INSM1在嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和肾上腺皮质腺瘤中的表达和病理诊断价值

目的探讨胰岛素瘤相关蛋白1(insulinoma-associated protein 1,INSM1)在嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和肾上腺皮质腺瘤中的表达及其在鉴别诊断中的意义。方法采用免疫组化EnVision两步法检测INSM1在嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和肾上腺皮质腺瘤中的表达。结果32例嗜铬细胞瘤中31例INSM1阳性(31/32,96.88%),其中高表达20例(20/32,62.50%)。9例肾上腺外副神经节瘤INSM1均阳性,其中高表达8例(8/9,88.89%)。33例肾上腺皮质腺瘤中INSM1均阴性。INSM1在嗜铬细胞瘤/副神经节瘤中的表达显著高于肾上腺皮质腺瘤(P<0.001)。INSM1高表达的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤具有更高的Ki67增殖指数(P=0.016),但与患者性别(P=0.190)、年龄(P=0.439)、肿瘤TNM分期(P=0.793)、生长模式(P=0.495)、凝固性坏死(P=0.790)和脉管/包膜侵犯(P=0.790)均无显著相关性。INSM1鉴别嗜铬细胞瘤/副神经节瘤与肾上腺皮质腺瘤的敏感性为97.6%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.988。结论INSM1表达于嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的细胞核,而不表达于肾上腺皮质腺瘤,可有效鉴别嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和肾上腺皮质腺瘤。

佛司可林促进小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质酮分泌的作用研究

目的研究佛司可林(FSK)对小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质激素的促分泌作用。方法以Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象,采用1、10μmol·L-1FSK处理Y1细胞15min^24 h等不同时程,观察Y1细胞生长形态变化,运用ELISA方法检测细胞分泌液皮质酮含量,RT-q PCR方法检测相关基因mRNA表达,Western blot方法检测相关蛋白表达。结果 1μmol·L-1FSK干预Y1细胞3 h后细胞形态开始皱缩并逐渐形成圆球状生长。与对照组比较,1μmol·L-1FSK治疗24 h后明显升高Y1细胞皮质酮水平(P<0.01);并增加类固醇急性调节蛋白酶(Star)基因和蛋白表达(P<0.01)、也明显升高皮质酮合成第一步骤限速酶Cyp11a1和皮质酮合成最后一步关键酶Cyp11b1基因表达(P<0.01)。此外,10μmol·L-1FSK干预Y1细胞15 min^12 h不同时程后,发现1 h后即可明显增加Star基因表达,并呈现典型的时效关系(P<0.01);孤儿核受体(Nr4a1和Nr4a2)基因表达在FSK处理15 min后明显升高、1 h后上调最明显(P<0.01),之后升高幅度逐渐减弱。然而,FSK对孤儿核受体(Nr5a1)和促肾上腺皮质激素受体(Mc2r)基因表达无明显影响。结论 Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞对腺苷酸环化酶激活剂佛司可林具有强烈的应答反应,佛司可林是皮质激素分泌的强有效诱导剂。

ODF1在肾上腺嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和皮质腺瘤鉴别诊断中的应用价值

目的研究ODF1在肾上腺嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和皮质腺瘤鉴别诊断中的应用价值。方法收集2017-01—2020-07确诊的10例嗜铬细胞瘤、5例副神经节瘤、15例肾上腺皮质腺瘤和10例正常肾上腺组织,进行ODF1、嗜铬素A(CgA)和类固醇生成因子-1(SF-1)免疫组织化学染色,观察它们的表达。结果所有嗜铬细胞瘤(10/10)、5/5例副神经节瘤及肿瘤周围正常髓质(10/10)均呈ODF1和CgA弥漫阳性表达,SF-1阴性表达。所有肾上腺皮质腺瘤(15/15)及肿瘤周围正常皮质(15/15)均呈SF-1阳性表达,ODF1阴性表达。CgA在肾上腺皮质腺瘤的阳性表达率为6.7%(1/15)。ODF1和SF-1表达组合对于诊断肾上腺嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和皮质腺瘤的敏感性和特异性均为100%。10例嗜铬细胞瘤、5例副神经节瘤和15例肾上腺皮质腺瘤周围的肾上腺组织以及10例正常肾上腺组织中皮质均表达SF-1(100%),髓质均表达ODF1和CgA。结论ODF1可作为诊断嗜铬细胞瘤/副神经节瘤的新型免疫组织化学标记物,与SF-1联合可经济、有效地鉴别肾上腺嗜铬细胞瘤/副神经节瘤和皮质腺瘤。

