CXCL1通过促进蛋白激酶B磷酸化导致bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞骨架收缩和通透性增加

目的探讨脓毒症脑病炎症中CXC趋化因子配体1(CXCL1)及其受体CXC趋化因子受体2(CXCR2)对脑内皮细胞骨架重排和通透性的影响及其相关机制。方法野生型小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立脓毒症脑病模型,ELISA检测全脑组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CXCL1含量。使用500 ng/mL LPS和200 ng/mL TNF-α刺激bEND.3脑微血管内皮细胞后,Western blot法检测细胞CXCR2的表达。以150 ng/mL CXCL1刺激bEND.3细胞,免疫荧光染色观察脑内皮细胞骨架纤维型肌动蛋白(F-actin)重排的变化。脑内皮细胞通透性实验中,将bEND.3细胞随机分为PBS对照组、CXCL1组、CXCL1联合选择性CXCR2拮抗剂SB225002组,Transwell^(TM)小室检测各组通透性变化情况。CXCL1刺激bEND.3细胞后,Western blot法检测细胞中蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达。结果腹腔注射LPS导致小鼠全脑组织中TNF-α和CXCL1水平显著升高;LPS和TNF-α刺激可增高bEND.3细胞CXCR2蛋白的表达。CXCL1刺激bEND.3细胞使其细胞骨架收缩,细胞间隙形成增加,且细胞渗透性增加,而CXCR2拮抗剂SB225002预处理可显著抑制CXCL1引起的脑内皮细胞肌动蛋白应力纤维和细胞间隙的形成、以及通透性的增高,同时CXCL1(150 ng/mL)刺激使得脑内皮细胞AKT的磷酸化水平明显升高。结论CXCL1通过AKT磷酸化激活引起脑内皮细胞骨架收缩、细胞通透性增加,CXCR2拮抗剂SB225002可有效抑制CXCL1诱导的细胞骨架收缩和通透性升高。

活血定眩胶囊含药血清减轻小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3缺氧损伤

目的:研究活血定眩胶囊含药血清对抗缺氧所致小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3损伤的作用。方法:将30只大鼠随机分为空白对照组15只和活血定眩胶囊组15只,采集2组大鼠血清。将bEnd.3细胞分为正常组、缺氧模型组和活血定眩胶囊血清组,给药后,bEnd.3细胞缺氧6 h。显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期,按试剂盒方法检测细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。结果:活血定眩胶囊含药血清可显著对抗缺氧造成的损伤,明显改善bEnd.3细胞的形态,使缺氧所致细胞凋亡数明显减少,有效抑制缺氧诱导的bEnd.3细胞发生G_1/S期阻滞,抑制MDA生成,增强SOD活性。结论:活血定眩胶囊对缺氧所致bEnd.3细胞的损伤具有明显的对抗作用,其机制与增强细胞抗氧化能力、抑制细胞凋亡有关。

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。

辅酶Q_(10)对体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞凋亡和增殖的影响

目的 :研究辅酶Q10 抑制血管内皮细胞凋亡和增殖的作用及其可能机制。方法 :用血清药理学方法和流式细胞仪法检测体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞 (bEnd .3 )中不同浓度CoQ10 对细胞凋亡和增殖的变化。用免疫细胞化学ABC法观察Fas蛋白及Bcl-2蛋白表达的变化。结果 :与对照组比 (加不含药血清 ) ,在bEnd .3细胞培养中加入 50 μL、2 5μL、12 5μL含CoQ10 的血清组细胞凋亡明显抑制 (P <0 0 5)。免疫细胞化学检验结果证明 ,此时Fas蛋白表达明显减弱 ,而Bcl-2蛋白表达明显增强 (P <0 0 5)。但CoQ10 对细胞增殖影响不显著。结论 :一定浓度的CoQ10 能通过上调Bcl-2蛋白和下调Fas蛋白表达抑制小鼠微血管内皮细胞凋亡 。

