过表达THEM4抑制高糖诱导小鼠系膜细胞细胞外基质分泌

目的观察过表达硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily member 4,THEM4)对高糖诱导的小鼠系膜细胞细胞外基质蛋白分泌的影响。方法体外培养小鼠系膜细胞,分别给予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h后收集细胞。提取RNA,RT-PCR技术检测THEM4 mRNA的表达;提取总蛋白,Western blot法检测THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA的表达;ELISA法检测细胞上清液Ⅳ型胶原(collagenⅣ,ColⅣ)、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)的分泌情况。为进一步检测过表达THEM4对高糖诱导的细胞外基质沉积的影响及可能机制,将常规培养的系膜细胞随机分为正常对照组(5.5mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、高糖+p Yr-ads-4-THEM4质粒转染组(高糖+THEM4组)、高糖+p Yr-adshuttle-4空质粒对照组(高糖+V组)。后3组经高糖刺激48 h后终止培养并进行上述检测。结果随着高糖刺激时间的延长,小鼠系膜细胞THEM4表达呈下降趋势,phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA的表达增强,伴随细胞外基质蛋白(包括ColⅣ、FN)的分泌增加;过表达THEM4能逆转高糖刺激所导致小鼠系膜细胞Akt蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1的表达,抑制细胞外基质蛋白(包括ColⅣ、FN)的分泌。结论过表达THEM4能降低高糖诱导的小鼠系膜细胞细胞外基质蛋白的分泌,可能是通过抑制Akt蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1表达而实现。

SRT1720对高糖诱导的小鼠系膜细胞凋亡的影响

目的观察Sirt1激活剂SRT1720对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡的作用。方法体外培养小鼠肾小球系膜细胞,随机分为正常糖组、正常糖+甘露醇组、高糖组及高糖+SRT1720组。采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)及流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术检测活性氧簇(ROS)产生;Western blot检测caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p38 MAPK、p-p38 MAPK、Sirt1、p53、乙酰化p53及细胞色素C的表达;实时定量PCR检测Bax和Bcl-2 mRNA的表达。结果与正常糖对照组相比,高糖组系膜细胞ROS产生和细胞凋亡明显增加,cleaved caspase-3、p-p38 MAPK和乙酰化p53表达增高、Bax/Bcl-2比率明显升高、Sirt1表达下降以及细胞色素C易位。SRT1720干预能够明显抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡和ROS产生;下调cleaved caspase-3、乙酰化p53和p-p38 MAPK的表达;上调Sirt1的表达;减少Bax/Bcl-2比率和细胞色素C易位。结论SRT1720能够抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡,可能是通过减少ROS产生、保护线粒体功能、抑制p53乙酰化以及p38MAPK信号通路激活而实现的。

甘草酸通过下调缺氧诱导因子-1α抑制小鼠肾小球系膜细胞炎症因子的表达

背景甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)在糖尿病肾病保护领域取得了很大进展。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与糖尿病肾病的发生密切相关,甘草酸与HIF-1α在糖尿病肾病中的作用机制仍有待探索。目的探讨甘草酸是否可通过影响HIF-1α的表达而抑制高糖条件下肾小球系膜细胞(SV40 MES13)炎症因子水平,为糖尿病肾病的治疗提供实验依据。方法培养小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13),分为正常组(NG 5.6 mmol/L)、高糖组(HG 30 mmol/L)、高糖+甘草酸组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L)。Western blot方法检测各分组细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白因子的表达水平,免疫荧光方法检测各分组HIF-1α、VEGF在细胞内的表达。将细胞按照正常组(NG 5.6 mmol/L)、高糖组(HG 30 mmol/L)、高糖+甘草酸组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L)、高糖+KC7F2组(HG 30 mmol/L+KC7F27.5μmol/L)、高糖+甘草酸+KC7F2组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L+KC7F27.5μmol/L)、高糖+DMOG组(HG 30 mmol/L+DMOG 25μmol/L)、高糖+甘草酸+DMOG组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L+DMOG 25μmol/L)进行培养(48 h),CCK-8检测细胞增殖水平,Western blot和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同分组细胞白细胞介素(interleukin,IL)-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的表达。结果Western blot、免疫荧光方法实验结果表明,甘草酸能够抑制高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13)HIF-1α、VEGF蛋白因子的表达。CCK-8实验表明,HIF-1α的上调促进了小鼠肾小球细胞的增殖,甘草酸能够进一步抑制激活剂DMOG所诱导的细胞增殖水平,并且也能够协同抑制剂KC7F2进一步抑制肾小球系膜细胞的增殖。Western blot实验结果表明,甘草酸能显著抑制DMOG诱导的HIF-1α、VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8蛋白因子的高表达(P<0.05),也能够联合KC7F2抑制HIF-1α、VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的表达(P<0.05),酶联免疫吸附实验(ELISA)得到同样的结果。结论甘草酸通过下调HIF-1α的表达而抑制高糖条件下肾小球系膜细胞(SV40 MES13)炎症因子的表达。

