影像组学结合深度学习预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的端粒酶逆转录酶启动子状态

目的 探讨基于MRI的影像组学和深度学习建立融合模型预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的端粒酶逆转录酶启动子(TERTp)突变状态。资料与方法 回顾性分析2019年1月—2021年6月重庆医科大学附属第一医院癌症基因组图谱和癌症影像档案的175例异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤患者(训练组122例,测试组53例),评估其TERTp突变状态。在T1c和T2f图像上勾画水肿区和肿瘤区,使用SE-Net模型构建深度学习模型,提取不同区域(水肿区、肿瘤区和整体病变)的组学特征,并通过最小绝对收缩和选择算法筛选11个特征建立组学模型。最后,将影像组学模型、深度学习模型和包含伦勃朗视觉感受图像特征的临床模型结合为融合模型,使用校准曲线和决策曲线评估模型。结果 最终建立6个预测模型,临床模型训练组和测试组曲线下面积(AUC)分别为0.815(95%CI 0.738~0.892)和0.645(95%CI 0.494~0.796);深度学习模型训练组和测试组AUC分别为0.860(95%CI 0.798~0.922)和0.735(95%CI 0.614~0.856);融合组学模型比单独水肿或肿瘤区组学模型预测性能更优,训练组和测试组AUC分别为0.906(95%CI 0.856-0.955)和0.867(95%CI 0.769~0.964);融合模型预测性能最佳,训练组和测试组AUC分别为0.964(95%CI 0.929~1.000)和0.905(95%CI 0.818~0.991)。结论 影像组学结合深度学习的临床融合模型在预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的TERTp突变状态方面表现良好。

c-myc调节人端粒酶逆转录酶(htert)启动子活性的体外研究

目的 :研究c myc对人端粒酶逆转录酶 (htert)启动子的调节作用。方法 :采用Lipofect脂质体转染法将DNA质粒分别转染至肝癌细胞HepG2 、猴肾COS 7细胞和NIH3T3细胞 ,孵育 48h后 ,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果 :与对照相比 ,载有htert 80 0bp启动子的质粒TERTLuc(80 0 )在肿瘤细胞HepG2 中活性显著增强。外源性转录因子c myc可显著上调htert启动子的表达 ,其激活作用与剂量呈正相关。人工突变c myc结合位点明显降低htert启动子的活性。结论 :c myc可直接激活htert启动子的表达 ,是调节端粒酶活性的重要转录因子。

胶质瘤中端粒酶逆转录酶启动子区突变分析及其预后意义

目的：探讨端粒酶逆转录酶（TERT）启动子区突变与胶质瘤患者临床病理指标的关系及其对预后的影响。方法：应用Sanger测序技术检测78例脑胶质瘤组织中TERT启动子区C228T和C250T位点的突变情况,分析TERT启动子区突变与临床病理指标的关系及其对预后的影响。结果：TERT启动子区突变在脑胶质瘤中的发生率为32.1%,在低级别（Ⅰ~Ⅱ）和高级别（Ⅲ~Ⅳ）胶质瘤中突变分别占28.0%和34.0%。其中少突星形细胞瘤中突变占57.1%,胶质母细胞瘤中突变占44.4%,低级别星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤中突变分别占28.6%和23.1%。TERT启动子区突变与胶质瘤患者术后生存时间显著相关,突变型术后生存时间显著短于野生型（P=0.001）。按低级别和高级别分组独立分析后发现,TERT启动子区突变在低级别组和高级别组中均与不良预后相关（P值分别为0.019和0.018）。Cox回归分析表明,TERT启动子区突变和术后放化疗是独立的预后影响因素（P=0.002,HR=3.486,95%CI：1.591~7.637;P=0.004,HR=0.331,95%CI：0.156~0.699）。结论：TERT启动子区突变频繁发生于脑胶质瘤中,突变型胶质瘤患者预后不良。

端粒酶逆转录酶基因启动子的克隆及其转录活性的检测

端粒酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶,催化合成端粒的DNA重复序列,并引导端粒添加到染色体的尾端,对维持染色体的长度、调节细胞增殖和凋亡起重要作用[1].正常人的体细胞中通常检测不到端粒酶的活性,而约90%的肿瘤细胞的端粒酶活性却大大增强[2].

