香叶木素对RSL3诱导小鼠精母细胞GC-2铁死亡的抑制作用及其机制

目的:探讨香叶木素(DIO)对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抑制剂(1S,3R)-RSL3(RSL3)诱导小鼠精母细胞GC-2铁死亡的抑制作用,并阐明相关作用机制。方法:GC-2细胞分为对照组、RSL3组、RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+铁死亡抑制剂Ferrostain-1(Fer-1)组(200 nmol·L^(-1)Fer-1)。分别采用0、1、5、10、50、100、500和1000 nmol·L^(-1)RSL3溶液及0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和50.0μmol·L^(-1)DIO溶液处理细胞。另取GC-2细胞,分为空白组、模型组和给药组,给药组GC-2细胞按照处理方式分为0.8、4.0和20.0 nmol·L^(-1)DIO组及RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组。噻唑蓝(MTT)法检测各组GC-2细胞存活率。采用100 nmol·L^(-1)RSL3分别作用GC-2细胞0、6、12、24、36和48 h,Western blotting法检测各组GC-2细胞中铁死亡相关蛋白表达水平。试剂盒检测各组GC-2细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平及谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值,免疫荧光法观察各组GC-2细胞中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白荧光强度。结果:MTT法检测,与0 nmol·L^(-1)RSL3组比较,50、100、500和1000 nmol·L^(-1)RSL3组GC-2细胞存活率均明显降低(P<0.01);与0μmol·L^(-1)DIO组比较,0.5、1.0、5.0、10.0和50.0μmol·L^(-1)DIO组GC-2细胞存活率均明显降低(P<0.01),后续实验中选择100 nmol·L^(-1)RSL3作用GC-2细胞,DIO作用浓度<0.1μmol·L^(-1)。与空白组比较,模型组GC-2细胞存活率明显降低(P<0.01);与模型组比较,RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组细胞存活率明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,与0 h比较,RSL3作用6 h时GC-2细胞中GPX4蛋白表达水平明显降低(P<0.01),RSL3作用12 h时GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),RSL3作用24 h时GC-2细胞中GPX4和HO-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),RSL3作用36和48 h时GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平均明显降低(P<0.01);将100 nmol·L^(-1)RSL3作用GC-2细胞12 h作为后续实验条件。与对照组比较,RSL3组GC-2细胞中MDA水平明显升高(P<0.01),SOD活性和GSH/GSSG比值均明显降低(P<0.05);与RSL3组比较,RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中SOD活性均明显升高(P<0.05或P<0.01),RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中MDA水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中GSH/GSSG比值均明显升高(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光法观察,与对照组比较,RSL3组GC-2细胞中ACSL4蛋白荧光强度明显增强;与RSL3组比较,RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中ACSL4蛋白荧光强度均明显减弱。Western blotting法检测,与对照组比较,RSL3组GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平升高(P<0.05),GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01);与RSL3组比较,RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:DOI能够减轻RSL3诱导的小鼠精母细胞GC-2铁死亡,其机制可能与抑制HO-1蛋白表达,上调GPX4和FTH1蛋白表达有关。

细胞羧肽酶1调控小鼠睾丸初级精母细胞GC-2增殖的作用与机制研究

目的探讨细胞羧肽酶1(CCP1)在小鼠睾丸初级精母细胞(GC-2)增殖中的作用及分子机制。方法体外正常培养GC-2细胞,利用含有空载质粒与CCP1重组质粒的慢病毒感染GC-2细胞构建阴性对照组(NC组)与CCP1过表达组(GC-2+CCP1组)细胞。CCK-8法与流式细胞术分别检测CCP1过表达对GC-2细胞增殖与周期的影响;实时荧光定量PCR检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cdk2)、细胞周期蛋白B1(Ccnb1)和细胞周期蛋白D1(Ccnd1)的表达;Western blot检测Cdk2蛋白表达。结果CCK-8与流式细胞术结果显示,GC-2+CCP1组细胞的体外分裂增殖能力低于NC组,并发生了G_(2)/M期阻滞,差异有统计学意义(P<0.05)。GC-2+CCP1组细胞的CDK2 mRNA与蛋白表达高于NC组、Ccnb1与Ccnd1 mRNA低于NC组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CCP1过表达可能通过影响细胞周期因子Cdk2、Ccnb1与Ccnd1的表达抑制GC-2细胞体外增殖能力发生G_(2)/M期阻滞。