HMGB1/SREBP-1参与IFN-γ介导的小鼠肾小球系膜细胞内的脂质沉积

目的:探讨γ-干扰素(IFN-γ)诱导小鼠系膜细胞内脂质沉积的可能机制。方法:常规培养的小鼠系膜细胞(MMC)分为正常对照组、刺激组、刺激+空质粒组(sh-HMGB1)和刺激+质粒组(sh-SREBP-1);油红O染色观察细胞内脂质沉积;RT-PCR检测HMGB1、SREBP-1和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表达;Wesern blot检测蛋白表达。结果:油红O检测显示IFN-γ刺激组MMC细胞中出现明显脂滴;IFN-γ刺激能够上调HMGB、SREBP-1和FASmRNA及蛋白表达;沉默HMGB1能够降低IFN-γ诱导的SREBP-1和FAS上调,并减少细胞内脂质沉积;沉默SREBP-1能够减少HMGB诱导的MMC细胞内脂质沉积。结论:IFN-γ可能通过上调HMGB/SREBP-1/FAS的表达促进小鼠系膜细胞内脂滴沉积。

抗氧化肽SS-31对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的观察抗氧化肽SS-31对高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响。方法将体外培养小鼠肾小球系膜细胞分为正常糖组、正常糖+甘露醇组、高糖组及高糖+SS-31组。采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)及流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞ROS水平;Western blot检测caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p38 MAPK、p-p38 MAPK及细胞色素C的表达。结果与正常糖组相比,高糖组系膜细胞ROS产生和细胞凋亡明显增加,cleavedcaspase-3和p-p38 MAPK表达增高,Bax/Bcl-2比率明显升高以及细胞色素C易位。SS-31干预能够明显抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡和ROS产生,下调cleaved caspase-3和p-p38 MAPK的表达,减少Bax/Bcl-2比率和细胞色素C易位。结论 SS-31能够抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡可能是通过减少ROS产生,保护线粒体功能,抑制p38MAPK信号通路激活而实现的。

γ干扰素诱导小鼠肾小球系膜细胞表达IP-10及其机制研究

目的探讨γ干扰素对小鼠肾小球系膜细胞(MMC)表达γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)的影响及其机制。方法将MMC随机分为空白组、γ干扰素刺激组、α-氰基-(3,4-羟基)-N-苄苯乙烯胺(AG490)干预组,运用实时荧光定量PCR检测IP-10 mRNA相对表达量;酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清液中IP-10蛋白分泌量;蛋白质印迹法检测JAK/STAT1信号通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1及其磷酸化蛋白p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1表达情况。结果γ干扰素刺激MMC后IP-10 mRNA及蛋白分泌量明显增多(P<0.01),并呈浓度、时间依赖性;AG490干预后,与刺激组相比,IP-10 mRNA相对表达量下降了81.16%(P<0.01),IP-10蛋白分泌量下降了91.81%(P<0.01);γ干扰素刺激后p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1蛋白表达明显增加(P<0.01),经AG490干预后p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1蛋白表达减少(P<0.01)。结论γ干扰素通过激活JAK/STAT1信号通路诱导MMC表达IP-10;抑制JAK/STAT1信号通路对减少MMC表达IP-10具有重要意义。

