全反式维甲酸通过γ-氨基丁酸途径促进小鼠胚胎腭板间充质细胞的凋亡(英文)

维甲酸(RA)是一种能够诱导腭裂发生的致畸物.研究显示γ-氨基丁酸(GABA)在腭板的发育过程中发挥重要作用.而GABA是否参与了RA诱导的腭裂发生还不清楚.本研究以小鼠胚胎腭板间充质细胞(MEPM)为研究对象,观察全反式维甲酸(atRA)(0.2、0.67、2.0和6.7μmol/L)对MEPM细胞增殖和凋亡的影响,并探讨GABA信号通路在其中的可能作用.结果显示,atRA(2.0μmol/L和6.7μmol/L)显著性抑制了MEPM的增殖,并促进了细胞凋亡.atRA(0.67、2.0和6.7μmol/L)显著性降低了GABA合成的关键酶谷氨酸脱羧酶(GAD67)mRNA和蛋白质的表达,但对γ-氨基丁酸A型受体-β3(GABAAR-β3)mRNA和蛋白质的表达没有影响.1.0μmol/L的GABA逆转了atRA(6.7μmol/L)对MEPM细胞增殖和凋亡的影响.以上结果表明,atRA通过下调GAD67的表达,减少GABA的产生,抑制MEPM的增殖和促进MEPM的凋亡,从而可能影响腭板的发育,诱导腭裂形成.

miR-135a-5p靶向抑制Kif3B调控小鼠腭胚突间充质细胞的自噬

背景:研究表明,在地塞米松诱导腭裂的小鼠胚胎腭突间充质细胞中miR-135a-5p呈高表达,初级纤毛及其介导的Shh信号通路参与小鼠胚胎腭突间充质细胞的自噬。由此猜测miR-135a-5p可能通过初级纤毛及其介导的Shh信号途径调控小鼠胚胎腭突间充质细胞的自噬。目的:探讨miR-135a-5p对小鼠胚胎腭突间充质细胞自噬的调控作用。方法:体外提取并培养C57BL/6J小鼠胚胎腭突间充质细胞。细胞转染分别设置为:①对照组、miR-135a-5p阴性对照组、miR-135a-5p模拟物组。②NC+miR-NC组、KIF3B过表达组、miR-135a-5p+KIF3B组。qRT-PCR验证miR-135a-5p、KIF3B的转染效率;透射电镜观察各组细胞中自噬小体/自噬溶酶体的数目;免疫荧光技术测定自噬标记物LC3B的荧光表达程度;Western blot检测KIF3B、LC3和P62的蛋白表达。③miR-135a-5p阴性对照组、SAG处理组、SAG+miR-135a-5p组。qRT-PCR检测Shh信号下游关键转录因子Gli3的mRNA表达水平;Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的蛋白表达。结果与结论:①过表达miR-135a-5p后,细胞内自噬小体/自噬溶酶体数量显著增多(P<0.01);LC3B的荧光密度显著升高(P<0.01),KIF3B、P62的蛋白表达降低(P<0.01),LC3的蛋白表达升高;②过表达KIF3B后,细胞内自噬小体/自噬溶酶体数目明显减少(P<0.01),LC3B的荧光密度降低(P<0.01),P62的蛋白表达升高(P<0.01),LC3的蛋白表达下降(P<0.01);miR-135a-5p靶向抑制KIF3B的表达(P<0.01),并使自噬小体/自噬溶酶体数目、LC3B的荧光强度以及LC3的蛋白表达得到回升(P<0.01),P62的蛋白表达下降(P<0.01);③SAG使Gli3的mRNA表达明显升高(P<0.01),P62的蛋白表达升高(P<0.01),LC3的蛋白表达下降(P<0.01);加入miR-135a-5p后,Gli3的mRNA表达显著下降(P<0.01),P62的蛋白表达下降(P<0.01),LC3的蛋白表达回升(P<0.01);④结果表明:miR-135a-5p靶向抑制KIF3B并且可能通过负向调控Shh信号通路促进小鼠胚胎间充质细胞自噬。