人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的:探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人膀胱癌的治疗作用。方法:建立人膀胱癌细胞株253JBALB/C裸小鼠移植瘤模型,采用Ad-hTERT-HSV-tk裸鼠尾静脉注射,腹腔注射GCV治疗并观察结果。通过常规病理切片观察肿瘤破坏情况及安全性;通过TUNEL染色进一步观察肿瘤的凋亡情况,免疫组化法测定增值细胞核抗原(PCNA)。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组,显示出明显的肿瘤抑制作用,其肿瘤体积、重量显著低于各对照组(P<0.05),抑瘤率明显。Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组凋亡指数高于其它各组,而增殖指数却明显低于其它各组。结论:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,可以靶向性转入人膀胱癌细胞,治疗效果显著。

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的 :构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法 :用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP ,插入pcDNA3.1 (+)载体 ,得到pcDNA3.1 (+) -GFP(PG)载体 ;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列 ,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体 ,得到pcDNA3.1 (+) -GFP -hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC970 6细胞系 ,经G4 1 8筛选 ,荧光显微镜下观察。结果 :克隆得到的启动子序列与文献相符 ,重组载体经酶切鉴定方向正确 ,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC970 6细胞系 ,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论 :克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。

两种端粒酶逆转录酶启动子真核表达载体的构建

目的:构建hTERT启动子和保留HBV同源序列的缺失点变hTERT启动子(pGL3del445)的真核表达载体,为进一步研究HBV与hTERT启动子的关系奠定实验基础。方法:通过双酶切及PCR方法从pCRTRTP载体上将全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的基因序列克隆到pPLbasic多克隆位点上,构建真核表达载体pGL3TRTP与pGL3Bdel445,将该两质粒与pRLtk共转染不同细胞系,评估其端粒酶启动子活性。结果:经测序证明成功构建了全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的真核表达载体pGL3TRTP和pGL3Bdel445,共转染实验中,证实在永生细胞系中重组子高效表达,在非永生正常细胞中重组子不表达。结论:构建的两种重组表达载体具有端粒酶启动子活性,在不同端粒酶表型的细胞系中其表达具有选择性。

人胃癌细胞系端粒酶逆转录酶基因启动子区域甲基化的检测

目的研究人胃癌细胞系端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子区域是否存在甲基化,甲基化程度是否与肿瘤的恶性程度相关。方法运用甲基化特异性PCR(MSP)方法,以人乳腺癌细胞、人胚肺成纤维细胞作为阳性及阴性对照,检测中、低分化的胃腺癌细胞系hTERT基因启动子区域甲基化情况。结果端粒酶阳性的胃癌细胞、人乳腺癌细胞均存在甲基化,而端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞不存在甲基化,不同分化程度胃癌细胞的hTERT启动子区CpG位点甲基化情况不同。结论hTERT基因启动子区域的甲基化,与细胞的分化程度相关,可能参与了胃癌细胞的发生与发展。

人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子(hTERT)调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体,并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法:利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞,采用G418筛选获得阳性克隆;应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术(FCM)结合间接免疫荧光、RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果:经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论:成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体,并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一.端粒的磨耗限制大多数体细胞的复制,肿瘤细胞主要通过转录上调端粒酶限制成分催化亚基端粒酶逆转录酶(hTERT)维持端粒长度.由于hTERT启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点.我们综述了hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展.

端粒酶逆转录酶启动子hTERT／U6嵌合启动子的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建有hTERT/U6嵌合启动子的小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)表达载体,并用分子生物学的技术和方法验证其对肝癌细胞SMMC-7721的效应。方法构建siRNA-EGFP-PTZU6+1表达载体,将其转染到稳定表达EGFP的肝癌细胞株7721(EGFP-7721),观察细胞荧光的变化及RT-PCR,Western blot筛选出更有效的siRNA-EGFP-PTZU6+1载体。PCR扩增端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase promoter,hTERT)启动子的核心序列,构建针对EGFP基因的hTERT/U6嵌合启动子siRNA表达载体(EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT),正向和反向插入的hTERT启动子各1个,并将其转染至EGFP-7721细胞中,RT-PCR验证其效应。结果RT-PCR,Western blot结果表明两重组质粒siRNA-EGFP-PTZU6+1转染EGFP-7721细胞后EGFP基因的表达无统计学差异,但与对照组比较均显著抑制了EGFP基因(P<0.01)。而且,RT-PCR结果显示,反向插入的重组质粒EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT与对照组相比显著抑制了EGFP基因的表达(P<0.05)。结论构建的含hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体在肝癌细胞中具有功能活性,为探讨基因的靶向治疗奠定了基础。

