LC3II/LC3I蛋白表达水平增加了4.5、9.8倍,PTEN表达水平增加了5.7、14.4倍(P<0.05);200μmol/L MBP染毒组p62表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),400、800μmol/LMBP染毒组p62蛋白表达水平分别降低了43%、72%;200、400、800μmol/L MEHP染毒组p62蛋白表达水平也分别降低了55%、80%、88%(P<0.01)。[结论]一定剂量的MBP、MEHP可提高TM-3细胞自噬水平,并且PTEN表达水平与细胞自噬水平呈正相关趋势。

CHOP通路在邻苯二甲酸单丁酯和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯联合暴露致小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用

目的探讨邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]染毒致体外培养的小鼠睾丸间质细胞(TM-3)凋亡过程中CHOP通路的作用。方法将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于0(对照)、50、100、200、400、800μmol/L的MBP和(或)MEHP溶液24、36、48 h后,采用CCK-8法测定细胞活性。将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于完全培养基(对照)、MBP(400μmol/L)、MEHP(400μmol/L)和MEHP(400μmol/L)+MBP(400μmol/L)溶液24 h后,电镜下观察小鼠睾丸间质细胞内质网超微结构的变化。将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于完全培养基(对照)及200、400、800μmol/L MBP和(或)MEHP溶液24 h,流式细胞术检测细胞早期凋亡情况,免疫印迹法检测内质网应激标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CHOP的表达水平。结果与对照组相比,各浓度MBP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异有统计学意义(P<0.05);且随着MBP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈上升趋势。随着MBP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率除100μmol/L组呈上升趋势外,其余浓度组均呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异具有统计学意义(P<0.05);且随着MEHP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈上升趋势。随着MEHP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率在50μmol/L组呈上升趋势,在100μmol/L组呈先下降后上升的趋势,在400μmol/L组呈下降趋势,200μmol/L和800μmol/L组抑制率呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MBP+MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异具有统计学意义(P<0.05);且随着MBP+MEHP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈现上升趋势。随着MBP+MEHP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率除200、400μmol/L组呈现逐渐上升趋势外,其余浓度组均呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MBP和(MEHP)染毒组TM-3细胞的早期凋亡细胞比例均较高,差异有统计学意义(P<0.05);且随着染毒浓度的升高,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒小鼠睾丸间质细胞的早期凋亡细胞比例均呈现上升趋势。在同一染毒浓度下,睾丸间质细胞早期凋亡比例依次为MBP+MEHP<MBP<MEHP,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各浓度MBP和(或)MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞内GRP78和CHOP蛋白的表达水平均增加,差异有统计学意义(P<0.05);且随着染毒浓度的升高,MBP和(或)MEHP染毒小鼠睾丸间质细胞内GRP78和CHOP蛋白的表达水平均呈逐渐上升的趋势。结论 MBP和(或)MEHP染毒可致内质网损伤,上调GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达,这可能是MBP和(或)MEHP引起小鼠睾丸间质细胞凋亡的重要途径。