构建一种分离培养原代小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞改良方法

目的建立可靠稳定的小鼠肺泡Ⅱ上皮细胞(AECⅡ)的分离、原代培养技术,为进一步研究AECⅡ转分化分泌生长转化因子β1(TGF-β1)等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。方法采用传统的方法和改良后方法分别提取20只小鼠AECⅡ,将其所提取的细胞数量进行对比。结果传统组小鼠可获得(4.21±2.31)×106个,改良组小鼠可获得(13.0±2.20)×106个,差异有统计学意义(P<0.05),而两组小鼠在体质量、年龄以及肺组织重量方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论此改良方法可成功获得大量稳定的AECⅡ,为进一步研究AECⅡ转分化分泌TGF-β1等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。

PM_(2.5)处理后的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞基因表达谱变化及其功能与信号通路分析

目的应用转录组测序技术分析PM_(2.5)处理后小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的基因表达谱变化及其功能与信号通路。方法小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12分为对照组(无处理)和PM_(2.5)组(100μg/mL PM_(2.5)处理),分别处理24 h后提取两组细胞RNA进行转录组测序。所得序列经质控后,利用差异分析软件edgeR筛选出差异表达基因,使用clusterProfile软件进行差异表达基因的GO功能富集和KEGG通路富集分析。选择KEGG富集分析中化学致癌通路的10个较感兴趣的差异表达基因,采用q-PCR法检测其mRNA表达,分别计算各差异表达基因通过q-PCR法、转录组测序得到的PM_(2.5)组/对照组比值,对比q-PCR法测出的基因表达变化是否与转录组测序测出的基因表达变化一致,以验证测序的准确性。结果共筛选到1151个差异表达基因,其中下调基因688个,上调基因483个。GO功能与KEGG信号通路富集分析结果显示,差异基因主要富集在胆固醇代谢、调节趋化作用、细胞黏附、谷胱甘肽转移酶活性等功能及化学致癌性、细胞外基质—受体交互、类固醇生物合成、谷胱甘肽代谢等通路上。选择Gstt1、Gsta1、Gstm1、Gstm7、Gsta3、Gstp2、Ptgs2、Gsta4、Aldh3b1、Aldh3b2进行差异表达基因验证,其中Gsta1、Gsta3、Gsta4、Gstm1、Gstm7、Gstt1、Gstp2属于谷胱甘肽S-转移酶(GST)家族;q-PCR法检测结果与转录组测序结果均显示,Gsta1、Gsta3、Ptgs2、Gsta4、Aldh3b1、Aldh3b2表达上调,Gstt1、Gstm1、Gstm7、Gstp2表达下调,q-PCR法测得各基因表达变化均与转录组测序的趋势一致(P均<0.05)。结论PM_(2.5)可导致MLE-12细胞基因表达谱发生变化,差异基因主要富集在胆固醇代谢、谷胱甘肽转移酶活性等功能及化学致癌性、谷胱甘肽代谢等信号通路,PM_(2.5)导致细胞毒性的机制可能为通过减弱GST的解毒功能而影响化学致癌通路。

GW5074抑制高剂量小范围放射线诱导的肺泡上皮细胞间质转化

目的:评估C-Raf抑制剂GW5074对高剂量小范围放射线诱导的肺泡上皮细胞间质转化的影响。方法:观察GW5074处理对高剂量放射线引起的细胞形态学改变;细胞经GW5074处理或转染sh-Twist1后,通过Western blot检测C-Raf、p-C-Raf、Twist1、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达量。应用高剂量小范围放射线照射小鼠后,通过对损伤组织的HE染色及免疫荧光染色观察上皮间质转化现象。结果:在细胞实验中,GW5074可有效减轻高剂量放射线引起的细胞形态学变化。高剂量放射线可使C-Raf蛋白激活,且在照射后48 h的作用最强。照射前应用GW5074和sh-Twist1预处理,能使Twist1和α-SMA的表达量减少而E-cadherin的表达量增加,sh-Twist1组p-C-Raf的表达量与照射组无明显差异。在动物实验中,GW5074可有效减轻放射线造成肺损伤的程度,明显减少α-SMA并增强E-cadherin的表达。结论:GW5074可能通过抑制C-Raf/Twist1信号通路有效减轻高剂量小范围放射线诱导的肺泡上皮细胞间质转化。

参附注射液对脂多糖所致肺泡细胞损伤的保护作用

目的探讨参附注射液(SFI)对脂多糖(LPS)所致肺泡细胞损伤的保护作用及其对通透性调控相关蛋白血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、ZO-1、Claudin-5和细胞间连接黏附分子2(JAM-2)的影响。方法将MLE-12细胞分为对照组、LPS组、SFI组和SFI+LPS组。LPS组和SFI+LPS组均采用2.0μg/mL的LPS处理MLE-12细胞4 h,以制作急性脓毒症细胞模型。SFI组和SFI+LPS组均采用100μL/mL的SFI预处理2 h,对照组仅培养基培养6 h。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法测定各组细胞活力,Western-blotting检测各组细胞VE-cadherin、ZO-1、Claudin-5及JAM-2蛋白表达水平。结果4组细胞间VE-cadherin、ZO-1、Claudin-5、JAM-2蛋白表达水平及细胞活力比较,差异均有统计学意义(F=98.000、73.060、59.104、83.007、81.206,P=0.043、0.007、0.003、0.023、0.001)。进一步两两比较发现,与对照组比较,LPS组VE-cadherin、ZO-1、Claudin-5、JAM-2蛋白表达水平和细胞活力均显著降低,SFI组上述蛋白表达水平均显著升高;与LPS组比较,SFI和SFI+LPS组VE-cadherin、ZO-1、Claudin-5、JAM-2蛋白表达水平和细胞活力均显著升高,且SFI组更高(P均<0.05)。结论SFI能减轻LPS所致的小鼠肺泡上皮细胞中膜通透性调控相关蛋白表达的下调作用,对LPS所致的肺泡通透性增加效应有一定的治疗作用。

应用iTRAQ技术对动式染尘矽肺大鼠肺组织差异蛋白的定量分析

目的筛选动式染尘矽肺大鼠肺组织差异蛋白并在动物体内及体外中验证,以期为矽肺早期诊断及相关机制研究提供新思路。方法构建动式染尘矽肺大鼠动物模型,采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术联合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-trandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术筛选肺组织中的差异蛋白。免疫印迹试验检测差异蛋白在动物模型肺组织和SiO2诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中的表达。结果共得到471个差异蛋白,其中252个上调蛋白,219个下调蛋白。差异倍数>1.5,共有28种差异表达蛋白,其中上调差异蛋白20种。在动物模型肺组织及SiO2诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中Factor B、PTPN2、VRK1和MOT4蛋白表达上调,差异均具有统计学意义(均有P<0.05)。结论差异蛋白Factor B、PTPN2、VRK1和MOT4蛋白可能是矽肺纤维化进程中的关键蛋白,为矽肺纤维化的研究提供了新靶点。