高内涵筛选结合活细胞实时成像技术分析谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡

目的利用高内涵筛选(high-content screening,HCS)技术结合活细胞实时成像技术研究谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡的形态学变化特征。方法用HCS技术分析摸索不同浓度谷氨酸诱导的N2a细胞早期凋亡百分比的变化,同时结合活细胞实时成像技术追踪谷氨酸诱导的N2a凋亡的形态学变化特征。结果当谷氨酸浓度为750μg/mL时,发生早期凋亡的N2a细胞比例达到峰值(42.07%)。对同一谷氨酸浓度,随着拍摄追踪时间的增加,凋亡细胞数目逐渐增多,胞核荧光强度的变异系数逐渐增大,胞核面积逐渐缩小,胞核逐渐出现碎片化。结论使用HCS结合活细胞实时成像技术能直观清晰地捕捉谷氨酸诱导N2a细胞凋亡的形态学变化特征,是一种体外追踪单一细胞凋亡形态学变化的可靠方法。该方法也可应用于药物对细胞凋亡的促进或抑制作用的形态学变化特征的研究。

GD2抗体达妥昔单抗β治疗神经母细胞瘤护理专家共识

基于国内外临床研究报告以及本研究参与人员临床实践经验,通过文献分析、专家函询及专家研讨对神经节苷脂-2(GD2)抗体达妥昔单抗β治疗神经母细胞瘤的相关内容进行深入研究,最终形成包括准备以及要求、药品配制、药品输注、输注期间护理以及不良反应观察与护理等内容的GD2抗体达妥昔单抗β治疗神经母细胞瘤护理专家共识。

21例高危神经母细胞瘤患儿输注那西妥单抗的观察和护理

总结21例高危神经母细胞瘤患儿222次输注那西妥单抗的观察和护理经验。输注前建立多学科团队、做好患儿和照顾者准备、建立静脉通路、备好床边急救物品和药品、精简预防性用药、实施个体化禁食禁饮方案,输注时优化镇痛策略、密切监测评估病情,输液后加强并发症管理和对严重不良事件的快速反应。经严密观察和护理,21例患儿顺利完成222次那西妥单抗输注。

富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白2在神经母细胞瘤恶性进展中的功能和机制

目的:探究富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白2(cysteine and glycine-rich protein 2,CSRP2)在神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)恶性进展中的功能和作用机制。方法:利用R2数据库分析NB临床样本中CSRP2基因的mRNA水平与NB患儿临床预后的相关性;在NB细胞系SK-N-BE(2)和SH-SY5Y中利用靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰CSRP2的表达或利用质粒转染过表达CSRP2;通过结晶紫染色和实时无标记动态细胞分析技术观察NB细胞的增殖情况;采用克隆形成方法观察NB细胞长时间的克隆形成能力;利用免疫荧光实验检测细胞增殖标记物Ki-67的水平;利用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色流式细胞术分析细胞周期比例,Annexin V/7AAD染色分析细胞凋亡比例;采用划痕实验观察细胞的迁移能力;利用Western blot或实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测NB原发肿瘤组织和细胞系中蛋白和基因的表达水平。结果:NB临床数据库中,国际神经母细胞瘤分期(international neuroblastoma staging system,INSS)为高危险度3/4期的NB组织中CSRP2的mRNA水平显著高于低危险度的1/2期,且高表达水平组NB患儿的生存期显著低于低表达组;Western blot结果显示,CSRP2在3/4期NB组织中的蛋白水平显著高于1/2期。NB细胞中敲低CSRP2,细胞的活力减弱、增殖能力降低;NB细胞中过表达CSRP2促进细胞增殖;敲低CSRP2后,sub-G1、G0/G1和S期细胞的比例增加,Annexin V阳性细胞的比例增多;敲低CSRP2的NB细胞的划痕愈合率显著小于对照组。机制研究发现,敲低CSRP2后细胞增殖标记分子Ki-67和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2)磷酸化水平显著低于对照组。结论:CSRP2在高危险度3/4期NB组织中高表达,表达水平与NB患儿生存期呈负相关;CSRP2通过促进ERK1/2活化,促进NB细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡,表明CSRP2通过激活ERK1/2促进NB进展,为高危NB的靶向治疗提供了潜在的靶点。