人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在肿瘤基因治疗中的应用

目前肿瘤靶向基因治疗是肿瘤基因治疗领域中非常具有应用前景的疗法之一。大量研究表明肿瘤中端粒酶会异常表达。与常用启动子相比,人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子能够靶向端粒酶阳性细胞如肿瘤细胞等,而成为肿瘤治疗研究的热点。本文就hTERT启动子介导毒性基因、自杀基因、溶瘤病毒等进行肿瘤的基因治疗,以及hTERT启动子优化策略进行阐述。

人端粒酶逆转录酶基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异性表达载体的构建

目的构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerasereserse transcription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体。方法提取人SKOV3细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因核心启动子。并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中。用脂质体转染法,将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞,检测肿瘤细胞和正常细胞中GFP差异表达。结果HTERT基因核心启动子调控的表达载体,在所检测的3种肿瘤细胞中均具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性。结论hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子的载体可能是一种新型和有希望肿瘤治疗的途径。

人端粒酶逆转录酶基因启动子介导重组Caspase-3治疗人肺腺癌的研究

目的探讨使重组Caspase-3分子选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡从而杀伤肿瘤细胞的可行性。方法构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控下的重组Caspase-3分子,通过报告基因分析、Caspase-3酶活性分析、流式细胞分析、MTT方法和动物实验来研究其在肿瘤细胞中选择性诱导凋亡的作用。结果通过Caspase-3酶活性分析,发现phTERT-Rev-Caspase-3在人肺腺癌细胞A549中能够诱导Caspase-3的活性表达;流式细胞分析和MTT方法提示其具有明显的诱导A549细胞凋亡、抑制增殖的作用;动物实验显示其能够有效地抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长。结论phTERT-Rev-Caspase-3是一种有效的选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡的分子。

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体的构建

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控FADD的特异表达载体。方法利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,FADD基因片段,并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中。结果hTERT基因启动子调控FADD表达载体经酶切鉴定含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。结论hTRET基因启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因启动子调控FADD表达载体可能是一种新型、有希望的肿瘤治疗的途径。

人端粒酶逆转录酶启动子转录活性的磁共振成像研究

目的探索磁共振成像技术检测人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子靶向转录活性的可行性。方法构建慢病毒Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro和对照Lenti-CMV-Fth-flag-Puro载体,将上述载体分别转染端粒酶阳性的肺腺癌(A549)和端粒酶阴性的原代人牙周膜成纤维(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)细胞。进行免疫荧光染色和Western blot检测细胞Fth-flag表达情况,采用普鲁氏蓝铁染色检测细胞摄铁量,MR扫描观察细胞T*2WI信号和T*2值改变。结果 A549细胞转染Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro载体后,免疫荧光染色和Western blot检测结果显示转染细胞表达Fth-flag蛋白,未转染细胞不表达Fth-flag蛋白,普鲁氏蓝铁染色示转染细胞摄铁量较未转染细胞显著增加,MR扫描显示转染细胞T*2WI信号(1 340.86±49.21)和T*2值(12.10±0.92)较未转染细胞(2 049.08±87.58),(21.44±1.15)显著降低(P<0.05);HPDLFs细胞转染Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro载体后,细胞无Fthflag蛋白表达,细胞摄铁量较未转染细胞无变化,T*2WI信号(2 225.42±73.43)和T*2值(24.01±1.13)较未转染细胞T*2WI信号(2 148.48±54.74)和T*2值(23.39±1.72)无显著差异(P>0.05)。而转染对照Lenti-CMV-Fth-flag-Puro慢病毒载体后,A549和HPDLFs细胞均表达Fth-flag蛋白,转染细胞摄铁量较未转染细胞均显著增加,转染细胞T*2WI信号[A549:(1 137.38±60.59),HPDLFs:(1 299.16±53.42)]和T*2值[A549:(9.61±1.17),HPDLFs:(11.54±0.74)]均比未转染细胞显著下降(P<0.05)。结论 MR铁蛋白报告基因成像技术可用于检测hTERT启动子转录活性,构建的慢病毒载体有望为恶性肿瘤的靶向诊断提供一种新的方法。

