实验小鼠细小病毒(MMV)抗体的实验室检测能力验证结果评价

目的通过实验小鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)抗体检测能力验证实施计划,了解我国实验动物检测机构的检验能力,促进实验动物质量检测水平的提高。方法按照CNAS批准的能力验证方案,血清经过标定后,经过稳定性和均匀性等检验合格,作为能力验证样本。对血清样本采用随机编号形式发放给能力验证参加单位,并附作业指导书。本次能力验证为定性检测,检测方法采用ELISA方法。要求参加单位在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,满意结果为样品的检测结果与预检结果一致,不满意结果为样品检测结果与预检结果不一致或参加单位未反馈结果。结果样本血清均匀性试验和稳定性试验结果显示,样本均符合能力验证样本均匀性和稳定性要求。本次能力验证共有19个省市的33个实验动物检测机构报名参加。33个检测机构均提交了满意结果,满意度为100%。结论实施此次能力验证计划能够反映我国实验动物检测实验室的检测能力和水平,我国实验动物质量检测机构对实验小鼠细小病毒(MMV)抗体检测的能力较高。

小鼠细小病毒NS1蛋白的原核表达、多克隆抗体制备及其免疫原性评价

【目的】通过原核表达系统表达小鼠细小病毒(Minute virus of mice,MVM)的非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1),并制备其多克隆抗体,为MVM NS1蛋白生物学功能研究及相关检测方法的建立提供研究材料。【方法】通过同源重组将MVM NS 1基因与质粒pET-N-His-C-His进行连接构建重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过不同诱导条件筛选并纯化出无需复性的可溶性蛋白。将纯化后的重组蛋白NS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,通过间接ELISA法测定抗体效价。采用Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组蛋白的表达及免疫原性。【结果】SDS-PAGE分析显示,诱导表达的重组蛋白大小为76 ku,在诱导剂(IPTG)浓度为0.6 mmol/L、诱导温度为28℃条件下表达效果最佳。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶32000。Western blotting和IFA检测结果显示,制备的NS1多克隆抗体可与NS1蛋白及MVM特异性结合。【结论】本研究成功表达并纯化获得MVM NS1重组蛋白,并制备了免疫原性良好的多克隆抗体,为进一步研究NS1蛋白生物学功能及其在MVM复制感染机制中的作用、MVM临床诊断方法的建立奠定了基础。

小鼠感染细小病毒的临床特征分析

目的分析小鼠细小病毒(MVM)在人工感染小鼠体内的分布规律、排毒和抗体变化,以及自然条件下小鼠感染MVM的情况。方法对33只BALB/c小鼠腹腔接种0.2 m L MVM悬浮液,每天观察动物的外观、行为、饮食和精神状态,在接种第0~60天共12个时间点各对2~3只动物进行安乐死,并采取组织、粪便和血清样本进行检测。荧光定量PCR(QPCR)方法检测组织和粪便的病毒核酸,ELISA方法检测血清抗体。同时,采取100只SPF小鼠、76只开放饲养小鼠检测MVM核酸,采取1463只SPF小鼠、82只开放饲养小鼠检测MVM抗体。结果实验小鼠接种MVM后外观、行为、饮食和精神状态未见异常,剖检无明显病变。各组织在接种后都能检出病毒核酸,并在接种后4~7 d达到峰值,且到60 d仍可检出病毒核酸。各组织间比较,病毒峰值最高的组织是肝,其次是肾、脾、胃、心脏、肺、盲肠和脑。粪便排毒在接种后11 d可达到峰值,之后迅速下降,但到60 d还可检到。血清抗体在病毒接种后7 d开始产生,之后抗体效价逐渐升高,21 d就可以达到32倍左右,之后至60 d一直处于64倍左右。临床样本中,核酸检测SPF小鼠未检出,开放饲养小鼠的检测阳性率为14.5%,经过测序比较确认为MVM病毒感染;抗体检测SPF小鼠有较低的检出率(0.3%),开放饲养小鼠检出率为68.3%。结论 MVM感染小鼠后一般呈隐性感染状态,可长期排毒,主要组织脏器、粪便、血清都能用于MVM的检测,实验小鼠感染MVM可以通过病毒核酸和血清抗体检测方法进行病原检测。

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为10~9~10~4拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。

小鼠细小病毒抗体的检测

小鼠细小病毒(MVM)普遍存在于开放饲养的实验小鼠群中,呈隐性感染状态,在某些条件下,可诱发此病,以致影响实验结果。由于小鼠呈隐性感染时,无临床症状,也无病理形态学的改变,很难分离到病毒,所以血清抗体的检测在诊断上有着重要的意义。我们采用血凝抑制试验(HAI)、免疫荧光(IFA)和酶免疫吸附试验(ELISA)方法来检测开放鼠群中的MVM抗体。材料和方法一、MVM标准株:由中国医学科学院医学实验动物研究所提供。二、MVM抗原的制备: 1.

