枸杞多糖主要组分甘露糖及其潜在靶标代谢物肌醇对小鼠胰岛β-TC6细胞的影响

目的初步探讨枸杞多糖主要组分甘露糖及其潜在靶标代谢物肌醇对小鼠胰岛β-TC6细胞的影响。方法以不同浓度(0、4.6875、9.375、18.75、37.5、75和150μg/mL)甘露糖或肌醇干预β-TC6细胞24 h,CCK-8(cell counting kit-8)法测定细胞增殖活性;20 mmol/L葡萄糖联合不同浓度(0、18.75、75和150μg/mL)甘露糖或肌醇干预β-TC6细胞60 min,酶联免疫法检测细胞胰岛素分泌量;设立吡格列酮阳性对照组(3.92 mg/L),经(0、9.375、18.75、75和150μg/mL)甘露糖或肌醇干预24 h后,应用实时荧光定量PCR法检测β-TC6细胞胰岛素、葡萄糖激酶(glucose kinase,GK)、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)以及糖原合成酶(glycogen synthase,GS)mRNA表达水平。结果与空白对照组相比,4.6875~150μg/mL甘露糖和18.75~150μg/mL肌醇均呈浓度依赖性促进β-TC6细胞增殖(P<0.05),4.6875和9.375μg/mL肌醇虽然有促进细胞增殖的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。在20 mmol/L葡萄糖刺激下,18.75、75和150μg/mL甘露糖或肌醇干预后,β-TC6细胞胰岛素分泌量与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,150μg/mL甘露糖组GLUT4 mRNA表达上调(P<0.01),75μg/mL肌醇组GK和GLUT4基因表达水平都上调(P<0.01),18.75μg/mL肌醇仅使GLUT4基因表达上调(P<0.01)。结论甘露糖和肌醇可通过改善GLUT4 mRNA表达水平,从而提高外周细胞对葡萄糖的摄取;此外,肌醇还可以通过上调GK mRNA表达水平以提高胰岛素敏感性,改善葡萄糖代谢。

PLL-Ferumoxytol标记小鼠胰岛β细胞系MIN6的生物活性研究

目的:将多聚赖氨酸(PLL)与本课题组自行制备的超顺磁性氧化铁纳米粒子Ferumoxytol结合,利用PLL修饰的Ferumoxytol标记小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞,初步探索其标记MIN6细胞的可行性、标记效率以及生物安全性等。方法:用Ferumoxytol及PLL修饰的Ferumoxytol与小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞共孵育标记细胞,采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)实验检验MIN6细胞的活力与增殖情况,利用肌动蛋白丝染色观测细胞内部细胞骨架的形貌,普鲁士蓝染色和透射电镜观察被标记的细胞内铁颗粒的分布情况,使用葡萄糖刺激胰岛素释放试验(GSIS)对标记后MIN6细胞的胰岛素合成及分泌功能进行检验和评估。结果:标记后细胞与对照组的形貌以及细胞骨架特性均无显著差异,且均维持了较高活性。添加200μg·ml^-1 PLL-Ferumoxytol共培养24 h可以显著促进细胞增殖。PLL-Ferumoxytol标记组细胞胞质内呈现蓝色铁颗粒,透射电镜结果进一步验证了铁颗粒的分布情况。此外,添加纳米粒子对MIN6细胞胰岛素合成与释放功能无显著影响。结论:本研究小组自行制备的PLL-Ferumoxytol具有良好的生物相容性,能够有效标记小鼠MIN6细胞,对细胞的活性和功能无显著性影响,可以进一步用作胰岛细胞移植的磁标记物并应用于MRI活体示踪。

胰腺部分切除诱导胰岛细胞再生小鼠模型的建立及研究

目的探讨小鼠部分胰腺切除手术诱导的糖尿病以及对胰岛细胞再生的影响,以建立研究胰岛细胞再生的动物模型。方法对3月龄近交品系C57B6小鼠胰腺切除65%～70%,通过代谢方法、糖耐量和免疫组织化学的方法,研究该方法对血糖和胰岛细胞的再生影响,以确定该模型是否能用于糖尿病的研究。结果小鼠胰腺部分切除,术后一周内小鼠糖耐量受损。术后第14天和第28天的糖耐量实验结果表明3月龄小鼠的糖耐量随着时间的推移而逐渐恢复。免疫组化结果显示3月龄小鼠术后1周胰岛β细胞再生率为(15.1±10.0)%,2周为(25.4±8.1)%,4周为(45.7±14.6)%。结论胰腺部分切除手术能够一定程度上诱导小鼠产生糖尿病,并且诱导胰岛β细胞的再生,从而可用于研究胰岛β细胞再生的基础研究。

腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白A2基因过表达及其对细胞增殖的影响

目的探讨腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白A2(cyclin A2)基因过表达及其对细胞增殖的影响。方法将对数生长期的小鼠胰岛素瘤MIN6细胞分为实验组、空病毒对照组及空白对照组,实验组及空病毒对照组分别给予腺病毒介导的cyclin A2基因及空腺病毒载体转染MIN6细胞,空白对照组不给予处理。检测3组MIN6细胞cyclin A2mRNA及蛋白的表达情况,以及细胞增殖活性。结果转染后24 h,实验组cyclin A2 mRNA及蛋白表达水平均高于空病毒对照组及空白对照组(P<0.05);转染后24 h、36 h、48 h、60 h及72 h,实验组的吸光度值均高于空病毒对照组及空白对照组(均P<0.05)。结论腺病毒介导的cyclin A2基因成功转染MIN6细胞,并可促进MIN6细胞增殖。

铁皮石斛对小鼠和胰岛瘤细胞胰岛素抵抗的改善作用

目的:探讨铁皮石斛(DC)对MKR小鼠和MIN6细胞中胰岛素抵抗的作用,并阐明其作用机制。方法:9周龄MKR小鼠随机分为4组,分别灌胃给予10、20、40g·kg-1·d-1 DC和生理盐水(空白对照组),连续给药6周,每2周检测小鼠的血糖,以确定DC降糖作用最佳浓度。8周龄MKR雄鼠随机分为对照组、DC组、二甲双胍(Met)组和联合用药(Met+DC)组,灌胃给予生理盐水和相应药物8周,同时检测小鼠血糖,给药结束后对小鼠进行葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素耐量实验(ITT),采用qPCR法检测小鼠肝脏和皮下脂肪组织中糖脂代谢相关基因表达水平。体外培养MIN6细胞,分为对照组、高浓度棕榈酸(H-PA)组、高浓度葡萄糖(H-Glu)组、H-PA+H-Glu组、H-PA+DC组、H-Glu+DC组和H-Glu+H-PA+DC组,进行葡萄糖刺激下胰岛素分泌能力实验(GSIS),采用MTT法和ELISA法检测各组细胞增殖活性和胰岛素分泌水平,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中PI3K/AKT通路蛋白表达水平。结果:在小鼠体内,DC降糖作用最佳浓度为20g·kg-1·d-1。与对照组比较,DC组、Met组和联合用药组小鼠血糖水平降低(P<0.05);与DC组和Met组比较,联合用药组小鼠血糖水平进一步降低(P<0.05)。GTT和ITT实验,与DC组和Met组比较,联合用药组小鼠糖耐量和胰岛素敏感性明显提高,胰岛素抵抗情况明显改善。与对照组比较,联合用药组小鼠肝组织中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)mRNA表达水平明显降低(P<0.05),葡萄糖激酶(Gck)mRNA表达水平明显升高(P<0.05),Met组和联合用药组小鼠皮下脂肪组织中氧化物酶增殖物激活受体γ(Ppar-γ)mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。在MIN6细胞中,经筛选,选择160μmol·L-1 H-PA和30mmol·L-1 H-Glu诱导MIN6细胞胰岛素抵抗,以1.44g·L-1 DC处理各组细胞。GSIS,分别与H-PA组、H-Glu组和H-PA+H-Glu组比较,加入DC后,H-PA+DC组、H-Glu+DC组和H-PA+H-Glu+DC组MIN6细胞胰岛素分泌水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率降低,磷酸化胰岛素受体底物1(p-IRS-1)、磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达水平明显升高(P<0.05);H-PA+H-Glu+DC组MIN6细胞磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:DC可以改善MKR小鼠的胰岛素抵抗,与Met联合用药后效果更加明显;在体外,DC可以通过PI3K/AKT信号通路改善H-PA和H-Glu诱导的MIN6细胞的胰岛素抵抗,并可增加胰岛素分泌水平,降低细胞凋亡率。

猪胰岛素启动子调控EGFP表达载体的优化及体外验证

目的获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础。方法利用猪胰岛素启动子(PIP,包含5'调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5 kb)构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-Hind IIIEGFP。鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化:将Hind III酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3'端的内含子剪接受体位点(splicing acceptor site,SA)突变为Hind III内切酶识别位点,命名为PIP-SA(M)-EGFP。三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48 h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Western blot检测,验证载体的表达效率。结果转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光。RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异:载体PIP-Hind III-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA(M)-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Western blot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高。结论通过突变胰岛素启动子第一内含子的3'端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪。