复方鱼腥草提取物不同组分对高糖培养小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:比较复方鱼腥草提取物挥发油组分、水提组分、醇提组分和总提取物对高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。方法:高糖条件下培养小鼠肾小球系膜细胞,分成复方鱼腥草挥发油组分、水提组分、醇提组分和总提取物4个药物组,各组给药浓度均为1. 0、2. 0、4. 0、8. 0、16. 0、32. 0、64. 0、128. 0mg/L,给药24 h后以MTT法测定复方鱼腥草提取物对小鼠肾小球系膜细胞增殖的抑制作用。结果:复方鱼腥草不同提取物对高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞的增殖均具有抑制作用,其抑制效果具有浓度依赖性;以Graph Pad Prism 5计算得挥发油组分IC_(50)为124. 9 mg/L,水提组分IC_(50)为37. 8 mg/L,醇提组分IC_(50)为44. 6 mg/L,总提取物IC_(50)为27. 7 mg/L。结论:复方鱼腥草提取物不同组分对高糖培养肾小球系膜细胞增殖均具有抑制作用,总提取物效果最明显。

肉桂酰雷公藤内酯醇通过抑制核因子κB (NF-κB)通路下调小鼠肾小球系膜细胞IP-10表达并抑制其增殖

目的 探讨肉桂酰雷公藤内酯醇(T32)对γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)在SV40MES13小鼠肾小球系膜细胞表达及促增殖作用的影响。方法 采用(2~30)ng/mL T32和(1~500)ng/mL IP-10与SV40MES13细胞共培养24 h,利用CCK-8法检测细胞生存率确定T32和IP-10最佳处理剂量;将对数生长期的SV40MES13细胞随机分为空白组、 1000 U/mLγ干扰素(IFN-γ)刺激组、 IFN-γ联合10μmol/L吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干预组和IFN-γ联合(2~20)ng/mL T32干预组。IFN-γ刺激24 h后,通过实时荧光定量PCR检测SV40MES13细胞IP-10 mRNA水平,ELISA检测SV40MES13细胞培养上清液IP-10分泌量;IFN-γ刺激20 min后,应用Western blot法检测SV40MES13细胞核因子κB (NF-κB)信号通路相关蛋白核因子κB p65(NF-κB p65)、核因子κB抑制物α(IκBα)及其磷酸化蛋白p-NF-κB p65、 p-IκBα的表达。结果 IFN-γ刺激可促进SV40MES13细胞IP-10 mRNA和蛋白表达增加,与空白组相比,NF-κB p65、 IκBα蛋白的磷酸化水平明显增加。采用特异性通路抑制剂PDTC阻断NF-κB信号通路后,与IFN-γ刺激组相比,SV40MES13细胞IP-10 mRNA和蛋白表达明显降低,NF-κB p65、 IκBα蛋白磷酸化水平下降。与IFN-γ刺激组相比,经(2~20)ng/mL T32干预后,SV40MES13细胞IP-10 mRNA和蛋白表达明显降低,NF-κB p65、 IκBα蛋白磷酸化水平分别下降44.22%和48.59%。(1~500)ng/mL IP-10与SV40MES13细胞共同孵育24 h后,细胞生存率提高,IP-10剂量为10 ng/mL时细胞生存率为119.83%,随后进入平台期;经(4~20)ng/mL T32干预后,细胞生存率与10 ng/mL IP-10刺激组相比明显降低。结论 IFN-γ诱导SV40MES13细胞表达IP-10的作用可被肉桂酰雷公藤内酯醇通过阻断NF-κB信号通路而下调,并抑制IP-10的促增殖作用。