细小病毒 H-1 抗肿瘤的实验研究——(Ⅱ)对原位裸小鼠肝癌 HCC-93

细小病毒Ｈ┐１抗肿瘤的实验研究——（Ⅱ）对原位裸小鼠肝癌ＨＣＣ┐９３范竹萍１萧树东１童菊芳１陈陵际２张素胤关键词细小病毒ＰＶＨ┐１肝癌ＨＣＣ┐９３／动物实验作者单位：１．上海消化疾病研究所（２００００１）２．中科院药物所细小病毒Ｈ－１（Ｐａｒｖｏｖｉ...

细菌DNA对小鼠接种犬细小病毒灭活苗的免疫增强效果

用大肠杆菌 DNA、弗氏佐剂、铝胶、蜂胶等不同佐剂 ,与犬细小病毒灭活疫苗配合免疫小鼠 ,以血凝抑制试验检测病毒特异性血凝抑制抗体。结果表明 ,各佐剂均能增强特异性抗体的产生 ,经组间单因素相关性分析 ,细菌 DNA与弗氏佐剂的免疫增强效果明显高于铝胶与蜂胶 (P <0 .0 5或 P <0 .0 1)。细菌 DNA具有强烈免疫刺激作用、无不良反应等特性 。

小鼠细小病毒非结构基因转基因小鼠的建立

为探讨小鼠细小病毒（ＭＶＭ）非结构蛋白在ＭＶＭ感染中的抗肿瘤作用，酶切表达质粒ｐＵＬＢ３２３８获取该非结构基因，通过显微注射法接种入小鼠受精卵内制备转基因鼠。共注射受精卵７２０枚，选取存活受精卵２２５枚植入假孕小鼠输卵管，产仔１４只。转基因小鼠尾部组织ＰＣＲ法ＤＮＡ检测证明，其中４只整合靶基因。整合转基因的４只Ｇ０代小鼠与正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠配种均可生产整合靶基因的小鼠。ＲＴ－ＰＣＲ法ｍＲＮＡ检测证明，Ｇ０Ａ６转基因鼠的肺、乳腺、颌下腺组织，Ｇ０Ａ１３转基因鼠的乳腺组织有靶基因转录。这一结果表明，ＭＶＭ非结构基因转基因小鼠模型已建立。

三种小鼠肠道病毒多重PCR检测方法的建立和初步应用

目的建立一种同时检测小鼠细小病毒(MVM)、肝炎病毒(MHV)和诺如病毒(MNV)的多重PCR检测方法。方法分别根据MVM、MHV和MNV基因保守区应用软件设计特异性引物,构建在同一反应体系中可同时检测MVM、MHV和MNV的多重PCR检测方法,验证其特异性、敏感性及重复性,并进行初步检测应用。结果通过优化PCR扩增条件成功建立多重PCR检测方法,特异性实验结果表明,该方法可同时扩增MVM、MHV和MNV的目的片段,片段大小与预期相符,未出现非特异性片段;敏感性测试显示,MVM、MHV和MNV三种病毒的最低检测下限为10^(2)、10^(4)、10^(2) copies/μL;重复性实验显示该方法在不同时间、不同场所应用的重复性稳定。应用该方法对287份小鼠结肠匀浆样品进行检测,与单重PCR检测结果完全一致。结论所建立的MVM、MHV和MNV三种病毒多重PCR检测方法具有特异性高、敏感性强和重复性优的特点,适用于三种病原体感染的临床样品检测和大量样品的流行病学调查。

小鼠细小病毒对小鼠移植瘤生长的抑制作用

据文献报道，实验动物感染细小病毒后，可增强动物抵御自发性和诱发性肿瘤的能力［１，２］。本文报告人工感染细小病毒对小鼠移植瘤影响的观察结果。１．材料与方法（１）实验动物清洁级ＢＡＬＢ／ｃ小鼠２０只，♀♂各半，６～８周龄，由山东医科大学实验动物中心提供，...

