TNF-α和VEGF协同作用小鼠胚胎干细胞衍生的血管内皮祖细胞促伤口愈合

皮肤伤口愈合是世界范围内的重大临床难题之一,血管生成和炎症反应是影响伤口愈合和组织再生的关键环节。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)在血管内皮修复和招募炎症细胞促伤口愈合过程中发挥重要作用。然而,体内直接输送EPC低效且会损害细胞存活力和功能进而影响治愈效率。因此,改善EPC的生物学功能以促进伤口愈合很有必要。本研究将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESC)在10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF的作用下诱导获得CD133+CD34+EPC。以mESC衍生的EPC为研究对象,将外源性肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作用于mESC-EPC,结果表明,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同处理组相比于单因子处理显著促进EPC的黏附、细胞迁移和管腔形成能力(P<0.01)。进一步通过建立小鼠局部皮肤全层创伤模型,在创周处注射10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同EPC治疗明显加速伤口愈合(P<0.05),再生皮肤真皮层增厚(P<0.001),促进血管生成素ANG1和ANG2介导CD31+内皮细胞构成的毛细血管网络成熟。随着伤口愈合程度的加深,促炎因子TNF-α在蛋白质水平的表达下调(术后13 d,PBS组、EPC组、VE组、TE组和VTE组的TNF-α相对表达量分别为0.73±0.01、0.60±0.02、0.42±0.02、0.36±0.01和0.34±0.03),创造有利于伤口愈合的炎症微环境。综上所述,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF的协同作用强化EPC的生物学功能,并通过促进新血管生成和早期炎症反应加速小鼠皮肤伤口闭合和组织重塑,为细胞干预伤口愈合治疗提出新的思路。

几种培养方法对ES/GFP小鼠胚胎干细胞系增殖和分化能力作用比较

目的 观察采用不同的饲养层和培养基对永久表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞系ES/GFP的增殖、分化和绿色荧光蛋白表达的影响。方法 分别采用小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞为饲养层 ,采用含重组人白血病抑制因子的DMEM/FCS培养基和Buffalo条件培养基培养ES/GFP细胞系。N2 无血清培养基诱导ES/GFP小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞 ,Nestin免疫组化染色。结果 小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞为饲养层 ,常规LIF培养液和Buffalo条件培养基均能较好维持ES/GFP细胞的高增殖能力和全能分化能力 ,对绿色荧光蛋白的表达和胚体形成、神经前体细胞的分化无明显差异。结论 人胚胎成纤维细胞可替代小鼠胚胎成纤维细胞作为ES/GFP饲养层 ,减少饲养层制备的工作量和污染的机会。Buffalo条件培养基可完全替代LIF培养基 ,降低细胞培养的成本。

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)培养体系的建立

小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）培养体系的建立汪河海刘红林①钟卉范必勤丁家桐②（江苏农科院畜牧兽医研究所，南京２１００１４）胚胎干细胞又称ＥＳ细胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｓ），其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态，并具早...