附子肉桂抑制小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质酮生成的研究

目的研究温热散寒中药药对"附子肉桂"对肾上腺皮质功能的影响。方法以Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象,设置空白对照组,1μmol/L佛司可林(FSK)组,以及不同浓度附子肉桂水煎醇沉液组(0.25 g/L、1 g/L、4 g/L、8 g/L),干预Y1细胞36 h或48 h。分别采用MTT检测细胞增殖,运用ELISA检测细胞分泌皮质酮含量,RT-qPCR检测类固醇激素合成酶基因表达,Western blot检测蛋白表达。结果与对照组(Con)比较,0.25 g/L、1 g/L、4 g/L、8 g/L附子肉桂组Y1细胞活力被显著抑制(P<0.05);4 g/L与8 g/L附子肉桂组Y1细胞皮质酮分泌显著下降(P<0.01);0.25 g/L、1 g/L、4 g/L、8 g/L附子肉桂组Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1基因表达显著下调(P<0.01),而8 g/L附子肉桂促进Star基因表达(P<0.01),且4 g/L附子肉桂显著抑制CYP11A1、CYP21A2、CYP11B1蛋白表达。与FSK组比较,4 g/L附子肉桂抑制Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1基因表达后不能再被FSK诱导表达(P<0.01)。结论附子肉桂通过抑制细胞活力和下调类固醇激素合成酶表达,以抑制肾上腺皮质功能。

黄柏酮通过影响线粒体功能抑制肾上腺皮质瘤细胞皮质酮合成的研究

目的研究黄柏酮对肾上腺皮质激素合成与分泌的影响。方法体外培养Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞,采用2.5~160μmol/L黄柏酮干预细胞24 h,运用MTT法检测细胞活性;以80μmol/L黄柏酮处理细胞24 h后采用流式细胞术检测细胞周期,共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜变化;以ELISA法检测细胞分泌液皮质酮含量;以40~160μmol/L黄柏酮干预细胞24 h,80μmol/L黄柏酮干预细胞24~48 h,运用qPCR法检测皮质酮合成酶mRNA表达,Western blot检测其蛋白表达。结果与对照组比较,2.5~40μmol/L黄柏酮对细胞的抑制率约为35%(P<0.05),160μmol/L黄柏酮对细胞的抑制率为60%以上(P<0.01)。黄柏酮导致G1期细胞显著增加并促进线粒体膜亮度增强(P<0.05),同时显著抑制线粒体膜Mfn1、Mfn2蛋白表达以及皮质酮分泌(P<0.05)。进而发现,40~160μmol/L黄柏酮显著抑制Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd3b2、SF-1基因表达(P<0.01),160μmol/L黄柏酮显著增强Star、Cyp21a1、Nr4a1、Nr4a2基因表达(P<0.01);80μmol/L黄柏酮持续给药48 h内,均显著抑制Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Hsd3b2基因表达(P<0.01),并抑制StAR、CYP11A1蛋白表达,然而促进Star基因表达(P<0.01)。结论黄柏酮抑制肾上腺皮质细胞皮质酮合成过程,可能与其阻滞细胞周期及影响线粒体膜上类固醇激素合成酶表达有关。

人参-黄芪与熟地-山茱萸影响肾上腺皮质瘤细胞皮质酮生成的比较研究

目的研究“补气生津”人参-黄芪与“填精补肾”熟地-山茱萸对皮质激素生成的影响。方法采用0.25-8 g·L^(-1)人参-黄芪与0.25-8 g·L^(-1)熟地-山茱萸水煎醇沉液分别干预小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y1 adrenocortical cell,Y1细胞)48 h,采用MTT比色法(MTT assay,MTT)检测细胞增殖,运用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞分泌皮质酮含量,实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测类固醇激素合成酶基因表达,免疫蛋白印迹法(Western blot,WB)检测蛋白表达。结果与空白组(Control,Con)比较,0.25-8 g·L^(-1)人参-黄芪和熟地-山茱萸均抑制Y1细胞增殖(P<0.01);4 g·L^(-1)和8 g·L^(-1)人参-黄芪促进皮质酮分泌(P<0.01),4 g·L^(-1)和8 g·L^(-1)熟地-山茱萸抑制皮质酮分泌(P<0.01);8 g·L^(-1)人参-黄芪增强CYP11A1、CYP21A2、CYP11B1蛋白表达(P<0.05),8 g·L^(-1)熟地-山茱萸抑制CYP11A1、CYP21A2、CYP11B1蛋白表达(P<0.01);8 g·L^(-1)人参-黄芪抑制Star基因表达(P<0.05),而8 g·L^(-1)熟地-山茱萸促进Star基因表达(P<0.01),4 g·L^(-1)与8 g·L^(-1)人参-黄芪和0.25-8 g·L^(-1)熟地-山茱萸均能显著抑制Cyp11a1基因表达(P<0.01),8 g·L^(-1)人参-黄芪和1-8 g·L^(-1)熟地-山茱萸都抑制Cyp21a1基因表达(P<0.05),1-8 g·L^(-1)人参-黄芪和0.25-8 g·L^(-1)熟地-山茱萸均抑制了Cyp11b1基因表达(P<0.05)。与佛司可林(Forskolin,FSK)组比较,人参-黄芪与熟地-山茱萸预处理Y1细胞后,FSK不能诱导Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b11基因表达(P<0.01)。结论人参-黄芪促进皮质酮分泌,熟地-山茱萸抑制皮质酮分泌,主要通过调节类固醇激素合成酶表达发挥药效。