端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的肿瘤靶向性分析

目的:体外研究siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性.方法:常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌SMMC-7721细胞株(EGFP-7721)和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF(EGFP-HELF).以PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为空白质粒组,siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为实验对照组,将siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EG-FP-HELF细胞作为实验组,用real-time SYBR Green PCR和Western Blot鉴定siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1对两种细胞株的绿色荧光蛋白表达的影响.结果:正向和反向的重组质粒siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1转染EGFP-HELF细胞与空白质粒比较,EGFP基因表达无差异(P>0.05),而转染稳定表达绿色荧光蛋白的7721后仅反向的siRNA-EG-FP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒抑制EGFP基因的表达(P<0.01).siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒与空白质粒组比较,在EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株间,EGFP基因的表达均具有统计学差异(P<0.01).结论:反向插入的siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒在肿瘤细胞具有一定靶向性,为进一步探讨基因的靶向治疗奠定了基础.

甲状腺乳头状癌端粒酶逆转录酶启动子突变的临床及超声特征分析

目的:探索与端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变相关的特征性甲状腺乳头状癌(PTC)的超声特征。方法:选取医院收治的552例术后诊断为PTC患者,依据术后分子学检测将其分为TERT组(19例,TERT启动子突变)和BRAF基因组(533例,单纯BRAF基因突变)。根据术后病理确定淋巴结转移和脉管转移的情况,超声采集结节最大径线、结节数量、回声、边缘、成分、方位、微钙化及桥本氏甲状腺炎背景等特征。比较两组TERT启动子和BRAF基因的突变率和淋巴结转移及脉管转移的发生率;将两组有差异的临床和超声特征进行Logistic回归分析,分析与TERT启动子突变的相关危险因素。结果:552例患者平均年龄为(45.39±12.39)岁,TERT组患者的平均年龄为(57.42±12.41)岁,高于BRAF基因组患者的平均年龄(44.96±12.18)岁,差异有统计学意义(t=4.378,P<0.05),TERT组中≥45岁的患者占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(48.2%),差异有统计学意义(x^(2)=6.931,P<0.05)。TERT组中有36.8%的患者发生侧颈区淋巴结转移,明显高于BRAF基因组(8.1%),差异有统计学意义(x^(2)=18.985,P<0.05)。TERT组的结节最大径(2.50±1.88)cm明显大于BRAF基因组的结节最大径(1.02±0.64)cm,差异有统计学意义(t=3.406,P<0.05)。TERT组>1 cm的结节占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(32.7%),差异有统计学意义(x^(2)=17.655,P<0.05),TERT组中囊实性结节的占比(10.5%)明显高于BRAF基因组(1.1%),差异有统计学意义(x^(2)=11.351,P<0.05)。TERT组中73.7%的患者结节距离被膜<2 mm,明显高于BRAF基因组,差异有统计学意义(x^(2)=4.621,P<0.05)。Logistic回归分析显示,相对于BRAF基因组,年龄≥45岁、结节最大径>1 cm和结节成分呈囊实性是与TERT启动子突变相关的独立危险因素(OR=3.895,OR=6.442,OR=7.929;P<0.05)。结论:在结节有垂直位、微钙化、边缘不规则等恶性征象的基础上,当患者年龄≥45岁、结节>1 cm和结节成分呈囊实性时应考虑存在TERT启动子突变的可能。

人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达

目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp。方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-TEasy载体和重组载体pEGFP-C3上。经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:成功扩增出276bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致。重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达。结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达。

人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As2O3对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。