抗GD2抗体治疗高危神经母细胞瘤的临床应用

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤。近年来根据神经母细胞瘤表面特异性抗原GD2设计了相应的靶向药物抗GD2抗体。但抗GD2抗体因毒副作用大、国内用药经验较少、药物价格昂贵等原因在临床应用时受到限制。本文通过介绍抗GD2抗体的作用机制、疗效,针对不良反应的预处理用药和成本效益分析等以期为临床用药提供参考。抗GD2抗体能显著改善神经母细胞瘤患者的长期生存质量,通过预处理用药后能提升患者对抗GD2抗体的耐受性,但该药治疗成本较高,因此只有在其价格下降的情况下,才可能成为高危神经母细胞瘤患儿的成本效益治疗选择。

儿童神经母细胞瘤中FAIM2的表达及临床意义

目的:探索Fas细胞凋亡抑制分子2(FAIM2)在儿童神经母细胞瘤中的表达及与其临床病理因子的关系。方法:筛选2020年1月—2022年12月就诊于山东大学齐鲁医院并经病理检查证实为神经母细胞瘤的标本33例,收集其临床资料并随访其预后情况,通过免疫组织化学法检验FAIM2蛋白在33例神经母细胞瘤组织内的表达情况,研究FAIM2的表达与神经母细胞瘤患者各项临床及病理学因子的关系,分析其对预后的影响。结果:在神经母细胞瘤组织中FAIM2蛋白的表达与肿瘤转移有相关性,其中有转移的神经母细胞瘤中FAIM2表达低于无转移病例,差异有统计学意义(P<0.05);而FAIM2的表达与肿瘤组织学类型、肿瘤大小、发病年龄、临床危险度、ki-67阳性指数、乳酸脱氢酶及神经元特异性烯醇化酶水平无明显相关。FAIM2阴性表达的神经母细胞瘤生存时间短于阳性,差异有统计学意义(P<0.05);FAIM2阴性表达和骨髓浸润是影响神经母细胞瘤患者预后的危险因素(P<0.05)。结论:FAIM2在有转移的神经母细胞瘤病例中表达水平降低,并且与患者预后密切相关,提示其可能是参与儿童神经母细胞瘤发展和转移的重要分子生理学机制。

绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯对β淀粉样蛋白25-35诱导小鼠神经瘤母细胞N2a损伤的神经保护作用及其机制

目的探讨绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯(green tea epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对β淀粉样蛋白25-35(beta-amyloid 25-35,Aβ_(25-35))诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a损伤的神经保护作用及其机制。方法体外培养N2a细胞,用含50μg/m L水溶性Aβ_(25-35)片段的DMEM培养液作用于N2a细胞后,加入不同浓度的EGCG(5、10、20、40μmol/L)作用不同时间(24、48、72 h),同时设模型组(未用EGCG处理)及DMSO组(仅用0.1%的DMSO处理)。MTT法检测EGCG对N2a细胞存活率的影响;JC-1法检测EGCG对线粒体膜电位的影响;半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测试剂盒检测EGCG对N2a细胞中caspase-3活性的影响;Western blot法检测EGCG对N2a细胞内Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达水平的影响。结果与模型组和DMSO组比较,20和40μmol/L的EGCG作用24 h时,N2a细胞存活率及caspase-3酶活性明显降低(P<0.05),A_(590)/A_(530)值显著升高(P<0.05);20μmol/L的EGCG作用24 h时,N2a细胞中Bax和caspase-3蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论 EGCG对Aβ_(25-35)诱导的N2a细胞的损伤具有保护作用,其机制可能与EGCG调控细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3的表达水平有关。