LMO4在小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞和血管生成中的作用

目的探讨转录因子LIM结构域蛋白4(LMO4)在小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为血管内皮细胞及新生血管中的作用。方法使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从小鼠红系白血病细胞系MEL)中克隆小鼠Lmo4的cDNA,并亚克隆到含有小鼠胎肝激酶-1(Flk-1)启动子驱动表达Gfp的载体(pFG),构建成血管细胞特异性表达的LMO4的载体pFLG。将表达载体转染mESC,通过遗传霉素(G418)筛选,获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株;将这些mESC在体外进行自我分化,以形成4 d和10 d的胚胎体(EB),并进行成血管细胞的集落细胞形成实验(BL-CFC);以10 d-EB进行新生血管出芽实验,观察和分析出芽长短、数目;运用蛋白免疫印迹(Western blot)或定量RT-PCR方法对目的基因的表达进行检测。结果PCR结果证实成功构建了成血管细胞特异性表达的LMO4的表达载体pFLG。通过G418筛选获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株。这些mESC通过自我分化形成4 d-EB和10 d-EB,荧光显微镜下观察到EB内均可见绿色荧光标记的细胞。Western blot检测显示:与mESC相比,4 d-EB和10 d-EB的LMO4的表达显著增加。过量表达LMO4的mESC/pFLG产生BL-CFC效率为(7.70%±1.27%),而mESC/pFG细胞产生BL-CFC效率为(1.15%±0.48%),二者差异有统计学意义(P=0.021)。定量RT-PCR结果显示,Flk-1、C-kit、Tie-2、Ve-cad基因在10 d-EB/pFLG中的表达,均较10 d-EB/pFG中表达增加2倍以上。新生血管出芽实验结果显示,10 d-EB/pFLG的新生血管数量和长度均较10 d-EB/pFG增加(P<0.05)。结论过量表达LMO4促进mESC形成成血管细胞,并有利于血管内皮细胞的分化和血管的新生。

小鼠胚胎干细胞(ES-M_(13))核骨架-核纤层-中间纤维结构体系的研究

本文使用细胞的选择性抽提、DGD包埋去包埋电镜制样、免疫荧光和免疫印迹技术研究了小鼠胚胎干细胞(ES-Ml_(13))的核骨架-核纤层-中间纤维(NM-L-IF)结构体系。在电镜下可以看到,ES细胞存在精细发达的核骨架结构,核骨架纤维同核纤层结构相连接,细胞质中有许多直径为10nm的中间纤维单丝。在免疫荧光分析中,使用角蛋白单克隆抗体有阳性反应,细胞质区域可以看到较强的荧光,没有极性分布现象,也没有观察到纤维状的荧光染色。ES细胞对波形蛋白和结蛋白抗体呈阴性反应,同对照组一样,只能看到非特异性的很微弱的荧光染色。在免疫印迹分析中,使用角蛋白单克隆抗体AF6检测到三条角蛋白多肽,分子量分别为65KD,62KD和52KD。

小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察

目的 观察小鼠胚胎干细胞在六种培养体系中的生长情况。方法 小鼠胚胎干细胞 (ESD3细胞株 )在以下六种培养体系中培养 :1 .原代小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)有血清培养 ,2 .MEF无血清培养 ,3.SNL细胞有血清培养 ,4.LIF(白血病抑制因子 )有血清无饲养层培养 ,5.LIF无血清无饲养层培养 ,6.大鼠肝细胞 (BRL)条件培养基培养。经体外培养 1 0代后 ,观察其克隆形态 ,同时进行碱性磷酸酶检测并将ES细胞接种于裸小鼠皮下 ,观察ESD3的未分化状态和多潜能性。结果 六种培养体系培养的ESD3具有典型的ES细胞克隆形态 :巢状 (集落状 )隆起生长 ,边缘清楚 ,表面平滑 ,结构致密 ;AKP强阳性 ;裸小鼠体内形成了由多种组织构成的畸胎瘤。结论 六种培养体系均能支持ESD3生长 ,并能保持其未分化性和多潜能性 ,为ES细胞的应用研究奠定了良好的基础。

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )建株的成功率。方法 收集小鼠 3.5d的囊胚培养 ,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层 ,形成的ES细胞样集落 ,经两次亚克隆分离培养ES细胞 ;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落 ,传至第 11代。ES细胞呈集落样生长 ,碱性磷酸酶染色强阳性 ,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长 ,形态多样 ,在体分化可形成来源于 3个胚层的组织。结论 两次亚克隆法获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状 。