氯化镉引起线粒体分裂诱导小鼠精母细胞GC-2 spd凋亡

目的探讨镉诱导小鼠精母细胞(GC-2 spd)凋亡的作用机制。方法于2021年3月,分别用5和10μmol/L氯化镉(CdCl_(2))染毒GC-2 spd细胞24 h,分别为CdCl_(2)5μmol/L染毒组(CdCl_(2)低剂量组)和CdCl_(2)10μmol/L染毒组(CdCl_(2)高剂量组),以未染毒的GC-2 spd细胞作为对照组。采用Mito-Track Red CMXRos线粒体荧光探针染色细胞检测线粒体形态,流式细胞术结合JC-1荧光探针检测线粒体膜电位的变化;使用细胞线粒体分离试剂盒和RIPA裂解液分别提取GC-2 spd细胞的线粒体蛋白、细胞浆蛋白和细胞总蛋白,Western blot检测线粒体稳态调节蛋白[分裂蛋白(FIS1)和融合蛋白(OPA1)]及细胞凋亡相关蛋白(Cytochrome c和cleaved Caspase-3)的表达。结果与对照组细胞比较,CdCl_(2)低剂量组和高剂量组细胞中JC-1红色/绿色荧光信号相对比值均明显降低(0.740±0.071、0.570±0.028),差异有统计学意义(P=0.017、0.004);线粒体形态由长管状变为点状,含点状线粒体的细胞比例明显升高(45.1%±3.7%和25.7%±4.9%),差异有统计学意义(P=0.005、0.001);CdCl_(2)低、高剂量组细胞中线粒体FIS1相对表达水平均明显升高(1.271±0.120、1.693±0.155),差异有统计学意义(P=0.046、0.000);OPA1相对表达水平明显降低(0.838±0.050、0.682±0.040),差异有统计学意义(P=0.049、0.001)。与对照组细胞比较,CdCl_(2)低剂量组细胞的胞浆中Cytochrome c蛋白相对表达水平(1.249±0.151)差异无统计学意义(P=0.075),然而CdCl_(2)高剂量组细胞胞浆中其相对表达水平明显升高(2.355±0.110),差异有统计学意义(P<0.001);CdCl_(2)低、高剂量组线粒体中Cytochrome c相对表达水平均明显降低(0.681±0.043、0.619±0.114),差异有统计学意义(P=0.004、0.001);细胞中cleaved Caspase-3蛋白水平升高(5.486±0.544、11.493±1.739),差异有统计学意义(P=0.004、<0.001)。结论CdCl_(2)可促进线粒体分裂,影响Cytochrome c蛋白在GC-2 spd细胞内分布并激活Caspase-3蛋白活性,引起细胞凋亡。

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对小鼠精母细胞JAZF1 mRNA及孤核受体TR4蛋白表达的影响

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)对小鼠精母(GC-2 spd)细胞JAZF1 mRNA及TR4蛋白表达的影响。方法将GC-2 spd细胞置于含终浓度为0(溶剂对照)、50、100、200μmol/L DEHP的培养液培养24 h。采用Real-time PCR方法检测细胞JAZF1 mRNA的相对表达水平,采用Western blot检测TR4蛋白表达水平。结果与对照组比较,50、100、200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞的JAZF1 mRNA表达升高,而200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞的TR4蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DEHP对生精细胞具有生殖毒性作用,可能通过JAZF1调控孤核受体TR4的表达从而影响雄性生殖功能。