雷公藤内酯醇抑制小鼠肾小球系膜细胞表达IP-10及其机制研究

目的探讨雷公藤内酯醇(TPL)对γ干扰素(IFN-γ)诱导的小鼠肾小球系膜细胞(MMC)表达γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)的影响及其调控机制,为TPL应用于狼疮肾炎的治疗奠定理论基础、提供实验数据。方法将MMC随机分为空白组、IFN-γ刺激组、TPL干预组,用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测各组中IP-10 m RNA相对表达量;用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中IP-10分泌量;用蛋白印迹法(Western blot)检测各组中JAK/STAT1信号通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1及其磷酸化蛋白p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1,以及IFN-γ受体(IFN-γRβ)和JAK/STAT1信号通路负反馈调节蛋白SOCS1的表达情况。结果 1)MMC经不同质量浓度(2、4、8、10 ng/ml)TPL预处理2 h后再加入IFN-γ共同作用24 h,IP-10 m RNA相对表达量与刺激组相比分别下降45.35%、65.40%、89.76%和94.72%(P均<0.01);IP-10蛋白分泌量分别下降了5.21%(P=0.531)、54.70%(P<0.01)、87.17%(P<0.01)和92.45%(P<0.01)。2)MMC经TPL预处理40 min后再加入IFN-γ共同作用20 min,JAK1、JAK2、STAT1蛋白磷酸化水平与刺激组相比明显降低(PJAK1<0.01、PJAK2<0.01和PSTAT1<0.05)。3)MMC经IFN-γ刺激后,IFN-γRβ蛋白表达水平与空白组相比明显增加(P<0.01);经TPL干预后,IFN-γRβ蛋白表达水平与刺激组相比明显减少(P<0.01)。4)IFN-γ刺激MMC后,SOCS1蛋白表达水平与空白组相比小幅升高(P<0.05);而经TPL刺激后,SOCS1蛋白表达与刺激组相比明显增加(P<0.01)。结论 TPL可能通过抑制JAK/STAT1信号通路,从而下调IFN-γ诱导的MMC表达IP-10;抑制IP-10表达,减轻或阻止炎症反应,有望成为TPL治疗狼疮肾炎的新靶点。

敲低periostin对PDGF引起的系膜细胞增殖和细胞外基质表达的影响

目的 观察敲低periostin对PDGF引起的系膜细胞增殖和细胞外基质表达的影响。方法 体外培养小鼠系膜细胞,细胞以10 μg·L -1 PDGF刺激,分别于刺激0、2、4、6、12 h时收集细胞,Western blot检测periostin、PCNA、FN、TGF-β1蛋白的表达水平;细胞免疫荧光检测periostin蛋白表达和定位。另外,细胞随机分为control组、PDGF组、PDGF+空质粒转染(PDGF+sh-nc)组和PDGF+periostin沉默质粒(PDGF+sh-periostin)组,后3组以10 μg·L -1 PDGF孵育6 h后终止培养,Western blot检测periostin、PCNA、FN、TGF-β1表达水平。结果 PDGF上调periostin蛋白表达,6 h达到高峰,12 h明显回落;细胞免疫荧光检测结果显示,PDGF刺激下periostin在胞质表达明显增强。PDGF可导致PCNA、FN、TGF-β1表达增强。periostin沉默质粒能够抑制PDGF引起的系膜细胞增殖和细胞外基质表达,下调PCNA、FN、TGF-β1蛋白表达。结论 PDGF诱导periostin在体外培养的小鼠系膜细胞表达增加,并上调系膜细胞增殖水平和细胞外基质表达水平。periostin沉默质粒部分逆转PDGF引起的系膜细胞增殖和FN、TGF-β1蛋白表达。