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经干细胞的实验研究

目的 :探讨体外诱导小鼠胚胎干细胞 (ESCs)分化为神经干细胞 (NSCs)的可能性。方法 :ESCs经胚胎体阶段 ,以视黄酸及视网膜m櫣ｌｌｅｒ细胞诱导 ,在NSCs选择性培养基中筛选培养扩增 7d ,观察形态变化 ,采用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn - 3基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物 ,并对其扩增及分化能力进行观察。结果 :ESCs经初级诱导 ,NSCs选择性培养基筛选培养 7d后 ,形成大量神经球样结构 ,可扩增传代。绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性 ,整合BrdU ,表达nestin、glutaminase、Brn - 3基因 ,且可分化为神经元及神经胶质样细胞。结论 :视黄酸及m櫣ｌｌｅｒ细胞诱导的ＥＳＣｓ,经选择性培养基筛选培养可获得NSCs 。

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞发育为造血干/祖细胞方法的初步研究

目的 :探讨体外定向诱导胚胎干细胞 (ESC)发育为造血干细胞 (HSC)的方法。方法 :将小鼠E14胚胎干细胞在含干细胞生长因子 (SCF)和血管内皮生长因子 (VEGF)的甲基纤维素培养基中首先诱导发育为胚胎体(EB) ,再将EB置于均含SCF、VEGF、IL - 3、IL - 6及促红细胞生成素 (EPO)的 3种不同培养体系中定向分化为HSC ,并观察HSC表面标志性抗原、造血集落形成及瑞氏 -姬姆萨染色的结果。结果 :经两阶段诱导ESC分化为HSC ,发现在甲基纤维素半固体培养体系中HSC发育缓慢 ,分化 14d后CD34+/Sca - 1+细胞数最高为 ( 31 5± 4 7) %;而在骨髓基质细胞饲养层上HSC发育较快 ,细胞数量较多 ,分化第 10dCD34+/Sca - 1+细胞数即达到峰值 ,为 ( 47 8±6 3) %;骨髓基质细胞饲养层 +胎肝基质细胞上清培养体系中HSC发育同样迅速 ,所产生的CD34+/Sca - 1+细胞数量在 3个体系中最高 ,为 ( 5 3 6± 7 2 ) %。经瑞氏 -姬姆萨染色证实上述细胞为早期造血细胞 ,均有形成各系造血细胞集落的能力。结论 :使用骨髓基质细胞饲养层 +胎肝基质细胞上清培养体系及SCF、VEGF、IL - 3、IL - 6及EPO等细胞因子 ,通过两阶段诱导分化 ,可从小鼠ESC获得较高比例的HSC。

某些因素对牛和小鼠类胚胎干细胞分离与培养的影响

以荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎为材料 ,研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离 ;在 ES细胞分离与克隆中 ,以 15 %～ 2 0 %犊牛血清为宜 ,在 DMEM(L)培养基中添加 0 .1μmol/LNa2 Se O3 +0 .1mmol/Lβ-巯基乙醇 +10 μg/L IGF+10 0 0 IU/m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;在TCM199、DMEM(高糖 )和 DMEM(低糖 ) 3种培养基中 ,低糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离 ;优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在 37℃用低浓度消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高。

小鼠胚胎干细胞体外分离培养影响因素的实验研究

目的 为了更高效地分离胚胎干细胞 (ES) ,对几种影响分离ES细胞的因素进行探讨。方法 通过胚泡Hoechst33342染色及胚泡培养 ,研究超排卵对胚泡贴壁率及ES细胞分离效率的影响。并从 3种不同培养体系中寻找较为理想的ES细胞分离体系。结果 ①超排卵获得的胚泡的细胞数与正常胚泡之间差异无显著性意义。超排卵对胚泡的 72h贴壁率及ES细胞克隆率无显著影响。②在ES细胞培养过程中 ,有饲养层体系优于无饲养层体系。结论 超排卵获得胚泡的方法在小鼠ES细胞分离培养过程中值得采用。人胚胎成纤维细胞饲养层在ES细胞分离过程中具有较好的作用。