微波辐射致小鼠GC-2spd细胞损伤效应研究

目的：探讨微波辐射对小鼠GC．2spd细胞的影响。方法：培养的GC-2spd细胞经平均功率密度为0、10、30mW／cm。微波辐射15min，于辐射后1-24h，应用MTF法、光镜、电镜、流式细胞术和ELISA法观测细胞增殖活力、细胞形态学和超微结构、细胞凋亡及cAMP含量的变化。结果：10、30mW／cm2微波辐射后1-24h（除30mW／cm2辐射后12h外），GC-2spd细胞增殖活力较对照组明显下降（P〈0．01或P〈0．05），光镜见部分细胞突起变短，数目减少，胞内空泡增多；辐射后6h，细胞凋亡率（％）明显增加（14．59±1．09、8．48±1．73傩4．56±2．09，P〈0．05或P〈0．01），电镜见细胞核染色质凝集边移或核膜破裂，内质网明显扩张；辐射后6h和24h，细胞内cAMP含量（nmol／g）明显降低（1．65±0．17、1．96±0．10 vs 2．77±0．24，2．13±0．33、1．69±0．27 vs 3．02±0．47，P〈0．05或P〈0．01）。结论：10和30mW／cm2微波辐射可引起GC-2spd细胞损伤，表现为细胞内cAMP含量降低，细胞增殖活力下降，细胞凋亡增加。

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对小鼠精母细胞凋亡及孤核受体TR4 mRNA表达的影响

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)对小鼠精母细胞(GC-2 spd)凋亡及TR4 mRNA表达的影响。方法将GC-2 spd细胞分别暴露于含终浓度0(溶剂对照)、50、100、200μmol/L DEHP的培养基培养24 h。采用MTT法检测细胞活性,采用Real-time PCR方法检测细胞TR4 mRNA的相对表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果与溶剂对照组比较,200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞的存活率均较低,100、200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞的凋亡率均较高,仅200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞TR4 mRNA的表达水平较高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着DEHP染毒剂量的升高,GC-2 spd细胞的存活率呈下降趋势,凋亡率呈上升趋势。结论 DEHP对生精细胞具有生殖毒性作用,可通过促进孤核受体TR4诱导生精细胞凋亡。

氧化应激介导STAT3/p53通路调控邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯诱导的小鼠初级精母细胞凋亡

目的研究氧化应激在邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(mono-2-ethylhexyl-phthalate,MEHP)诱导小鼠初级精母细胞(GC-2spd)毒性中的作用及机制。方法将培养的GC-2spd细胞分为对照组(含0.1%二甲基亚砜的无血清培养基)、MEHP染毒组(1、10、100μmol/L MEHP 3个不同剂量组)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)预处理组(100μmol/L NAC+100μmol/L MEHP),MEHP染毒24 h,NAC预处理2 h,NAC的预处理浓度(100μmol/L)通过CCK-8实验确定。采用DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(reactive oxide species,ROS)水平,JC-1法检测线粒体膜电位,Western blot法检测细胞内线粒体凋亡通路相关蛋白和p-STAT3^(Tyr705)、P53蛋白表达水平。结果随着MEHP染毒剂量升高,细胞内代表活性氧水平的绿色荧光信号增多;不同剂量MEHP染毒组的线粒体膜电位均下降,表现为红绿荧光细胞比例比值减小,10和100μmol/L MEHP染毒组的红绿荧光细胞比例比值分别为5.15±1.68和4.09±1.72,明显低于对照组(7.91±1.24)(P<0.05);促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平比值(Bax/Bcl-2)在1、10、100μmol/L MEHP染毒组分别为1.23±0.17、2.64±0.43和4.75±0.73,与对照组(0.52±0.11)相比明显增加(P<0.05);cytochrome C蛋白表达水平在100μmol/L MEHP染毒组升高为0.83±0.09,cleaved caspase-9蛋白表达水平在10和100μmol/L MEHP染毒组升高为0.41±0.03和0.52±0.09,cleaved caspase-3蛋白表达水平在10和100μmol/L MEHP染毒组升高为0.60±0.12和0.84±0.17,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05);STAT3/p53通路中,p-STAT3^(Tyr705)蛋白表达水平在10和100μmol/L MEHP染毒组分别下降为0.70±0.14和0.41±0.04,P53蛋白表达水平在10和100μmol/L MEHP染毒组分别升高为1.32±0.05和1.66±0.22,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05);NAC预处理后,与100μmol/L MEHP组相比,NAC预处理组ROS生成减少,线粒体膜电位升高为5.92±1.64,Bax/Bcl-2下降为1.92±0.06,cytochrome C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表达水平分别下降为0.57±0.07、0.35±0.04和0.53±0.06,p-STAT3^(Tyr705)蛋白表达水平升高为0.86±0.07,P53蛋白表达水平下降为1.01±0.06,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MEHP诱导GC-2spd细胞凋亡可能与ROS介导的STAT3/p53通路调控线粒体凋亡通路有关。