辣椒素在小鼠瘤βTC-6细胞中降糖机制的研究

目的探讨辣椒素对小鼠瘤βTC-6细胞胰岛分泌功能的作用及其相关的降糖机制。方法(1)辣椒素对小鼠瘤βTC-6细胞增殖率的影响:在不同浓度的辣椒素(0、10、50、100、200、300μmol/L)作用下,测定小鼠瘤βTC-6细胞的增殖率、胰岛素分泌量和胞内Ca2+的浓度;(2)辣椒素受体(TRPV1)调控试验:筛选合适剂量辣椒素(50μmol/L)和辣椒卓平(15μmol/L),培养48 h后测定TRPV1、胰腺十二指肠同源异形盒1(PDX-1)、胰岛素受体底物1(IRS1)、胰岛素受体底物2(IRS2)和葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)在βTC-6细胞中的蛋白水平。结果辣椒素能够抑制βTC-6细胞增殖,其胞内Ca2+浓度与胰岛素分泌功能密切相关,且辣椒素能显著上调TRPV1、PDX-1、IRS1、IRS2和GLUT2的蛋白水平,但TRPV1通道被辣椒卓平阻断后,这种上调作用显著减弱。结论 (1)在辣椒素剂量为0~50μmol/L条件下,βTC-6胞内Ca2+浓度与其胰岛素分泌量正相关;(2)辣椒素对胰岛细胞的刺激是其降糖作用的主要来源,与胰岛细胞的增殖无关,且胰岛细胞中可能存在TRPV1–PDX-1–GLUT2/IRS1信号通路。

IGF-1通过PI3K/Akt信号通路诱导神经干细胞向神经元分化

目的观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对体外培养神经干细胞(NSCs)向神经元分化的影响,并探讨PI3K/Akt信号通路与之的关系。方法取新生C57BL/6J小鼠海马组织,分离、培养NSCs,将细胞团吹散,以1×104个/mL密度接种于24孔板,分别加入终浓度100 ng/mL的IGF-1和50μmol/L的PI3K/Akt通路特异抑制剂LY294002,根据处理的情况,将细胞分为IGF-1组、正常对照组、LY组和IGF-1+LY组。βⅢTubulin免疫荧光细胞化学染色法检测NSCs分化为神经元的情况,DAPI染核计细胞总数;p-Akt免疫荧光染色检测各组细胞Akt磷酸化的情况;Western blotting法检测Akt和p-Akt蛋白的表达量,并对各组进行比较。结果 IGF-1组NSCs向神经元分化的比率显著高于对照组、LY组和IGF-1+LY组(P均<0.05);免疫荧光染色结果显示,IGF-1组Akt磷酸化水平显著高于对照组、LY组和IGF-1+LY组(P均<0.05);Western blotting结果显示,IGF-1促进Akt磷酸化,LY294002抑制Akt的磷酸化。结论 IGF-1诱导Akt的磷酸化,从而激活PI3K/Akt信号通路,促进NSCs向神经元分化。

黄芪降糖颗粒降糖作用实验研究

目的:观察黄芪降糖颗粒对链脲佐菌素(STZ)所致的2型糖尿病小鼠的降糖作用。方法:80只SPF级雄性C57BL/6小鼠,4～5周龄,维持饲料喂养1周,按随机数字表法,随机抽取10只作为正常组,其余70只采用KK饲料喂养加60mg·kg-1的STZ ip诱导糖尿病,造模成功60只。随机分为黄芪降糖颗粒低、中、高剂量组(1.0,2.0,3.0 g·kg-1),盐酸二甲双胍片组(0.3 g·kg-1)、参芪降糖颗粒组(0.2 g·kg-1)、模型组,每组各10只。各组ig给药,正常组与模型组给同体积蒸馏水,每日1次,连续14 d。观察黄芪降糖颗粒对小鼠空腹血糖(FBG)、体重(Weight)、血清胰岛素(Ins)的影响及胰岛β细胞病理改变情况。结果:各治疗组均能明显降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖,增加血清胰岛素含量,有效控制小鼠体重降低,改善胰岛β细胞损坏。与模型组的空腹血糖、血清胰岛素和体重值(28.88±6.79)mmol·L-1,(9.69±2.66)mU·L-1,(20.00±1.18)g比较,黄芪降糖颗粒高剂量组(13.20±2.02)mmol·L-1,(18.98±1.41)mU·L-1,(26.08±0.63)g和盐酸二甲双胍片组(13.40±1.92)mmol·L-1,(17.33±1.23)mU·L-1,(25.83±0.89)g均有显著差异(P<0.01),黄芪降糖颗粒低剂量组(19.35±2.02)mmol·L-1,(15.89±1.38)mU·L-1,(25.69±0.44)g和参芪降糖颗粒组(20.38±1.93)mmol·L-1,(15.80±1.21)mU·L-1,(22.90±0.74)g均有统计学意义(P<0.05)。结论:黄芪降糖颗粒能明显降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖,增加血清胰岛素含量,对胰岛β细胞具有修复作用。