猪细小病毒HNLY201301株遗传特性及其对小鼠的致病性研究

【目的】探究猪细小病毒HNLY201301株的遗传特性及其对小鼠的致病性。【方法】对HNLY201301株进行遗传学分析、生物学分析以及小鼠攻毒试验。【结果】HNLY201301株属于经典猪细小病毒1型(PPV1),具有强毒株的遗传特性。该毒株可在猪肾(PK-15)细胞上复制,其滴度最高可达10^(-8.45)TCID_(50)/mL。该毒株的血凝谱广,能凝集小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、鸭和猪的红细胞。该毒株可通过静脉注射和阴道灌注感染小鼠,主要引起小鼠子宫损伤。【结论】细小病毒仍在我国猪场间流行,且具有较强致病性,对该病的防控应引起重视。

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白,并对其免疫原性分析。方法将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒,提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后,用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后,可成功表达MVM VP2重组蛋白,经Western blot和IFA检测分析,重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性,为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。

实时荧光多酶恒温扩增技术检测小鼠细小病毒核酸的方法建立

目的旨在建立基于实时荧光多酶恒温扩增(exo-MIRA)技术的小鼠细小病毒(MVM)核酸检测新方法。方法收集2021年1月至2022年1月南京大学医学院附属金陵医院实验动物室共75份小鼠肠道内容物标本。针对MVM VP2基因的保守区域设计4对引物,琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物以筛选最优引物对,并设计特异性荧光探针,构建exo-MIRA检测法。通过检测梯度稀释模拟样本,进行检出限评价。检测其他小鼠病毒,包括仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠鼠痘病毒(Ect)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒(Reo),分析exo-MIRA法的交叉反应性。采用qPCR法和exo-MIRA法同时检测收集的75份标本,统计分析两种方法的一致性。以qPCR法为参比方法,评估该法的敏感度和特异度,进行诊断效能评价。结果采用exo-MIRA技术建立MVM核酸检测方法,该方法检测MVM的检出限为10 copies/μL,且与其他五种小鼠病毒无交叉反应,可特异性检出MVM。75份标本检出结果显示,exo-MIRA法和qPCR法高度一致,Kappa值为0.921(P<0.05),exo-MIRA法的敏感度为100.0%,特异度为96.7%。结论建立了一种基于实时荧光MIRA恒温扩增技术的MVM核酸检测方法,具有简单快速、实验要求低、敏感特异等优点。该方法可应用于现场复杂环境的即时检测,在实验动物质量检测应用上有一定前景。

分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将猪细小病毒(PPV)免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP_2/O细胞在聚乙二醇作用下融合,用血凝抑制试验(HI)筛选,以有限稀释法克隆3次,得到5株分泌抗PPV单克隆抗体(McAb),选择抗体分泌较高的4F_4、A_4或E_8进行较详细的研究,结果表明,其核内染色体数为93和87,抗体属性为IgG_1,其中1株为K轻链,用交叉HI法对2株McAb作特异性分析,该McAb只特异地与PPV发生反应,而不与日本乙型脑炎(JEV)、犬细小病毒(CPV-b)发生反应,将其中3株杂交瘤细胞注射BALB/C小鼠,抗体HI效价介于1:256～1:10240之间。

五种国产与进口小鼠病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

目的评价国产小鼠病毒抗体ELISA检测试剂盒。方法选择国产与进口小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、肝炎病毒(MHV)、仙台病毒(SV)、腺病毒(MAV)、细小病毒(MPV)ELISA抗体检测试剂盒,进行敏感性、特异性、精密性、稳定性、可信度试验比较。结果国产与进口试剂盒:同种试剂盒之间灵敏度相差最低为2倍,差异显著(P<0.05),最高为16倍,差异极显著(P<0.01);特异性试验显示每种试剂盒,与其他4种病毒均无交叉反应;精密性试验显示5种试剂盒批内平均变异系数均小于10%;稳定性试验显示5种试剂盒相对偏差均小于25%;分别选择已知36份小鼠血清进行检测,国产和进口LCMV、MHV、SV、MPV符合率均为100%;国产MAV符合率为86.1%,进口MAV符合率均为100%,二者之间差异极显著(P<0.01)。结论除国产MAV试剂盒敏感性、可信度低于进口外,国产LCMV、MHV、SV、MPV试剂盒与进口同种试剂盒相比,在敏感性、特异性、精密性、稳定性和可信度方面均良好。

