CaM对小鼠胎儿成纤维细胞Hsp70表达的影响

【目的】证实小鼠胎儿成纤维细胞中钙调蛋白(calmodulin,CaM)基因参与热应激诱导型热休克蛋白70(Hsp70)的基因表达并明确其作用条件。【方法】取12.5 d孕鼠胚胎制备成纤维细胞(MEF),上述细胞随机分为对照组和热应激组:对照组在37℃条件下培养,热应激组包括Ⅰ组(39℃、0.5 h),Ⅱ组(39℃、1 h),Ⅲ组(39℃、1.5 h),Ⅳ组(41℃、0.5 h),Ⅴ组(41℃、1 h),Ⅵ组(41℃、1.5 h);每组3个重复。将选择的热应激组和对照组细胞分别加入不同浓度(25、50及100 mmol.L-1)钙调蛋白拮抗剂W7,运用RT-PCR检测Hsp70、CaM mRNA表达量。【结果】39℃和41℃热应激组Hsp70 mRNA表达量显著高于常温对照组(P<0.05);39℃应激1h的Hsp70 mRNA表达量极显著高于其它各组(P<0.01);39℃应激0.5 h和1 h CaM mRNA表达量极显著高于其它各组(P<0.01);41℃热应激组的CaM mRNA表达量与常温对照组比较差异不显著(P>0.05)。在培养液中加100 mmol.L-1W7、分别于37℃和39℃处理1 h后,其成纤维细胞的Hsp70 mRNA表达量极显著低于相应对照组(P<0.01)。【结论】中度热应激条件下,Hsp70和CaM基因表达量呈正相关,且39℃应激1 h可以显著诱导Hsp70和CaM基因表达;CaM通过某种途径参与了Hsp70基因表达。

小鼠胎儿和牛睾丸成纤维细胞的冷冻保存

研究了冷冻保护液、平衡时间、降温速度、解冻液以及解冻方式对冷冻小鼠胎儿成纤维细胞和牛睾丸成纤维细胞活力的影响。结果表明 ,对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻 ,冷冻液 ( 0 .4 %BSA) +1 .5mol/ L乙二醇 +0 .1 mol/ L蔗糖的 PBS液 )的冷冻效果优于冷冻液 ( 1 0 %的 NBS+1 0 %DMSO的 DMEM液 )。用冷冻液 对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻 ,平衡时间可从 2 .5h缩短到 0 .5h;冷冻细管降温速度 ( -6.8～ -3 7℃ )可以从 0 .6℃ / min提高到 1 .2℃ / min;诱发结晶可以省略。 3种解冻液解冻细胞活力排序为 :解冻液 ( 0 .4 %BSA+0 .1 mol/ L蔗糖的 PBS) >解冻液 ( 1 0 %NBS的 DMEM) >解冻液 ( PBS)。用冷冻液 对 MEF和 BTF细胞冷冻过程中 。

小鼠胎儿成纤维细胞的冷冻保存研究

为了摸索小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的简易方法，采用常规冷冻和玻璃化冷冻2种模式，探讨了不同的冷冻方法、不同的冷冻前平衡时间、不同的冷冻保护液的配比等因素对成纤维细胞冷冻效果的影响。实验结果表明：常规冷冻采用含100,4（体积分数）甘油的DMEM液作保护剂，可将0～5℃下平衡时间缩短至45～60min，细胞活力可达0．87。玻璃化冷冻采用10％（体积分数）NBS＋1．8mol／L乙二醇＋0．1mol／L蔗糖的PBS冷冻小鼠胎儿成纤维细胞效果好于其他组合，细胞活力可达到0．86。玻璃化冷冻法与常规冷冻法的冷冻效果差异不显著。

羊栖菜多糖对小鼠胎儿成纤维细胞生长、增殖及代谢的影响

用含5、10、204、0、80 mg/l羊栖菜多糖(SFPS)的培养液培养小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),研究SFPS对MEF生长增殖、营养物质吸收利用和细胞因子分泌的影响。结果表明:5、10、20 mg/lSFPS对MEF形态和生长增殖均无显著影响(P>0.05),40、80 mg/l SFPS对MEF表现出明显的抑制作用(P<0.05),使MEF突触分叉,细胞内颗粒增多;SFPS可显著促进MEF对葡萄糖的摄取利用(P<0.05),但对钙和氨基酸的利用无显著影响(P>0.05);低浓度SFPS有促进MEF碱性成纤维细胞因子(bFGF)、干细胞生长因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)分泌的趋势,但高浓度SFPS对bFGF、SCF和LIF的分泌无显著影响。