蛇床子素对Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质功能的影响

目的研究蛇床子素(Osthole,Ost)对肾上腺皮质功能的影响。方法以Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象,以含10%、1%和0.1%血清培养液培养细胞,分别采用1、10、25、50、100、200μmol/L Ost处理Y1细胞24、48 h,以0.1%二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照组,腺苷酸环化酶激活剂(Bu)2cAMP为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞形态变化,采用ELISA法检测细胞分泌液皮质酮含量,RT-qPCR法检测类固醇急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、21α-羟化酶(Cyp21a1)、3β-羟基类固醇脱氢酶(Hsd3b2)、11β-羟化酶1(Cyp11b1)、11β-羟化酶2(Cyp11b2)、17α-羟化酶/17,20-碳链裂解酶(Cyp17a1)及17β-羟基类固醇脱氢酶3(Hsd17b3)基因表达水平。结果 100、200μmol/L Ost组可明显抑制Y1细胞增殖,且对含0.1%血清培养液中细胞抑制作用更明显。与阴性对照组比较,阳性对照组Y1细胞Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Hsd3b2、Cyp11b1、Cyp17a1及Hsd17b3基因表达水平明显增强(P<0.05);干预24、48 h,50μmol/L Ost组Y1细胞皮质酮水平明显升高(P<0.05)。与24 h比较,干预48 h后,25、50μmol/L Ost组皮质酮含量明显升高(P<0.01)。干预24 h后,25、50μmol/L Ost组Star、Cyp21a1、Hsd3b2基因表达明显增强(P<0.05);干预48 h后,Star基因表达水平进一步增强(P<0.05),但Cyp11a1基因表达无明显差异(P>0.05)。干预24、48 h后,10、25、50μmol/L Ost组皮质酮合成酶Cyp11b1和性激素合成酶Cyp17a1基因表达明显增强(P<0.05);Ost对醛固酮合成酶Cyp11b2和性激素合成酶Hsd17b3基因表达水平未见明显作用。结论蛇床子素通过增强类固醇激素合成相关酶基因表达,参与调节肾上腺皮质功能,并以促进皮质酮的合成与分泌作用为主。

TNF-α对小鼠肾上腺皮质细胞系Y1皮质醇合成的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对小鼠肾上腺皮质细胞系Y1皮质醇合成及其合成过程中的关键基因StAR的变化。方法 50U/ml的TNF-α或(和)10-9mol/L促肾上腺皮质激素(ACTH)在不同作用时间处理小鼠肾上腺皮质细胞系Y1。台盼蓝拒染法检测细胞数目,放免法检测细胞皮质醇合成水平,RT-PCR检测类固醇急性调节蛋白相关基因(StAR)的表达变化。结果 50U/mlTNF-α或(和)10-9mol/LACTH处理Y1细胞不同时间,发现TNF-α和ACTH共同作用后,皮质醇合成水平明显下降(P<0.05),StARmRNA表达明显下降(P<0.05);而TNF-α单独作用时对皮质醇合成的抑制作用不明显,StARmRNA表达也无明显改变(P>0.05);ACTH单独作用时Y1细胞皮质醇的合成明显升高(P<0.05);StARmRNA表达明显升高(P<0.05)。结论 TNF-α与ACTH共同作用通过抑制StAR表达进而抑制皮质醇合成能力;而TNF-α单独作用无明显抑制作用,ACTH单独作用后其表达量则明显升高。