依托咪酯对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移、铁死亡和Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的 探究依托咪酯对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移、铁死亡和Nrf2/HO-1信号通路的影响。方法CCK-8法检测依托咪酯(0、0.5、1、2、4、8、16、32和64μmol·L^(-1))对SH-SY5Y细胞活力的影响并计算IC_(50)值;BrdU染色检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;DCFH-DA探针检测ROS含量;Western blot法检测增殖相关蛋白(Ki67、Survivin)、迁移相关蛋白(MMP-2、Vimentin、Fibronectin)、铁死亡相关蛋白(xCT、GPX4、DMT1)和Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白(p-Nrf2、Nrf2、HO-1)的蛋白表达水平。结果 与0μmol·L^(-1)依托咪酯组比较,2、4、8、16、32、64μmol·L^(-1)依托咪酯组细胞活力显著降低(均P<0.05),IC_(50)值为17.2μmol·L^(-1),故选择8、16、32μmol·L^(-1)浓度组进行后续实验。与对照组(0μmol·L^(-1)组)比较,16、32μmol·L^(-1)依托咪酯组BrdU阳性细胞数、划痕愈合率降低(均P<0.05),ROS含量显著升高(P<0.05),Ki67、Survivin、MMP-2、Vimentin、Fibronectin、xCT、GPX4蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),DMT1、p-Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。结论依托咪酯可抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移和铁死亡,这可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现的。

转染IGF2BP3基因siRNA和真核表达质粒的神经母细胞瘤细胞侵袭凋亡变化观察

目的观察转染胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)基因siRNA和真核表达质粒的神经母细胞瘤(NB)细胞侵袭凋亡变化,以探讨IGF2BP3基因对NB细胞侵袭和凋亡的影响。方法选取NB细胞株IMR-32、SK-N-BE(2)、BE(2)-C、SH-SY-5Y,采用qRT-PCR检测IGF2BP3 mRNA、Western blotting法检测IGF2BP3蛋白、Transwell实验观察NB细胞的体外侵袭能力。根据上述实验结果,选择IGF2BP3表达水平最高的SK-N-BE(2)细胞及IGF2BP3表达水平最低的IMR-32细胞作为后续实验细胞。SK-N-BE(2)细胞转染针对IGF2BP3基因的小干扰RNA(siRNA)(SK-siIGF2BP3组),并设立细胞对照组(SK-Control组,只含有脂质体)和siRNA对照组(SK-siNC组,转染阴性对照序列)。IMR-32细胞转染IGF2BP3真核表达质粒(IMR-IGF2BP3组),并设立细胞对照组(IMR-Control组,只含有脂质体)和空载体对照组(IMR-Vector组,转染空载体)。转染成功后,采用qRT-PCR、Western blotting法和细胞免疫荧光染色法检测各组IGF2BP3 mRNA及蛋白,Transwell实验观察各组细胞侵袭能力,流式细胞术测算各组NB细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞侵袭相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin。结果与SKControl组和SK-siNC组相比,SK-siIGF2BP3组IGF2BP3 mRNA、蛋白相对表达量降低,穿越Transwell小室膜细胞数减少,凋亡率升高(P均<0.05);与IMR-Control组和IMR-Vector组相比,IMR-IGF2BP3组IGF2BP3 mRNA、蛋白相对表达量升高,穿越Transwell小室膜细胞数增加,凋亡率降低(P均<0.05)。在SK-N-BE(2)细胞中,与SK-siNC组及SK-Control组比较,SK-siIGF2BP3组中N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量下降,E-cadherin蛋白相对表达量上升(P均<0.05);在IMR-32细胞中,与IMR-Vector组、IMR-Control组比较,IMR-IGF2BP3组N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量升高,E-cadherin蛋白相对表达量下降(P均<0.05)。结论转染IGF2BP3基因siRNA的NB细胞侵袭能力减弱、凋亡率增加,转染IGF2BP3真核表达质粒的NB细胞侵袭能力增强、凋亡率降低。