抗小鼠白血病病毒单克隆抗体的研制及其初步应用

用密度梯度离心提纯的小鼠白血病病毒（ＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ，ＭｕＬｖ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，采用杂交瘤技术获得６株分泌抗ＭｕＬｖ单克隆抗体的杂交瘤细胞。经检测，它们所分泌的抗体类型分别为ＩｇＭ（Ｆ１０，Ｄ６，Ｃ１２，Ａ８）和ＩｇＧ１（Ａ９．Ｂ６）。腹水效价为１０－３～１０－５。相对亲和力分别为１．２５ｕｇ／ｍｌ（Ｆ１０），１．３０μｇ／ｍｌ（Ｄ６），１．２０μｇ／ｍｌ（Ｃ１２），１．０μｇ／ｍｌ（Ａ８），０．０７μｇ／ｍｌ（Ａ９），０．００１μｇ／ｍｌ（Ｂ６）．Ｆ１０，Ｄ６，Ｃ１２，和Ａ８能识别相同或相近的抗原表位，Ａ９和Ｂ６识别不同的抗原位点。特异性测定结果表明：６株ＭｃＡｂ与１１种鼠源性病毒抗原脑膜炎病毒（ＬＣＭ）；流行性出血热病毒（ＥＨＦ）；鼠痘病毒（Ｅｃｔ．）；鼠肝炎病毒（ＭＨＶ）；仙台病毒（Ｓｅｎｄａｉ），呼肠孤病毒（Ｒｅｏ３）；鼠肺炎病毒（ＰＶＭ）；细小病毒（ＭＶＭ）；鼠腺病毒（ＭＡｄ）；多瘤病毒（Ｐｏｌｙｏｍａ），脑脊髓炎病毒（ＧＤＶＩＩ）均无反应。将ＭｕＬｖ ＭｃＡｂ标记荧光素应用于实际检测，取得较好的实验结果。

犬细小病毒单克隆抗体在临床上的应用

1 犬细小病毒单克隆抗体的应用 犬细小病毒单克隆抗体是利用细胞融合技术，将犬细小病毒免疫的BALB／C小鼠脾细胞与SP2／0瘤细胞融合。制备出能分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从中培养筛选出特异性的杂交瘤细胞，接种生物反应器进行连续罐流培养，经浓缩纯化后制备的高效特异性抗体，即为治疗和预防犬细小病毒的单克隆抗体制剂。与高免血清相比，单克隆抗体具有质地均一，纯度高，特异性强，效价高，又能大量、快速、连续和无限地生产等优点。

抗肺肿瘤转基因小鼠模型的建立

目的建立抗肿瘤转基因小鼠模型。方法用ＢａｍＨＩ酶切表达质粒ｐＵＬＢ３２３８获取小鼠细小病毒非结构基因，通过显微注射法将其接种入小鼠受精卵内制备转基因小鼠。转基因鼠尾部组织ＤＮＡ以ＰＣＲ检测靶基因整合；整合转基因的Ｇ０Ａ６小鼠与正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠配种所产Ｇ１代转基因鼠，通过ＲＴ┐ＰＣＲ检测目的基因在其肺脏等组织的转录；Ｇ１代鼠根据ＰＣＲ检测结果分整合和未整合非结构基因两组，两组均腹腔注射致肺肿瘤化学致癌剂氨基甲酸乙酯水溶液。结果Ｇ０代有４只鼠整合靶基因；Ｇ１代（Ｇ０Ａ６子代）转基因鼠的肺组织有靶基因转录；Ｇ１代整合转基因实验组小鼠被诱导肺瘤结节平均数显著少于未整合转基因的对照组（Ｐ＜０．０１）。结论抗肺肿瘤转基因小鼠模型已建立。

原位杂交检测鹅细小病毒VP3基因方法建立及肌注VP3基因疫苗在小鼠体内的动态分布

将100μgpcDNA-GPV-VP3基因疫苗肌肉注射4周龄BALB/c小鼠,并以生理盐水和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,建立并应用寡核苷酸探针原位杂交方法检测pcDNA-GPV-VP3在免疫小鼠各组织器官(心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、免疫部位肌肉)的动态分布规律。结果表明,所建立的原位杂交方法具有特异性强、敏感性高、定位准确等特点,能检测约13pg的同源DNA。pcDNA-GPV-VP3基因疫苗在肌注后1h可分布到除脑以外的所有组织,肌注后3h脑呈阳性,21d除脑外的其他组织仍呈阳性,105d仍能在肌注部位检测到pcDNA-GPV-VP3;pcD-NA-GPV-VP3在小鼠各组织中持续时间为肌注部位>肝>脾、心>肾>肺、肠>脑。