FTO对小鼠肾小球系膜细胞m6A修饰及增殖能力的影响

目的:构建表达脂肪与肥胖相关(fat mass and obesity associated,FTO)基因的重组质粒,并检测其对小鼠肾小球系膜细胞(mice mesangial cell,MMC)N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰及增殖能力的影响。方法:PCR法扩增FTO基因片段,并将其插入表达载体pCMV-MCS-EGFP质粒中以构建重组质粒pCMV-FTO。将目的质粒pCMV-FTO及对照质粒pCMV分别转染MMC,采用qRT-PCR法检测FTO mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测细胞FTO蛋白和相关增殖标志物的表达,CCK8法检测细胞增殖,m6A RNA甲基化定量试剂盒检测m6A含量。结果:菌落PCR鉴定以及测序结果证实重组质粒pCMV-FTO构建成功。RT-qPCR及蛋白印迹结果显示转染目的质粒pCMV-FTO后FTO表达明显增加。过表达FTO后,m6A含量、细胞增殖水平及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白水平均显著下降。结论:FTO可以降低MMC中m6A修饰水平及抑制细胞增殖。

过表达羧肽酶E对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和凋亡的影响

目的:探究羧肽酶E(carboxypeptidase E,CPE)对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)增殖、周期及凋亡的影响。方法:PCR法扩增CPE基因片段,将其插入表达载体pcDNA3.1质粒中以构建重组质粒pcDNA3.1-CPE。将质粒转染GMC细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测CPE标签蛋白、增殖标志物细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及凋亡标记物Cleaved-caspase-3的表达;采用平板克隆、Cell Counting Kit-8(CCK-8)法以及流式分析法检测过表达CPE对高糖培养的GMC细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响。结果:成功构建CPE过表达的GMC细胞。平板克隆以及CCK-8实验表明,过表达CPE可以抑制GMC细胞的增殖能力。流式细胞学检测表明,与对照组相比,CPE过表达明显促进了细胞凋亡;细胞周期中G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:过表达CPE可以抑制高糖培养的小鼠GMC细胞增殖并诱导细胞凋亡。

和厚朴酚通过miR-155靶向Smad3抑制高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的机制

目的研究和厚朴酚对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞(MGMC)凋亡的影响及分子作用机制。方法qRT-PCR检测miR-155、Smad3 mRNA的表达,Western印迹检测Smad3蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,双萤光素酶报告系统验证miR-155与Smad3的调控关系。结果和厚朴酚可以抑制高糖诱导的MGMC凋亡,40μmol/L和厚朴酚抑制细胞凋亡效果最佳;和厚朴酚可以逆转高糖导致的MGMC中miR-155下调及Smad3上调;过表达miR-155和沉默Smad3均可减轻高糖对MGMC的促凋亡作用;双萤光素酶报告系统结果表明,miR-155对Smad3的表达具有靶向负调控作用;下调miR-155可逆转和厚朴酚对高糖诱导的MGMC凋亡的抑制作用,抑制Smad3逆转了下调miR-155对和厚朴酚的抑制作用。结论和厚朴酚通过miR-155靶向抑制Smad3表达,进而抑制高糖诱导的MGMC凋亡。

归芪定年方通过调节JAK2/STAT通路活性延缓小鼠肾系膜细胞衰老

目的:探讨归芪定年方(GDP)对D-半乳糖(D-gal)诱导致衰型小鼠肾系膜细胞中Janus酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子(STAT)信号通路相关分子表达水平的影响。方法:以D-gal 10 g·L^(-1)诱导复制小鼠肾系膜细胞衰老模型,经GDP 40 mg·L-1水煎剂处理3 d后,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色测定细胞衰老状态,流式细胞术检测细胞周期,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测细胞存活率,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6),核转录因子-κB(NF-κB)和白细胞介素-1α(IL-1α)m RNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定细胞中JAK2/STAT信号通路相关分子STAT1,磷酸化STAT1(p-STAT1),STAT3,p-STAT3蛋白水平。结果:CCK-8结果显示GDP最佳药物质量浓度为40 mg·L^(-1)。与空白组比较,模型组SA-β-gal细胞阳性率显著升高(P<0.01),G0/G1期细胞百分数明显升高(P<0.05),G2/M期和S期细胞百分数显著降低(P<0.01),TNF-α,IL-6,NF-κB和IL-1αm RNA表达水平显著上调(P<0.01),STAT1,p-STAT1,STAT3和p-STAT3蛋白水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,模型+GDP组SA-β-gal细胞阳性率明显降低(P<0.05),G0/G1期百分数明显降低(P<0.05),G2/M期和S期细胞百分数显著增加(P<0.01),TNF-α,IL-6,NF-κB和IL-1αm RNA表达水平明显下调(P<0.05),STAT1,p-STAT1,STAT3和p-STAT3蛋白水平明显降低(P<0.05)。结论:GDP可延缓小鼠肾系膜细胞衰老的进程,其作用机制可能与下调细胞JAK2/STAT通路相关因子的表达水平相关。