桂枝汤有效成分苯丙烯类化合物干预IL-1β刺激小鼠脑微血管内皮细胞释放PGE_2的构效关系

To observe the effects of phenylallyl compounds on prostaglandin E2（PGE2）release in mouse cerebral microvascular endothelial cells （bEnd.3） stimulated by IL-1β, and to analyze their structure-activity relationship. Different concentrations of phenylallyl compounds were added separately, and the content of PGE2 induced by IL-1β in the culture media was measured by ELISA assay. The 50% inhibitory concentration （IC 50 ） of PGE2 was calculated. Studies showed that phenylallyl compounds could affect the PGE2 release differently in bEnd.3 cells induced by IL-1β. Close relationships were shown between the inhibitory activities and the location and number of the substituent groups. In conclusion, phenylallyl compounds exhibited inhibitory activities at different extent on PGE2 release in bEnd.3 cells stimulated by IL-1β and presented certain structure-activity relationship.

吗啡和哌替啶对小鼠脑微血管内皮细胞P-糖蛋白表达的影响

目的观察临床浓度的吗啡和哌替啶对小鼠脑微血管内皮细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响,以及NF-κB信号通路在吗啡诱导P-gp表达中的作用。方法采用小鼠脑微血管内皮细胞,以1μg/ml吗啡或哌替啶刺激24h,5μmol/LNF-κB抑制剂PDTC预先孵育1h,然后收集细胞,行Westernblotting分析P-gp表达。结果 1μg/ml吗啡处理24h,可引起小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达上调,上调幅度约300%;但是同样剂量和作用时间的哌替啶不影响小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达。PDTC可抑制吗啡诱导小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达上调。结论吗啡可诱导小鼠脑微血管内皮细胞内源性P-gp表达上调,NF-κB信号通路参与了吗啡诱导P-gp表达的调控过程。

LPS诱导小鼠脑微血管内皮细胞通透性增高的分子机制(英文)

目的:探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对小鼠脑微血管内皮细胞通透性的影响及其可能的分子机制。方法:以培养至融合的小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3为实验对象,利用跨内皮细胞电阻抗(transendothelial electrical resistance,TEER)检测LPS对bEnd.3细胞屏障功能的改变及C3转移酶预处理后对其的影响。Pull down法和报告基因法分别测定RhoA和NF-κB活性。直接荧光染色法观察bEnd.3细胞F-actin的分布变化。结果:LPS作用3h后,bEnd.3细胞TEER值明显下降[(53.67±2.01)Ω·cm2],作用12h后达最低[(37.67±3.05)Ω·cm2],3,6,12h组与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。C3转移酶预处理后,LPS作用3,12h时细胞TEER值分别为(60.67±4.05)Ω·cm2和(40.60±2.33)Ω·cm2,均比相应时间点未预处理细胞的TEER值高,差异有统计学意义(P<0.05)。LPS作用bEnd.3细胞0.5h后RhoA明显活化,NF-κB活性增加,C3转移酶预处理后其NF-κB活性明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。直接荧光染色发现在LPS作用3h后细胞出现明显的F-actin重构,其程度随LPS作用时间的延长而加重,而C3转移酶预处理细胞F-actin重构发生较晚且程度较轻。结论:LPS通过使F-actin重组增加脑微血管内皮细胞的通透性,RhoA和NF-κB均参与此过程,且NF-κB信号分子受RhoA调控。

无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法 培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd .3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl- 2蛋白表达;用WesternBlot检测caspase 3蛋白表达。结果 bEnd .3细胞经无血清饥饿体外培养12 ,2 4 ,36h后细胞凋亡率明显增加,分别为(13.79±0 .99) % ,(17.80±1.39) % ,(2 0 .5 1±0 .5 5 ) % ,与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比,P <0 .0 1。Bax表达明显增强,Bcl -2表达明显减弱,caspase 3明显增强。结论 无血清饥饿培养可诱导bEnd .3细胞发生凋亡,其发生机制与Bax/Bcl 2的变化及caspase 3的激活有关。