高危神经母细胞瘤免疫治疗的研究进展

神经母细胞瘤(Neuroblastoma, NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤,因其恶性程度高、易发生早期转移及骨髓转移,严重威胁儿童生命健康。除了传统的手术、化疗、放疗、自体干细胞移植以及13-顺式维甲酸的治疗外,双唾液酸神经节苷脂(GD2)单抗治疗也被纳入国内外NB多模式治疗共识中。尽管如此,高危NB患儿5年生存率仍然低于50%。因此,越来越多的针对NB细胞及其免疫微环境的新免疫疗法正在积极研究中,有望给NB患儿的治疗提供新的思路和希望。本文对目前临床采用的抗GD2疗法和研究中的免疫治疗进行综述。

RAD51C表达下调对小鼠卵巢癌体内成瘤和VEGF、NRP-2表达的调控

目的探讨RAD51旁系同源基因C(RAD51C)表达下调对小鼠卵巢癌体内成瘤和血管内皮生长因子(VEGF)、神经纤毛蛋白-2(NRP-2)表达调控的影响。方法使用A2780卵巢癌细胞,通过培养检测细胞中RAD51C的表达,构建3种RAD51C干扰载体(SiRNA-47、SiRNA-183和SiRNA-285),并包装成慢病毒,转染细胞,逆转录实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证转染效果,进行稳筛,构建稳转细胞株。使用Balb/c雌性裸鼠建立细胞系来源的异体移植肿瘤模型(CDX)模型,将18只建模成功的裸鼠分为3组:A2780细胞组(Control组)、A2780细胞+空载体对照组(NC组)、A2780细胞+RAD51C干扰组(Si-RAD51C组),每组各6只。Control组注射生理盐水,NC组注射空载慢病毒50μL,Si-RAD51C组注射RAD51C干扰慢病毒50μL。观察各组成瘤情况,取肿瘤组织,采用蛋白质印迹法(WB)、免疫组织化学检测RAD51C、VEGF、NRP-2蛋白表达情况。结果RT-qPCR验证RAD51C干扰慢病毒转染效果以SiRAN-285最明显(P<0.05)。Si-RAD51C组与Control组、NC组比较瘤体的体积最小、重量也最轻,且RAD51C、NRP-2及VEGF蛋白的表达显著降低(P<0.05)。结论RAD51C干扰慢病毒可抑制小鼠A2780卵巢癌细胞肿瘤的形成,且对RAD51C、NRP-2及VEGF蛋白的表达均有抑制作用。

顺铂联合衣霉素对神经母细胞瘤的抑制作用及其机制

目的探究顺铂(DDP)联合衣霉素(TM)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-SH细胞的抑制作用及其机制。方法将人神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-SH细胞分为对照组、TM组(0.4mg/LTM处理24h)、DDP组(4mg/LDDP处理24h)和DDP+TM组(0.4mg/LTM+4mg/LDDP共处理24h)。采用CCK-8实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell实验分别检测各组细胞的细胞活力、增殖能力、迁移能力和侵袭能力,采用免疫印迹法检测各组细胞中JAK2-STAT3-HIF1α通路相关蛋白JAK-2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和HIF1α的表达水平。结果实验结果显示,DDP+TM组两种细胞的细胞活力、增殖能力、侵袭能力、第12及24小时时的迁移能力及JAK2-STAT3-HIF1α通路各蛋白表达水平均显著低于其他三组(tLSD=2.14~78.95,P<0.05)。结论DDP联合TM可通过JAK2-STAT3-HIF1α通路抑制神经母细胞瘤的增殖和迁移,该结果为神经母细胞瘤的治疗提供了新思路。