锌离子促进小鼠肾上腺皮质瘤细胞孕酮分泌的作用研究

目的研究锌离子对小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y1)孕酮分泌的促进作用。方法采用5-40μM不同浓度的ZnSO4及0.5-10μM不同浓度的TPEN分别处理Y1细胞6-48h等不同时间,选取最适宜的药物作用浓度和时间。给予ACTH(10mIU/mL)分别刺激ZnSO4和TPEN作用的Y1细胞0.5h和2h后测量细胞分泌孕酮含量。选取ACTH刺激0.5h后的细胞进行TSQ锌离子荧光染色,并用Western blot检测p-StAR等相关蛋白的表达。结果最合适的给药浓度和时间为ZnSO4(10μM,24h)与TPEN(1μM,12h)。ACTH刺激0.5h后,ZnSO4明显提升了Y1细胞孕酮的分泌,促进了细胞p-StAR,p-ERK1/2,p-p38蛋白的表达。而TPEN则抑制和降低了细胞孕酮的分泌及相关蛋白的表达。结论锌离子通过MAPK信号通路促进了Y1细胞经快速调节途径分泌孕酮。

不同温补肾阳中药主要组分对小鼠肾上腺皮质瘤细胞增殖及皮质酮分泌的影响

目的：研究温补肾阳中药主要组分对小鼠肾上腺皮质瘤细胞增殖及皮质酮分泌的影响。方法：以Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象,分别采用0.2~640μmol/L淫羊藿苷、仙茅苷、金丝桃苷、松果菊苷、松脂醇二葡萄糖苷、补骨脂素和耐斯糖干预Y1细胞24~72 h;并以0.1%DMSO为对照组,佛司可林为诱导剂组;通过MTT法检测细胞增殖、q PCR检测细胞皮质酮合成酶基因表达、ELISA检测细胞上清液皮质酮水平。结果：Y1细胞铺板0~72 h内,对照组细胞增殖明显,80~640μmol/L淫羊藿苷治疗72 h显著抑制Y1细胞增殖,且呈现量效关系（P〈0.05）;640μmol/L松果菊苷治疗24 h、48 h和72 h均显著抑制Y1细胞增殖（P〈0.05）;10~80μmol/L补骨脂素治疗48 h显著促进Y1细胞增殖（P〈0.05）;大于320μmol/L补骨脂素治疗72 h显著抑制Y1细胞增殖（P〈0.05）;然而,仙茅苷、金丝桃苷、松脂醇二葡萄糖苷、耐斯糖对Y1细胞增殖无明显影响。基础状态下,与对照组比较,仅10μmol/L补骨脂素显著增强Cyp11b1基因表达（P〈0.05）;佛司可林显著促进各组Star、Cyp11a1和Cyp11b1基因表达及皮质酮分泌（P〈0.05）。结论：淫羊藿苷、松果菊苷和补骨脂素对Y1细胞增殖抑制作用与其浓度和作用时间有关,本研究中采用的温补肾阳中药主要组分对Y1细胞皮质酮合成与分泌作用弱。

氟西汀对皮质酮诱导Nesfatin-1含量升高的影响

目的观察氟西汀对皮质酮诱导的SH-SY5Y细胞株中下丘脑摄食调节因子Nesfatin-1含量升高的影响。方法采用体外培养细胞的方法,建立SH-SY5Y细胞皮质酮损伤模型,设氟西汀给药组(10^(-9)~10^(-5)mol·L^(-1))、皮质酮组和阴性对照组,采用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组化的方法观察细胞中Nesfatin-1 mRNA及蛋白表达的变化。结果与对照组相比,皮质酮组细胞Nesfatin-1 mRNA和蛋白含量均显著升高;氟西汀(10^(-9)~10^(-5)mol·L^(-1))处理后Nesfatin-1 mRNA和蛋白含量均显著降低。结论氟西汀体外用药能够逆转皮质酮诱导的SH-SY5Y细胞Nesfatin-1表达上调。