小鼠胚胎腭突间充质细胞的分离与体外培养方法研究

目的改进小鼠胚胎腭突取材方法,原代培养C57BL/6J小鼠胚胎腭突间充质细胞并加以纯化。方法通过改良方法在显微镜下切取胚胎腭突,然后应用DISPASE酶消化离体腭突,纯化腭突胚胎间充质细胞,免疫荧光染色法鉴定腭突间充质细胞生物学特性。结果改良的取材方法使小鼠胚胎腭突取材更精确,操作更简单;纯化后的原代间充质细胞几乎不含上皮细胞;免疫荧光显示细胞HNK-1、S-100、波形蛋白标记阳性,角蛋白标记阴性。结论建立了一种小鼠胚胎腭突精确取材及纯化腭突外胚间充质细胞的方法,为下一步研究工作打下基础。

MTHFR基因沉默对小鼠胚胎腭突间充质细胞增殖和凋亡的影响

目的:应用RNA干扰技术,从细胞水平研究5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变导致腭裂发生的机制。方法:构建MTHFR基因沉默载体,对13天胚胎的腭突间充质细胞进行RNA干扰实验。MTT法检测MTHFR基因沉默后细胞增殖的改变,流式细胞仪检测MTHFR基因沉默后对胚胎腭突间充质细胞凋亡的影响。实验结果采用SPSS11.0软件包进行分析,细胞增殖的比较用重复测量方差分析,凋亡率检测应用U检验。结果:MTHFR基因表达下调后,在无叶酸存在的情况下,腭突间充质细胞的增殖速度明显减慢,与对照组相比有显著性差异(P<0.001);实验组的凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。结论:在外源性叶酸补充不足的情况下,腭突间充质细胞增殖减弱并发生凋亡,这可能是MTHFR基因突变与先天性唇腭裂发生相关的病理学基础。

原代培养小鼠胚胎腭突间充质细胞的纯化方法研究

目的:建立纯化原代培养的小鼠胚胎腭突间充质细胞的纯化方法。方法:应用D ispase酶4℃消化处理离体小鼠胚胎腭突18 h,通过振荡法使上皮和间充质分离,吸去上皮片。结果:应用流式细胞仪检测,胚胎腭突间充质细胞内几乎不含上皮细胞。结论:本方法为体外研究提供了理想的模型。

lncRNA Meg3在全反式维甲酸和转化生长因子β3影响小鼠腭突间充质细胞增殖过程中的作用

目的:探索长链非编码RNA(lncRNA)Meg3在全反式维甲酸(atRA)和转化生长因子β3(TGF-β3)影响胎鼠腭突间充质细胞增殖过程中的作用。方法:分离、培养妊娠13 d胎鼠腭突间充质细胞。EdU法检测对照组(未处理)、atRA组(5μmol/L atRA)和TGF-β3组(10μg/L TGF-β3)处理48 h腭突间充质细胞增殖能力的变化。荧光原位杂交和实时荧光定量PCR法检测上述3组Meg3的定位和相对表达量。利用EdU实验检测Meg3 siRNA转染前后atRA和TGF-β3对腭突间充质细胞增殖的影响。结果:与对照组相比,atRA处理48 h可抑制腭突间充质细胞的增殖,TGF-β3处理48 h可促进腭突间充质细胞增殖(P<0.05)。与对照组相比,atRA可促进腭突间充质细胞中Meg3的表达,TGF-β3可抑制Meg3的表达(P<0.05)。Meg3基因沉默后,与对照组相比,Meg3 siRNA组、atRA和TGF-β3处理组胎鼠腭突间充质细胞增殖能力均增强(P<0.05)。结论:atRA对胎鼠腭突间充质细胞的增殖抑制作用可能主要通过Meg3介导,而TGF-β3对腭突间充质细胞增殖的促进作用可能与Meg3基因无直接关系。

atRA对C57BL/6N小鼠腭突间充质细胞周期分布的影响及其作用机制

目的:在全反式维A酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导建立腭裂小鼠模型的基础上,检测胎鼠体内胚胎腭突间充质细胞的周期分布,并检测相关周期蛋白的变化情况,为进一步阐明维A酸(retinoic acid,RA)诱导腭裂机制提供新的线索。方法:以atRA建立C57BL/6N胎鼠腭裂模型,采用流式细胞术及免疫组化检测小鼠胚胎腭突间充质细胞的周期分布,通过实时定量RT-PCR和Western印记法检测p21和pRb在胎鼠胚胎腭突间充质中的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析和t检验。结果:流式细胞术及免疫组化检测发现,在小鼠妊娠日(gestation day,GD)第10天时给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭突间充质细胞在一定妊娠阶段出现G1期细胞周期阻滞,同时也使胎鼠胚胎腭突间充质内p21和pRb的表达水平出现改变。而妊娠第12天(GD12)时给予atRA则无此现象。结论:p21与pRb参与了GD10时给予atRA诱导组胎鼠胚胎腭突间充质细胞G1期阻滞的发生。