BALB/c小鼠胚胎干细胞系建立的方法学探讨

以小鼠胚胎成纤维细胞 (ME)为饲养层 ,以大鼠心脏细胞条件培养基 (RH CM)为ES细胞培养基 ,全面、详尽地对BALB c小鼠ES细胞的建系和培养方法进行了探讨 ,成功地建立了一套建立和培养BALB c小鼠ES细胞系的新方法。这一培养条件不但有效地维持了ES细胞的未分化状态和正常二倍体核型 ,而且维持了其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征 ;实验设计了两种离散方法和两种浓度的消化液 ,用来离散增殖的ICM和ICM离散后出现的ES集落。两种离散方法即“一次离散法” ,和“多次离散法” ,两种浓度的消化液即 0 .2 5 %Trypsin 0 .0 4 %EDTA和0 .0 5 %Trypsin 0 .0 0 8%EDTA ;同时对ICM离散时机、RH CM在BALB c小鼠ES细胞建系和培养中作用进行了探讨。结果表明 :在低浓度消化液作用下 ,采用“多次离散法”离散增殖 4天的ICM和ES集落的方法建立BALB c小鼠的ES细胞系是理想的 ;从细胞形态、集落形态、增殖生长能力、核型检测、碱性磷酸酶测定以及体内外分化能力表明 ,所建立的 9个BALB c小鼠ES细胞系符合小鼠胚胎干细胞的一系列特征。

小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的永生化研究

本文探讨了小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化的血管内皮细胞永生化。在体外培养系统中,以维甲酸(RA)和转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的拟胚体(EB)分化为“圆形细胞”和由这些“圆形细胞”组成的血管样结构。经光学和扫描电镜及免疫荧光等法分析检测,证明组成血管样结构的细胞具有专一性vWF荧光染色,表明是血管内皮样细胞。利用脂质体将人端粒酶催化亚基逆转录酶(hTERT)基因转染诱导分化中的“圆形细胞”。应用Dot-blot,RT-PCR,Western blot及免疫组织化学等方法分析、观察和证明了诱导分化的组成血管样结构的园形细胞和被hTERT基因转染的“圆形”细胞的形态和生物学特性。结果表明,携带hTERT基因的从ES细胞分化来的圆形细胞在体外可大量增殖,持续传代,95%具有血管内皮细胞的一些特有标志和管道化生长特性。因此,通过人端粒酶基因的转染途径可解决由ES细胞诱导分化而来的内皮细胞扩增和永生化问题,为构建组织工程化血管及其它人工血管的内皮化提供种子细胞来源打下基础。

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞（embryonic stemcell，ESC）向内皮细胞分化的条件，为组织工程血管提供种子细胞。方法取怀孕12．5d的昆明小白鼠1只，断颈处死，取其胚胎，培养制备小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）。常规复苏ESC后进行体外培养，采用悬滴-悬浮法制备拟胚体（embryoid body，EB）。将EB分两组：实验组加入含有3ng／ml转化生长因子β1、50ng／ml血管内皮细胞生长因子及1μmol／L激活素受体样激酶选择性抑制剂的EB培养基；对照组只加入EB培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况。采用RT—PCR及免疫组织化学染色检测诱导细胞vWF和CD34的表达，验证细胞性质。结果原代MEF生长迅速，第3天细胞融合达90％左右，细胞呈长梭形，有少量侧支，细胞核饱满，有2～3个核仁，细胞排列紧密。传至3～5代，细胞呈多角形，胞浆饱满，有3～4个核仁，细胞表面分泌较多细胞颗粒。ESC在饲养层上保持未分化状态，细胞团形态呈鸟巢样，边缘平整，单个细胞体积小，折光性强，核质比高，增长速度快。悬滴培养3d的EB肉眼可见，再经悬浮培养3d后，形成较大的透亮EB；EB贴壁后第2天，球体略摊开。实验组第4～7天，EB周围有许多圆形细胞产生，第10b14天，可见由大量圆形细胞组成的血管样结构自EB周围生长；对照组EB周围未见血管样结构生长。免疫组织化学染色见EB周围大量vWF染色阳性细胞，RT—PCR检测到vWF和CD34的表达。结论ESC在特定的条件下可以分化为内皮细胞，有可能为组织工程血管提供大量的种子细胞。