CYP21和CYP21P基因启动子序列对绿色荧光蛋白基因表达的影响

特异性扩增CYP2 1基因和CYP2 1P基因启动子区域 770bp～ 1bp片段 ,去除pEGFP N1载体中的CMV启动子 ,构建含CYP2 1基因启动子的pEGFP N1载体 (pCYP2 1)和CYP2 1P基因启动子的pEGFP N1载体 (pCYP2 1P) ,分别将上述两种构建载体、野生型pEGFP N1(阳性对照 )质粒及阴性对照转染入肾上腺皮质来源的Y1细胞系中 ,用倒置荧光显微镜 ,以及激光共聚焦显微镜等方法观测绿色荧光蛋白的表达。转染后 ,在荧光倒置显微镜下首次发现Y1细胞中出现绿色荧光蛋白的时间阳性对照为 3小时 ,pCYP2 1为 7小时 ,pCYP2 1P与阴性对照 (未转染任何载体的Y1细胞 )始终未观测到绿色荧光蛋白。激光共聚焦显微镜显示 ,阳性对照绿色荧光蛋白表达强于pCYP2 1,pCYP2 1P与阴性对照始终未观测到绿色荧光蛋白。阳性对照和pCYP2 1的绿色荧光蛋白在胞核中的荧光强度高于胞浆。上述结果进一步表明 ,含有CYP2 1和CYP2

Y1细胞生物学特性及其在肾上腺皮质功能研究中的应用

肾上腺皮质功能减退、肾上腺糖皮质激素分泌减少是肾虚证发生的主要物质基础,因此肾上腺皮质细胞在探索肾虚及补肾机制研究方面具有重要价值。Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y1细胞)已广泛用于肾上腺皮质功能的体外研究。综述Y1细胞的来源、不同细胞系的衍变、类固醇激素的合成途径以及Y1细胞增殖与功能相关的信号通路,以期为肾虚证发病机制、补肾中药的有效成分筛选及作用机制研究提供参考。

补肾中药对大剂量氢化可的松诱导的Y1细胞皮质酮合成的作用

目的:探讨常用补肾中药对大剂量氢化可的松诱导的Y1细胞皮质酮合成的作用。方法:采用水提醇沉法制备淫羊藿、仙茅、巴戟天、肉苁蓉、杜仲、菟丝子、补骨脂、知母、黄柏、生地黄、六味地黄丸和金匮肾气丸等常用补肾中药和复方的提取物。(1)分别以不同浓度(0、2、4、8、16、31、63、125、250、500、1 000μg/ml)的补肾中药或复方干预细胞48 h,MTT法检测Y1细胞增殖的情况,筛选各单味中药和复方的适宜浓度。(2)将细胞分为对照组、模型组和中药(复方)组。除对照组外,其他各组Y1细胞给予10μmol/L氢化可的松和5μmol/L H89(促肾上腺皮质激素信号阻断剂)诱导模型;造模同时,各中药(复方)组给予相应提取物。药物干预48 h后,PCR检测类固醇合成急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、21α-羟化酶1(Cyp21a1)、11β-羟化酶1(Cyp11b1)、3β-羟基类固醇脱氢酶1(Hsd3b1)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(Hsd3b2)等mRNA表达;Western blot检测StAR、CYP11A1、CYP11B1、3β-HSD1、3β-HSD2的蛋白表达;ELISA检测细胞培养液皮质酮含量。结果:(1)MTT检测结果显示,黄柏对Y1细胞增殖具有明显的抑制作用。筛选出的适宜药物浓度分别为黄柏10μg/ml、知母100μg/ml、其他中药(复方)200μg/ml。(2)各单味中药和复方干预模型细胞48 h后,PCR检测结果显示,淫羊藿、仙茅、黄柏和生地黄对皮质酮合成的相关基因影响较显著。(3)与对照组相比,模型组Star、Cyp21a1的mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01),Cyp11a1、Cyp11b1和Hsd3b1的mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,生地黄组Cyp21a1和Hsd3b1的mRNA表达显著降低(P<0.01);仙茅组Cyp21a1、Cyp11a1和Hsd3b1的mRNA表达显著降低(P<0.01);淫羊藿组Star和Hsd3b1的mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01),Cyp21a1 mRNA表达显著降低(P<0.01);黄柏组Cyp21a1、Cyp11a1、Cyp11b1和Hsd3b1的mRNA表达显著降低(P<0.01)。(4)与模型组相比,仙茅组3β-HSD2蛋白表达显著降低(P<0.01),黄柏组StAR、CYP11A1和3β-HSD2蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),3β-HSD1蛋白表达显著升高(P<0.01)。(5)与模型组相比,仙茅、淫羊藿、黄柏作用后皮质酮含量显著降低(P<0.01)。结论:大剂量氢化可的松可诱导Y1细胞培养液皮质酮含量显著升高。补肾中药淫羊藿对模型细胞的皮质酮合成具有促进作用,可上调Star和Hsd3b1基因表达;而黄柏则具有抑制作用,可下调StAR、CYP11A1和3β-HSD2蛋白表达,降低皮质酮含量。