在胚胎发育期腭突中嵴上皮细胞和腭间充质细胞与腭裂畸形

胚胎期腭突中嵴上皮细胞和腭间充质细胞的正常分化与否在腭裂的发生机制中起着重要的作用。近年来,国外学者对这两种细胞与腭裂发生的关系进行了较为深入的研究,结果证明致畸因子干扰其正常分化与腭裂发生有密切关系。

叶酸对小鼠腭突间充质细胞增殖的影响

目的:从细胞水平对维A酸致小鼠腭裂畸形作用和叶酸是否有拮抗维A酸的致畸作用及其机制进行研究。方法:给予孕鼠过量维A酸,诱导胚胎腭裂模型,不完全消化法提取孕期第14天、17天(GD14、17)的胚胎腭突间充质细胞(EPMcells)进行培养并鉴定细胞;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测加入不同浓度叶酸与未加入叶酸细胞增殖的情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学处理。结果:①在GD10、GD12管饲孕鼠50mg/kg维A酸,可致胎鼠腭裂畸形;②不完全消化法提纯EPM细胞,纯度达到98%;③维A酸导致GD14的EPM细胞增殖受到抑制,20μg/mL、40μg/mL浓度叶酸可拮抗这种抑制作用。结论:①过量维A酸可致小鼠腭裂畸形,腭突间充质细胞增殖受抑制是其致畸机制之一;②叶酸可拮抗维A酸对小鼠GD14EPM细胞增殖的抑制作用。

以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞

目的：探讨以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ES细胞）的方法。方法：以鼠间充质干细胞作为饲养层，收集受孕3．5～4d昆明小鼠的囊胚和桑椹胚进行培养，筛选纯化细胞集落，使其稳定传代后，采用光镜，碱性磷酸酶染色及Oct—d染色对其形态学和生物学性状进行初步鉴定。结果：以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养的昆明小鼠ES有其典型的形态学特征：集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚；单个细胞体积小、核大；对ES细胞碱性磷酸酶进行检测，未分化的ES细胞显微镜下为黄褐色，分化的不着色；Oct—d染色阳性。结论：以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞可行，得到的胚胎干细胞能保持特殊的形态和未分化状态。

小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较

目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1amSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BMMNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率。用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性。结果起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织。但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM-MNCs和MEFs来源的克隆数。结论小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs。

地塞米松对A系小鼠胚腭突间充质细胞增殖代谢的影响

目的 研究不同剂量地塞米松(DEX)对A系小鼠胚腭突间充质细胞增殖和DNA、蛋白质及PGE2 合成的影响。方法 实验分为9组,每组设平行4孔(瓶) ,每组分别加入DEX使其终浓度为0 .0 5ng/ml,0 .1ng/ml,0 .5ng/ml,1ng/ml,5ng/ml,1 0ng/ml,5 0ng/ml,1 0 0ng/ml,1 0 0 0ng/ml,每组均设空白对照,在实验后第1、3、5天分别检测细胞的OD值及PGE2 的含量,并在第3天时检测DNA、蛋白质的含量。结果 DEX可显著增加腭突间充质细胞的OD值,促进DNA及蛋白质合成,在含量0 .5ng/ml时DEX的促进生长作用最强。在培养早期DEX轻度降低腭突间充质细胞PGE2 的合成,而在培养后期则表现为显著抑制作用。结论 DEX显著促进腭突间充质细胞的增殖代谢,可能干扰腭突间充质细胞的正常生长代谢而影响了腭发育。

地塞米松对A系小鼠胚腭突间充质细胞表皮生长因子基因表达的影响

目的:研究地塞米松(DEX)对A系小鼠胚腭突间充质细胞表皮生长因子(EGF)基因mRNA表达的影响。方法：将DEX(10ng/ml)加入培养的A系小鼠胚腭突间充质细胞，并在培养第1、3、5天时收集细胞，提取RNA，应用RT-PCR技术半定量检测腭突问充质细胞EGF基因mRNA的表达水平。结果：DEX可显著促进腭突间充质细胞EGF mRNA的表达，并在加入DEX培养第3天时，这种促进EGF mRNA表达的作用最强。结论：DEX显著促进腭突间充质细胞EGF基因的表达，可能干扰腭突间充质细胞EGF基因的表达而影响了腭发育。