小鼠脑微血管内皮细胞的培养及其生物学行为初探

目的建立一种简捷易行的小鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,并观察其在IL-1β刺激下PGE2分泌情况。方法通过对以往文献报道方法的改进,使用"二次过筛法"成功培养小鼠脑微血管内皮细胞,并用免疫细胞化学法检测其Ⅷ因子相关抗原的表达情况,鉴定血管内皮细胞的纯度。使用ELISA法检测其在IL-1β刺激下PGE2的分泌情况。结果该法培养的细胞具备小鼠脑微血管内皮细胞的形态,可见细胞融合,95%以上的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。且其PGE2的分泌与IL-1β的刺激呈现良好的时效、量效线性关系。结论该法能简捷地培养小鼠脑微血管内皮细胞,所培养细胞保留有分泌PGE2的生物学行为,可用于脑血管疾病相关研究。

高迁移率族蛋白1对小鼠脑微血管内皮细胞P-糖蛋白表达的影响

目的癫痫脑内可大量释放高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein 1,HMGB1),但针对HMGB1与癫痫脑内血管内皮细胞过表达的耐药蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)关系的研究甚少。文中探讨HMGB1对体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达的影响。方法体外培养永生化小鼠脑微血管内皮细胞株b End.3,分为不同浓度HMGB1组(10、100、500、1000 ng/m L HMGB1处理b End.3细胞8 h);不同时间HMGB1处理组(以100 ng/m L HMGB1处理b End.3细胞4、8、16、24、32 h);对照组(给予等量正常培养基)。采用实时定量PCR检测b End.3细胞中P-gp编码基因多药耐药基因1a(mdr1a)mRNA表达水平,免疫印迹法、免疫细胞化学法检测P-gp蛋白表达水平。结果 q PCR结果显示:10、100、500、1000ng/m L HMGB1组mdr1a mRNA表达量分别为1.646±0.176、1.777±0.135、1.617±0.043和1.398±0.182,较对照组(1.030±0.284)明显升高(P<0.05)。HMGB1处理4、8、16、24、32 h组mdr1a mRNA表达量分别为2.655±0.112、2.168±0.212、1.823±0.232、1.418±0.376和1.445±0.123,较对照组(1.010±0.164)明显升高(P<0.05)。免疫印迹法结果显示:与对照组比较,各浓度组P-gp蛋白表达水平均增高(P<0.05),HMGB1处理8、16 h组P-gp蛋白表达增高(P<0.05)。免疫细胞化学染色结果显示:100 ng/m L HMGB1处理16 h后P-gp蛋白表达灰度值(110.843±4.036)较对照组(160.303±2.193)明显减少(P<0.01)。结论 HMGB1能够上调小鼠脑微血管内皮细胞耐药蛋白P-gp和其编码基因mdr1a表达,可能与中枢神经系统疾病尤其是癫痫的耐药相关。

清开灵注射液对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧模型紧密连接蛋白claudin-5的影响

目的观察缺氧对脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5表达的影响及清开灵的干预作用。方法体外培养Balb/c小鼠脑微血管内皮细胞,分为正常组、模型组和清开灵小中大剂量组,采用氧糖剥夺24h模拟缺血损伤,荧光定量PCR法检测Claudin-5mRNA的转录水平,western blot法检测蛋白表达。结果缺氧损伤后,Claudin-5mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,清开灵小、中、大各剂量组都有改善趋势,其中小、大剂量对基因转录水平提高明显,中剂量对蛋白表达的增强更显著,具有统计学意义(P<0.05)。结论清开灵通过调节紧密连接蛋白claudin-5表达,改善血脑屏障通透性从而阻抑脑缺血反应过程。

一种简易稳定的乳小鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法

目的寻找一种简单并稳定的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法。方法采用两次酶消化法及4℃梯度离心法获得细胞,光镜和电镜下观察细胞形态,用检测Ⅷ因子相关抗原等方法鉴定细胞。结果光镜下细胞呈多角形或短梭形,岛屿样聚集,随细胞生长及不断融合而出现"漩涡状"、"铺路石"样排列。电镜下观察可见紧密连接结构。Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性。结论上述方法可获得纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞,为其原代培养提供了一种经济、简易、重复性好的操作方法,也为进一步的生理、生化、药理及体外血脑屏障或共培养等方面的研究提供了材料来源。