达格列净拮抗糖尿病肾脏纤维化作用研究

目的探讨达格列净对糖尿病小鼠肾脏以及棕榈酸诱导的小鼠肾小球系膜细胞(SV40)的保护作用。方法将36只SPF级C57BL/6小鼠随机分为正常组、糖尿病组、达格列净组,体外培养SV40并分为正常组、棕榈酸组、正常对照组、棕榈酸+达格列净组。Masson染色检测小鼠肾脏组织中肌纤维与胶原纤维表达情况,Western blot检测小鼠肾脏组织与SV40中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白表达,qPCR检测小鼠肾脏组织与SV40中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA含量变化,CCK-8法检测SV40增殖水平。结果达格列净可明显改善糖尿病小鼠肾脏纤维化,抑制SV40细胞增殖,降低糖尿病小鼠肾脏组织与SV40中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1与α-SMA表达。结论达格列净通过减少胶原沉积,下调TGF-β1与α-SMA,发挥对糖尿病肾脏纤维化的保护机制。

基于网络药理学探讨益肾通络方治疗糖尿病肾脏疾病的药效作用机制及关键调控通路的验证

目的探讨益肾通络方治疗糖尿病肾脏疾病(DKD)的活性成分、作用靶点及可能的药效作用机制。方法利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、中医药百科全书数据库(ETCM)和BATMAN-TCM数据库筛选得到益肾通络方的有效成分及相关作用靶点,通过文献检索对上述化学成分和作用靶点信息进行补充,进一步与GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库、DrugBank数据库中与DKD有关的靶点信息进行关联。基于String 11.0软件构建的蛋白相互作用(PPI)网络,得到与益肾通络方中主要活性成分相对应的关键靶点,运用cytoscape 3.8.0构建“成分-疾病-靶点”中药复方调控网络图,初步预测益肾通络方治疗DKD的药效作用机制。同时利用R语言BioConductor与pathview软件进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,揭示相关靶基因和通路的功能。以高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞(SV40-MES-13)为主要研究对象,采用荧光素酶报告基因检测、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹检测研究益肾通络方对关键靶基因表达及相关通路调控作用的影响,对其药效作用机制进行验证。结果筛选得到益肾通络方中108个具有潜在DKD治疗作用的活性成分及相对应的417个作用靶点。“成分-疾病-靶点”网络图提示山柰酚、黄芪甲苷等是益肾通络方中发挥DKD治疗作用的主要活性成分,蛋白激酶(Akt)、白细胞介素-6(IL-6)等是上述化学成分作用的关键靶点。GO功能注释及KEGG通路富集结果表明,筛选所得关键靶点主要涉及药物免疫反应、氧化应激反应、炎症反应、信号转导等一系列生物学反应过程,主要参与晚期糖基化终末产物及其受体(AGE-RAGE)、PI3K/Akt等信号通路的调控。实验结果表明,益肾通络方有效改善高糖诱导SV40-MES-13细胞中炎症相关指标TNF-α、IL-6以及纤维化相关指标TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ等的激活(P<0.05)。结论益肾通络方对DKD的治疗具有多成分、多靶点、多途径的特点,其可能通过调控AGE-RAGE、PI3K/Akt信号通路,抑制炎症反应及肾脏组织纤维化发挥治疗DKD的作用。