大鼠骨髓间充质干细胞作为滋养层培养小鼠胚胎干细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells ESCs)的可能.方法:收集BALB/C小鼠3.5d胎龄的囊胚,接种于大鼠骨髓间充质干细胞的滋养层上,培养5～6d后挑取胚胎干细胞集落,胰酶消化传代.观察细胞集落生长情况,通过碱性磷酸酶染色、细胞核型分析对细胞生物学特性进行检测.结果:ES细胞呈集落性生长,碱性磷酸酶组织化学染色阳性,具有正常核型及多向分化潜能.结论:大鼠MSCs可以作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞,并能保持未分化状态.

TCDD对小鼠腭突间充质细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英(TCDD)对小鼠腭突间充质细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用随机数字表法将SPF级C57BL/6N孕鼠分为TCDD组和对照组,在妊娠第10天(GD10)分别以64μg/kgTCDD和等量玉米油灌胃,取GD13、GD14、GD15胚胎头部,行组织形态学观察。收集GD13正常胎鼠腭组织,分离腭突间充质细胞,用0.0、0.1、1.0、10.0nmol/LTCDD处理72h后,采用MTT法检测细胞增殖并计算增殖抑制率,检测Brdu阳性率,采用荧光定量RT-PCR和Westernblot法检测细胞中PCNA、Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达水平。结果:组织形态学显示TCDD组胎鼠双侧腭突未接触和融合。随着TCDD作用浓度的增加,小鼠腭突间充质细胞增殖抑制率逐渐增加,Brdu阳性率逐渐降低,细胞中Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达逐渐增加,而PCNAmRNA和蛋白表达逐渐降低(P<0.05)。结论:TCDD可能通过抑制腭突间充质细胞的增殖并促进其凋亡,导致腭裂的发生。

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的表达为阳性,SSEA1表达为阴性,体外悬浮培养可以形成拟胚体。结论人脐带间充质干细胞可以作为人胚胎干细胞的饲养层细胞,支持其生长,并维持其未分化生长状态。

胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化

背景:胎盘间充质干细胞已被证实有较强的增殖能力,且能向成骨细胞、成神经细胞、类肝样细胞等诱导分化,但对其成软骨细胞诱导分化的研究不多。目的:在体外诱导人胎盘间充质干细胞成软骨细胞分化。方法:体外培养人胎盘间充质干细胞并鉴定。取第3代胎盘间充质干细胞,调整细胞悬液浓度为1.6×1010 L-1,在24孔板中央分别滴5,10,15μL细胞悬液,培养2 h(目的是形成微团);然后加入间充质干细胞培养基或软骨诱导培养基培养14 d,阿利新蓝染色,进行大体观察及倒置显微镜观察。结果与结论:应用间充质干细胞培养基培养的对照组,细胞增殖形成大量贴壁细胞,贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态;应用软骨诱导培养基培养后,细胞只保持微团,不继续增殖形成贴壁细胞,微团基部无贴壁细胞,随着接种细胞数量的增加,微团直径增大。说明人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力,可作为组织工程、细胞治疗等应用的种子细胞来源。

地塞米松对小鼠腭突细胞增殖和分布的影响

目的:通过比较不同时期正常胎鼠和地塞米松诱导的腭裂胎鼠中间嵴上皮细胞(MEE)和腭突间充质细胞(EPM)的数目和分布情况,初步探讨腭裂形成的机制。方法:选取孕鼠30只,随机分为对照组和实验组,实验组于妊娠GD11.5腹腔内注射50mg/kg地塞米松,干扰胎鼠腭突发育,分别于GD12.5,13.5,14.5,15.5,16.5时取材,共获胚胎284只,取头部标本做冠状切片,切片厚6μm,HE染色,光镜下观察,记录MEE细胞的数量和EPM细胞的数目和分布情况。结果:实验组和对照组腭突突部EPM明显多于根部,且实验组EPM发育滞后于对照组;GD13.5,14.5,15.5时实验组EPM细胞数量少于对照组;实验组MEE细胞在GD15.5,16.5时大量存在,而对照组GD14.5时开始融合甚至消失。结论:地塞米松导致的EPM细胞增殖抑制和MEE细胞的转归异常,是腭裂形成的重要原因。