Alpha-黑素细胞刺激素及其新型类似物对小鼠脑微血管内皮细胞产生组织因子的抑制作用

目的：研究Alpha-黑素细胞刺激素（α-MSH）及其新型类似物（STY39）对原代小鼠脑微血管内皮细胞（ MBMEC）在脂多糖（ LPS）刺激下产生组织因子（ TF）和组织因子途径抑制物（ TFPI）的影响。方法选用雌性BALB/c小鼠,纯化并原代培养MBMEC,培养至57 d,采用免疫荧光法检测Ⅷ因子相关抗原,鉴定MBMEC模型。将MBMEC分为PBS对照组,LPS刺激组,LPS刺激后1、2、3 h加入10-7mol/L的α-MSH或STY39组（LPS＋α-MSH,LPS＋STY39）,共8组,每组4孔。分别在LPS刺激后6 h和8 h收集细胞培养上清液和细胞,应用酶联免疫吸附法检测细胞上清液的TF和TFPI浓度,RT-PCR检测细胞TF mRNA表达水平。结果（1） LPS 可诱导 MBMEC 产生 TF 和TFPI蛋白,细胞培养上清液中TF水平于6 h达到高峰, TFPI水平于8 h达到高峰。（2） LPS刺激 MBMEC后1、2、3 h给予10-7mol/L的α-MSH或 STY39,均可显著降低细胞上清液中 TF蛋白含量（P〈0.01）,尤其在 LPS刺激后1 h给予α-MSH 或 STY39的效果最显著（P 〈0.05）, STY39降低TF含量的作用较α-MSH明显（P〈0.05）；但α-MSH和STY39对LPS诱导MBMEC产生TFPI均没有显著的上调作用。（3）在LPS刺激后不同时间点给予10-7mol/L的α-MSH 或STY39,均可显著下调MBMEC TF mRNA的表达水平（P〈0.01）,其中1 h时间点作用最显著（P〈0.05）,但α-MSH与STY39的作用差异无统计学意义。结论α-MSH和 STY39均能抑制LPS诱导原代 MBMEC 产生 TF 蛋白和表达 TF mRNA,且 LPS 刺激1 h 后给药效果较好；STY39对MBMEC产生TF蛋白的抑制作用优于α-MSH。

小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

目的 探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物(TPA)活性测定。 方法 取新生小鼠脑组织 ,通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养 ,待细胞铺满瓶底时 ,用 0 .12 5 %胰酶 - 0 .0 2 % EDTA消化 ,离心收集内皮细胞 ,进行传代培养。原代、传代各取 8例 ,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试 TPA活性。 结果 经 因子相关抗原免疫组织化学鉴定、细胞超微结构观察 ,证明培养的是血管内皮细胞。培养的脑微血管内皮细胞能合成分泌 TPA。 结论 鼠脑微血管内皮细胞的培养为体外研究脑血管疾病提供了可靠的手段。

白藜芦醇对体外高糖刺激下小鼠脑微血管内皮细胞解偶联蛋白基因表达的影响

目的观察高糖对小鼠脑微血管内皮细胞解偶联蛋白(uncoupling protein,UCP)基因表达的影响,并探讨白藜芦醇的调节作用。方法通过体外培养小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3,采用RT-PCR方法观察不同浓度葡萄糖(5.5,25mmol/L)刺激及白藜芦醇(25μmol/L)干预时UCP基因表达的变化。结果 25mmol/L葡萄糖糖刺激24h能上调UCP4、UCP5 mRNA表达(P<0.05),而对UCP1、UCP2基因表达无明显影响;白藜芦醇能上调基础状态及高糖状态下的UCP5基因表达(P<0.05),能抑制高糖引起的氧自由基增加(P<0.05)。结论高糖刺激可特异性上调小鼠脑微血管内皮细胞UCP4、UCP5基因表达;白藜芦醇能降低高糖诱导的氧自由基生成,同时上调细胞UCP5基因的表达。