小鼠胚胎干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的 探索小鼠胚胎干细胞 (Embryonicstemcell ,EScell)体外分化为神经前体细胞 (Neuralprecursorcells ,NPC)的无血清培养条件 ,比较人胚胎成纤维细胞 (Humanembryonicfibroblasts ,HEF)与小鼠胚胎成纤维细胞 (Mouseembryonicfibroblasts ,MEF)对小鼠ES细胞生长的作用。方法 在MEF或HEF饲养层上培养ES细胞 ,培养液中含白血病抑制因子。采用无血清方法培养NPC ,免疫组化方法检测巢蛋白 (Nestin) ,用硝基四氮唑蓝 /5 溴 4 氯 3 吲哚基磷酸 (NBT/BCIP)显色检测碱性磷酸酶。结果 无血清培养可以获得 86 %的NPC。HEF与MEF一样能维持ES未分化状态。结论 无血清培养方法有利于ES细胞向NPC分化 ,HEF可用于小鼠ES细胞的培养 ,而且比MEF优越。

DEHP、MEHP对小鼠胚胎干细胞细胞毒性的研究

目的分析不同浓度的邻苯二甲酸二乙基己酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]及其活性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)对小鼠胚胎干细胞细胞毒性、增殖的影响。方法用含有不同浓度DEHP(1 000、100、10、1、0.1、0.01μmol/L)、MEHP(1 000、100、10、1、0.1、0.01μmol/L)的培养液,对胚胎干细胞进行培养,用CCK-8法检测细胞活性。结果染毒96 h后,高剂量(1 000μmol/L)DEHP、MEHP均对胚胎干细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),且染毒剂量与细胞抑制率之间存在明显的正相关性,相关系数分别为0.51、0.62(P<0.05)。结论在一定浓度范围内,DEHP及MEHP均对小鼠ESC具有细胞毒性,且有浓度依赖性。

小鼠胚胎大脑皮质与中脑神经干细胞培养与分化比较的研究

目的比较小鼠胚胎脑皮质与中脑来源的神经干细胞在培养与分化方面的差异,为更好的研究和利用神经干细胞提供实验依据。方法无菌条件下分别分离鼠胚大脑皮质与腹侧中脑,经胰酶消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基,培养扩增;倒置显微镜观察比较生长状况;机械方法传代;10%血清接种分化;免疫荧光细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向,并作比较。结果小鼠胚胎脑皮质与中脑均存在神经干细胞,其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性,并都能分化为神经元和胶质细胞;但皮质部位所含神经干细胞明显多于中脑,也更宜成球;有血清条件下分化,皮质神经干细胞未见分化为酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元;中脑神经干细胞则可少量分化为TH阳性神经元结论同样条件下皮质神经干细胞比中脑神经干细胞更易增殖与培养,两者在有血清条件下分化为TH阳性神经元能力方面有差异。

GLP-1、Betacellulin、Activin A、bFGF和Nicotinamide联合诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

【目的】探讨体外联合应用GLP-1、betacellulin、activinA、bFGF和nicotinamide5种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化为胰岛素分泌细胞。【方法】以GLP-1、betacellulin、activinA、bFGF和nicoti-namide5种生长因子诱导E14.1小鼠ES细胞30d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫组化检测分化细胞胰岛素表达,以流式细胞仪检测胰岛素分泌细胞的分化率,用RIA法测定培养液中胰岛素水平。【结果】分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和胰岛素免疫组化染色阳性,胰岛素分泌细胞的分化率平均为13.6%±3.7%,在5.6mmol/L和25mmol/L葡萄糖浓度作用下培养液中胰岛素水平分别为(0.04±0.01)ng/mL和(0.09±0.02)ng/mL。【结论】体外联合应用GLP-1、betacellulin、activinA、bFGF和nicotinamide5种生长因子能将小鼠ES细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,但胰岛素分泌功能较差。