小鼠胎儿成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

对不同日龄小鼠胎儿的成纤维细胞及在不同细胞浓度下成纤维细胞体外培养生长状况和制备饲养层的差异，选择最佳条件。结果表明，分离培养不同日龄（１１ｄ、１４ｄ、１７ｄ）小鼠胎儿成纤维细胞，细胞生长状况无明显差异，由其制备的ＥＳ细胞饲养层生长状况亦无明显差异，成纤维细胞的培养以１×１０６ 个／ｍ ｌ细胞浓度为好。

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ对热休克小鼠胚胎成纤维细胞HSP70表达的影响

为证实热休克小鼠胎儿成纤维细胞中钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)对热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)基因表达的影响及其作用机理,将体外培养的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF)随机分为39℃和41℃热处理组(分别处理0.5,1,1.5,2 h)和常温对照组(37℃),测定各组细胞CaMKⅡ和HSF1 mRNA的量。此外,将培养的细胞分为37℃和39℃CaMKⅡ特异性抑制剂(myr-AIP)处理组和相应的空白对照组,分别测定各组细胞HSP70、HSF1及其mRNA的量。结果表明,39℃热休克1 h后HSF1和CaMKⅡ的mRNA表达量极显著高于常温对照组,经过myr-AIP处理的39℃组细胞HSP70及其mR-NA含量显著低于39℃空白对照组,而37℃myr-AIP处理组与37℃对照组没有显著差异;myr-AIP对37℃组和39℃组的HSF1 mRNA和蛋白含量影响均不显著,却使p-HSF1的含量显著降低。热休克能增加CaMKⅡ和HSF1 mRNA的转录,且CaMKⅡ通过磷酸化HSF1促进HSP70基因表达。

同步化处理后小鼠成纤维细胞表观遗传水平的相对定量分析

供体细胞的同步化处理可能改变其表观遗传特性,进而影响胚胎的克隆效率。研究同步化处理对小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonicf ibroblasts,MEFs)组蛋白H3K9甲基化、乙酰化及组蛋白H3K4单甲基化、三甲基化表达的影响。分离培养MEFs,增殖稳定的第3代MEFs分别用5mL/L血清饥饿处理4d或15mL/LDM-SO处理2d使细胞处于增殖抑制期,通过免疫组化染色和Image-J图像处理软件,相对定量比较不同处理情况下组蛋白H3K9甲基化、乙酰化和组蛋白H3K4单甲基化、三甲基化变化情况。Ki-67染色检测结果表明,两种同步化处理可使细胞处于G0期或G1期。DMSO处理使MEFs组蛋白H3K9乙酰化表达水平升高,而5mL/L血清饥饿处理则使其表达水平下降;此外,两种同步化处理均导致组蛋白H3K9甲基化和H3K4单甲基化表达下降,但不影响组蛋白H3K4三甲基化的表达水平。研究结论表明:同步化处理可改变MEFs组蛋白乙酰化和甲基化表达水平,进而有可能影响胚胎克隆效率。

胎儿

9921267 NO 是否参与小鼠胎儿肺的成长发育?[日]/吉泽穰治//日儿外会志.-1998,34(3).-543 冀医情9921268 妊娠末期给予狒狒胎仔倍他米松可使胎儿肾上腺 ACTH 受体 mRNA 表达受到抑制/Leavitt M G//Endocrinology.-1997,138(7).-2705～2712 津医图9921269 胎儿时间生物学[日]/中野仁雄//日内分泌志.-1998,74(1).

支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立

以小鼠胎儿和牛睾丸为材料 ,以含 1 5 % NBS、0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇、0 .1 μmol/ L Na2 Se O3的DMEM溶液为培养液 ,分离获得了传 1 5代的小鼠胎儿成纤维细胞和 5代牛睾丸成纤维细胞 ,建立了小鼠和牛类 ES细胞培养体系。结果表明 :牛睾丸成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞均属附着生长型细胞 ,与小鼠胎儿成纤维细胞相比较 ,牛成纤维细胞直径和长度大 ,生长速度快 ,易于老化 ;1 2～ 1 6日龄的小鼠胎儿最适宜分离与克隆小鼠胎儿成纤维细胞 ;在 2 5℃条件下 ,以 0 .2 5 %胰蛋白酶 +0 .0 4% EDTA消化液作用胎儿小块组织分离原代小鼠胎儿成纤维细胞 ,消化液作用时间不应超过 2 0 min,以相同的消化液在 3 7℃条件下 ,离散贴壁成纤维细胞 ,作用时间以 2～ 3 min为宜 ;培养细胞密度与传代时间间隔有密切关系 ,若传代时间间隔为 3～ 4d,培养细胞浓度应为 3× 1 0 5个 / ml～ 5× 1 0 5个 / ml;在成纤维细胞分离与克隆过程中 ,培养基中添加0 .1μmol/ L Na2 Se O3+0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 +1 5 % NBS,有利于 MEF和