小鼠脑微血管内皮细胞与隐球菌作用前后基因表达谱分析

目的比较小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3细胞与隐球菌作用前后基因表达谱的变化,为隐球菌的嗜中枢性研究提供新的线索。方法采用基因芯片法比较bEnd.3细胞与不同血清型隐球菌作用前后基因表达谱的变化,并进一步通过荧光定量PCR的方法对某些重要基因的变化加以验证。结果我们对bEnd.3与隐球菌作用前后基因表达进行了对比,共获得差异基因383条,其中263条基因表达下降,120条基因表达上升,并根据比较结果选取了黏附分子CDH10及硒转运蛋白SELENBP1两个基因进行荧光定量PCR验证,结果与芯片结果一致。发现bEnd.3与隐球菌作用后CDH10表达明显下降,而SELENBP1表达明显上升。结论隐球菌能引起脑血管内皮细胞黏附分子CDH10表达下降及硒结合蛋白selenbp1表达上升,这可能与其侵袭血脑屏障有关。而SELENBP 1的表达上升可能与神经系统症状有关。

人胎盘组织液在小鼠脑微血管内皮细胞增殖中的作用研究

目的:研究人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响。方法:采用细胞计数和MTT法观察不同稀释度人胎盘组织液作用72 h后,小鼠脑微血管内皮细胞增殖情况。同时以免疫组织化学法检测不同稀释度人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响。结果:一定稀释度的人胎盘组织液可促进小鼠脑微血管内皮细胞的增殖,25 ml/L即可发挥作用,200 ml/L作用最明显。小鼠脑微血管内皮细胞PCNA表达阳性率与人胎盘组织液稀释度呈剂量相关性。结论:人胎盘组织液可促进体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞增殖。

小鼠脑微血管内皮细胞与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析

目的探索新生隐球菌GXM能否影响脑微血管内皮细胞基因的表达,为进一步研究隐球菌嗜中枢性的分子机制提供线索。方法使用Roche Nimble Gen 12×135K小鼠基因表达谱芯片,筛选小鼠脑微血管内皮细胞系b End.3与不同浓度新生隐球菌GXM作用后差异表达的基因;结合基因本体论(Gene Ontology),使用top GO进行差异基因GO分析,结合GO语义挖掘与隐球菌侵袭中枢神经系统能力相关的差异表达基因的信息;采用荧光实时定量PCR对重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1的表达水平变化加以验证。结果 b End.3细胞与新生隐球菌GXM作用前后基因表达对比发现,实验组GXM(90μg/m)组总共有402个基因表达上调,296个基因表达下调,GXM(180μg/m)组总共有421个基因表达上调,564个基因表达下调,细胞膜、细胞骨架、磷酸肌醇-3-激酶活化、1-磷酸肌醇-3-激酶活化、细胞紧密连接等生物过程差异表达基因较为富集;对PIK3C2G基因和ADAMDEC1基因表达水平变化进行荧光定量PCR验证,结果与芯片结果一致,基因表达水平不同程度上升,且与GXM浓度正相关。结论新生隐球菌GXM能够影响脑微血管内皮细胞基因表达,PIK3C2G基因、ADAMDEC1基因表达上调可能和隐球菌穿越血脑屏障有关。

桂枝汤及其体外消化道模拟产物对于小鼠脑微血管内皮细胞株分泌功能的影响

目的观察桂枝汤及其体外消化道模拟产物对于白细胞介素-1β(IL-1β)介导的小鼠脑微血管内皮细胞株b End.3分泌功能的影响。方法选取小鼠脑微血管内皮细胞株b End.3细胞,分为正常组,对照组,5%,10%和20%桂枝汤含药血清组及5%,10%和20%模拟药组。比较各组前列腺素E2(PGE2)、前列腺素(PGES)、分泌型磷脂酶A2(s PLA2)、15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)和胞浆型磷脂酶A2(c PLA2)表达水平。结果在不同浓度桂枝汤含药血清和模拟药组中,PGE2、PGES、s PLA2及15-PGDH和c PLA2含量均随着血清含药浓度升高而逐渐下降且有统计学意义(P均<0.05);桂枝汤含药血清和模拟药相同药物浓度组中,各指标含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论桂枝汤及其体外消化道模拟产物对于IL-1β介导的小鼠脑微血管内皮细胞株b End.3细胞分泌功能具有相似效果,可为模拟产物应用开发提供支持。