MYCN基因与PHOX2B基因联合检测对高危神经母细胞瘤患儿危险度及预后的评估价值

目的探讨MYCN基因与PHOX2B基因联合检测在高危神经母细胞瘤(NB)患儿危险度与预后评估中的应用价值。方法选取106例高危NB患儿,于初诊时检测MYCN、PHOX2B基因的表达情况,分析两项指标与患儿病理特征的关系,并在化疗6个疗程后随访1年,以Kaplan-Meier法分析MYCN基因与PHOX2B基因与患儿预后的关系。结果106例患儿中MYCN基因扩增60例(56.60%),PHOX2B基因阳性45例(42.45%)。MYCN基因扩增患儿初诊时乳酸脱氢酶(LDH)≥1500 U/L占比高于基因正常患儿,PHOX2B基因阳性患儿中肿瘤转移部位≥3个与高神经元特异性烯醇化酶(NSE)≥370μg/L占比高于基因阴性患儿,差异有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier结果显示:MYCN基因扩增患儿与PHOX2B基因阳性患儿的1年生存率分别为48.33%(29/60)、44.44%(20/45),明显低于MYCN基因正常患儿65.22%(30/46)与PHOX2B基因阴性患儿63.93%(39/61),差异有统计学意义(P<0.05)。结论MYCN基因与PHOX2B基因在高危NB患儿危险度分层与预后的评估中具有较高的临床价值,临床可进行大力推广。

胶质母细胞瘤在多个空间和时间尺度上破坏大脑皮质的神经网络活动

大脑皮质组织中生长的胶质母细胞瘤(GBM),会引发早期和持续的神经元过度兴奋,其导致的症状范围包括轻度的认知障碍到严重的癫痫发作。在GBM肿瘤周围,突触密度、神经元信号的扩散动力学、过量谷氨酸的空间分布,这些因素对高阶神经元网络模块化的影响尚不清楚。在本研究中,通过联合采用钙和谷氨酸荧光报告分子的细胞和广角成像技术,对两种具有不同突触微环境和浸润特征的GBM小鼠模型进行了研究。

I2PP2A在神经母细胞瘤组织中的表达及其降表达后SH-SY5Y细胞迁移、侵袭能力观察

目的探讨蛋白磷酸酶2A抑制剂2(I2PP2A)在神经母细胞瘤组织中的表达变化及其降表达对SH-SY5Y细胞迁移和侵袭能力的影响。方法采用免疫组化法检测66例份神经母细胞瘤组织及配对的20例份癌旁正常组织中的I2PP2A蛋白表达,并分析不同临床病理参数患儿的I2PP2A蛋白表达情况。将对数生长期的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分为空白组(正常培养不转染)、阴性对照组(转染无义随机干扰序列质粒)、沉默组(转染I2PP2A的shRNA干扰质粒),采用Western blotting法检测三组细胞I2PP2A及基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达,细胞划痕实验及Transwell侵袭实验分别观察细胞迁移和侵袭能力。结果神经母细胞瘤组织中I2PP2A高表达41例份(62.1%),癌旁组织为7例份(35.0%),二者比较P<0.05。不同性别、年龄、核分裂—核碎裂指数(MKI)及分化程度的神经母细胞瘤患儿癌组织I2PP2A蛋白高表达率比较均无统计学差异(P均>0.05);危险度为中危+高危的患儿癌组织I2PP2A高表达率高于低危患儿,临床分期为Ⅲ期+Ⅳ期的患儿癌组织I2PP2A高表达率高于Ⅰ期+Ⅱ期+4S期患儿(P均<0.05)。与空白组、阴性对照组比较,沉默组细胞I2PP2A、MMP-2蛋白相对表达量及划痕愈合率、穿膜细胞数均降低(P均<0.05),空白组、阴性对照组细胞上述指标比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论神经母细胞瘤组织中I2PP2A蛋白呈高表达,并与患儿危险度和临床分期密切相关;降表达I2PP2A会减弱SH-SY5Y细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与调控MMP-2表达有关。

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞脑啡肽酶基因的表达与启动子区甲基化和组蛋白修饰相关

目的研究小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a(N2a)细胞中脑啡肽酶(NEP)基因表达的表观调控机制,探讨DNA甲基化与组蛋白乙酰化之间的相互作用。方法体外培养N2a细胞,以3μmol/L、5μmol/L DNA甲基化酶抑制5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-dc)及(300、500、700)nmol/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)分别处理N2a细胞48 h和24 h。采用逆转录PCR(RT-PCR)、Western blot法分别检测NEP的mRNA、蛋白表达;亚硫酸氢盐测序聚合酶链反应(BSP)法检测NEP基因启动子区DNA的甲基化水平;染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测NEP基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平。结果 5-Aza-dc和TSA均能剂量依赖地提高NEP基因的表达(P<0.01);5-Aza-dc可诱导NEP基因去甲基化(P<0.01);TSA可增高NEP组蛋白H3乙酰化水平(P<0.05),但不能明显改变NEP基因DNA的甲基化水平(P>0.05)。结论在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中NEP基因的表达受DNA甲基化及组蛋白乙酰化的调控,组蛋白乙酰化水平并不影响DNA甲基化状态。

神经母细胞瘤患儿骨髓PHOX2B基因临床意义探讨

目的探究神经母细胞瘤(NB)患儿骨髓中PHOX2B基因表达的临床意义。方法回顾性分析2020年10月—2022年5月我院血液肿瘤科收治的47例新诊断NB患儿的临床资料,病初检测47例NB患儿骨髓PHOX2B mRNA的表达水平。结果(1)纳入研究的47例NB患儿男26例(55%),女21例(45%);中位发病年龄23.0(0.27-144)个月;INRG临床分期L1期3例(6%)、L2期15例(32%)、M期29例(62%);危险度分组极低危3例(6%)、低危9例(19%)、中危8例(17%)、高危27例(57%);病初存在骨髓转移者(骨髓形态学阳性)20例(43%),骨髓多色流式细胞术(MFC)检测阳性23例(49%),骨髓PHOX2B mRNA表达阳性31例(66%),其中3例体征存在浣熊眼的患儿PHOX2B mRNA水平均显著增高,与内参基因ABL比值分别为58%、75%、117%。(2)PHOX2B阳性组与阴性组在各种首发临床表现方面均无差异(P均>0.05);(3)PHOX2B mRNA表达水平与初诊时的骨髓细胞形态学、MFC计数结果、初诊血NSE值、初诊血LDH值、INRG分期、MYCN基因、危险度分组均具有相关性(P均<0.05)。(4)20例PHOX2B阳性组NB患儿化疗2个疗程后骨髓PHOX2B表达水平、MFC计数结果及骨髓细胞形态学阳性率较病初均明显下降(P均<0.001)。结论骨髓PHOX2B mRNA检测对于NB具有良好的特异性,可反映NB患儿体内肿瘤负荷及判断其危险度,具有一定的临床实用价值。

GD-2单抗治疗高危/难治神经母细胞瘤儿童的临床诊治体会

目的:探讨GD-2单抗免疫治疗高危及复发难治神经母细胞瘤患儿的临床反应及治疗效果。方法:回顾性分析22例接受GD-2单抗免疫治疗的儿童神经母细胞瘤患者,分析GD-2单抗免疫治疗的耐受性、不良反应及短期治疗效果评估。结果:22例患者在接受GD-2单抗免疫治疗过程的不同治疗周期中均出现发热症状:其中第1个治疗周期出现发热为100%,平均热峰39.0℃,平均持续时间6.75 d;5例(22%)患者出现感染,8例(36%)患者出现疼痛反应,11例(50%)患者发生腹泻,2例(9%)患者发生过敏反应,2例(9%)患者发生轻度毛细血管渗漏综合征(CLS);其中5个患者完成5个治疗周期,经评估1例病情明显好转,2例病情稳定无进展,1例病灶较前缩小,1例复发。结论:GD-2单抗免疫治疗对儿童神经母细胞瘤具有良好的安全性和耐受性,其远期疗效需进一步随访评估。

I2PP2A蛋白调控PP2A/Akt信号通路对神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(protein phosphatase 2A inhibitor-2,I2PP2A)调控PP2A/Akt信号通路对人神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞转染I2PP2A-shRNA干扰质粒及对照质粒后分为siI2PP2A组及siC组。CCK-8、细胞克隆形成实验、细胞周期实验用于检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测细胞内相关蛋白相对表达量;磷酸酶检测系统试剂盒测定PP2A活性;给予PP2A抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)处理细胞并检测增殖活性及PP2A/Akt信号通路变化。结果与siC组比较,siI2PP2A组48h及72h的吸光度(A)值下降(P<0.01),细胞克隆形成数目显著降低(P<0.01);siC组G_(0)/G_(1)期、S期、G_(2)/M期、细胞凋亡比例分别为43.29%±3.68%、31.76%±2.42%、24.96%±2.34%、1.89%±1.09%,siI2PP2A组为57.00%±3.90%、25.88%±2.06%、17.13%±2.07%、15.18%±5.60%,与siC组比较,siI2PP2A组G_(0)/G_(1)期细胞比例和凋亡细胞比例升高,S期和G_(2)/M期细胞比例下降(P<0.05)。同时,siI2PP2A组较siC组PP2A活性显著增加(P<0.05),CyclinD1、Bcl-2、p-Akt蛋白相对表达量降低(P<0.05),Bax、cleaved-PARP蛋白相对表达水平升高(P<0.01)。进一步给予PP2A抑制剂OA后,可部分恢复siI2PP2A组CyclinD1、Bcl-2、p-Akt、Bax、cleaved-PARP蛋白水平(P<0.05)并逆转下调I2PP2A导致的增殖抑制(P<0.05)。结论下调I2PP2A介导的神经母细胞瘤细胞增殖抑制和凋亡增加可能与PP2A/Akt信号通路密切相关。

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞不同分化培养方法的比较

目的:比较5种不同分化培养方法对小鼠神经母细胞瘤N2a细胞形态、分化情况、分化标志物及增殖、凋亡的影响。方法:N2a细胞分别以D10[DMEM+10%胎牛血清(FBS)]完全培养基和不同分化培养基D1(DMEM+1%FBS)、D0(不含FBS的DMEM培养基)、30%OM(DMEM+30%Opti-MEMⅠ)、D2+视黄酸(RA)(DMEM+2%FBS+10μmol·L-1 RA)和D1+RA(DMEM+1%FBS+10μmol·L-1RA)培养后显微镜眀场随机拍照,观察不同时间点的分化比例、突起长度及突起数量;免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测神经元标志物的表达;EdU掺入流式细胞术、CCK-8和AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测不同培养方法对细胞增殖和凋亡的影响。结果:中等密度培养条件下D0组72 h分化比例为(35.92±2.63)%,D1、30%OM、D2+RA和D1+RA组96 h分化比例分别为(10.40±2.05)%、(29.70±4.98)%、(11.37±2.56)%和(45.13±8.75)%;分化后神经元标志物微管蛋白beta-Ⅲ(βⅢ-tubulin)和生长相关蛋白43(GAP43)表达上调。D0组分化培养24 h后即可见长突起,突起以单支为主,但增殖能力较D10和30%OM组低,凋亡和死亡比例高,72 h后细胞状态差,大部分死亡。D1+RA组分化培养24 h也可见长突起,细胞呈多支生长,增殖能力也较D10和30%OM组低,凋亡和死亡比例高。30%OM组分化72 h才见较长突起,突起以两支为主,细胞增殖能力较D10组略低,但凋亡与D10组无显著差异。在低密度培养条件下30%OM可实现长时间分化培养,分化比例随培养时间的延长而增加,培养144 h分化比例达(56.22±6.27)%,突起长度(176.73±108.61)μm。结论:D0、30%OM和D1+RA分化培养方法均可实现较高比例的分化,D0和D1+RA分化和长突起的出现早于30%OM,但细胞增殖率低,凋亡比例高,不利于长时间培养;30%OM培养在低密度下可实现高分化比例和长突起,适合长时间分化培养。