CXCL1通过促进蛋白激酶B磷酸化导致bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞骨架收缩和通透性增加

目的探讨脓毒症脑病炎症中CXC趋化因子配体1(CXCL1)及其受体CXC趋化因子受体2(CXCR2)对脑内皮细胞骨架重排和通透性的影响及其相关机制。方法野生型小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立脓毒症脑病模型,ELISA检测全脑组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CXCL1含量。使用500 ng/mL LPS和200 ng/mL TNF-α刺激bEND.3脑微血管内皮细胞后,Western blot法检测细胞CXCR2的表达。以150 ng/mL CXCL1刺激bEND.3细胞,免疫荧光染色观察脑内皮细胞骨架纤维型肌动蛋白(F-actin)重排的变化。脑内皮细胞通透性实验中,将bEND.3细胞随机分为PBS对照组、CXCL1组、CXCL1联合选择性CXCR2拮抗剂SB225002组,Transwell^(TM)小室检测各组通透性变化情况。CXCL1刺激bEND.3细胞后,Western blot法检测细胞中蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达。结果腹腔注射LPS导致小鼠全脑组织中TNF-α和CXCL1水平显著升高;LPS和TNF-α刺激可增高bEND.3细胞CXCR2蛋白的表达。CXCL1刺激bEND.3细胞使其细胞骨架收缩,细胞间隙形成增加,且细胞渗透性增加,而CXCR2拮抗剂SB225002预处理可显著抑制CXCL1引起的脑内皮细胞肌动蛋白应力纤维和细胞间隙的形成、以及通透性的增高,同时CXCL1(150 ng/mL)刺激使得脑内皮细胞AKT的磷酸化水平明显升高。结论CXCL1通过AKT磷酸化激活引起脑内皮细胞骨架收缩、细胞通透性增加,CXCR2拮抗剂SB225002可有效抑制CXCL1诱导的细胞骨架收缩和通透性升高。

HECTD1调控PI3K/AKT信号通路对低氧诱导的脑微血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨低氧应激下HECT结构域E3泛素连接酶1(HECTD1)对脑微血管内皮细胞(BMECs)的影响及其功能机制。方法BMECs细胞在1%O_(2)的条件下培养以诱导低氧刺激。使用多种细胞生物学功能实验测定来评估BMECs中低氧诱导的损伤。乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的检测以评估低氧诱导的氧化应激水平。Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果在常氧条件下,过表达HECTD1可以提高BMECs的细胞活力。在低氧条件下,过表达HECTD1显著减轻了低氧诱导的细胞活力抑制作用。此外过表达HECTD1降低了低氧诱导的BMECs细胞凋亡和氧化应激。结论HECTD1通过阻断PI3K/AKT信号通路来保护BMECs免受低氧应激诱导的损伤,这表明HECTD1在低氧相关的脑疾病中具有治疗价值。

活血定眩胶囊含药血清减轻小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3缺氧损伤

目的:研究活血定眩胶囊含药血清对抗缺氧所致小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3损伤的作用。方法:将30只大鼠随机分为空白对照组15只和活血定眩胶囊组15只,采集2组大鼠血清。将bEnd.3细胞分为正常组、缺氧模型组和活血定眩胶囊血清组,给药后,bEnd.3细胞缺氧6 h。显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期,按试剂盒方法检测细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。结果:活血定眩胶囊含药血清可显著对抗缺氧造成的损伤,明显改善bEnd.3细胞的形态,使缺氧所致细胞凋亡数明显减少,有效抑制缺氧诱导的bEnd.3细胞发生G_1/S期阻滞,抑制MDA生成,增强SOD活性。结论:活血定眩胶囊对缺氧所致bEnd.3细胞的损伤具有明显的对抗作用,其机制与增强细胞抗氧化能力、抑制细胞凋亡有关。

miRNA-589-5p调控氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞损伤的机制

目的 微小核糖核酸-589-5p(miRNA-589-5p)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)3对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞(HBMEC)损伤的影响,并探索其潜在的作用机制。方法 HBMEC细胞分为对照组、氧糖剥夺组;运用脂质体法将氧糖剥夺+miRNA-con组(转染miRNA-con)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p组(转染miRNA-589-5p的模拟物序列)、氧糖剥夺+miRNA-si-con组(转染miRNA-si-con)、氧糖剥夺+si-HDAC3组(转染si-HDAC3)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p+pcDNA组(共转染miRNA-589-5p的模拟物序列和pcDNA)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3组(共转染miRNA-589-5p mimics和pcDNA-HDAC3)转染至HBMEC,并行氧糖剥夺处理;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western印迹检测细胞中miRNA-589-5p、HDAC3 mRNA表达和HDAC3、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2、核因子2相关因子(NRF)2、血红素氧合酶(HO)-1蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH);膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)试剂盒检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞荧光活性。结果 与对照组相比,氧糖剥夺组细胞miRNA-589-5p表达水平明显降低,HDAC3表达、LDH、细胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达、NRF2/HO-1信号通路关键基因NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表达均显著降低(P<0.05);过表达miRNA-589-5p或沉默HDAC3均可明显抑制氧糖剥夺对HBMEC细胞上述指标的调控。双荧光素酶报告实验显示,miRNA-589-5p明显抑制野生型HDAC3细胞的荧光活性,并负向调控HDAC3的蛋白表达。过表达HDAC3部分逆转过表达miRNA-589-5p对氧糖剥夺诱导HBMEC细胞的LDH、凋亡的抑制和NRF2/HO-1信号通路的激活作用。结论 miRNA-589-5p抑制氧糖剥夺对HBMEC细胞的损伤,其作用机制与靶向HDAC3,激活NRF2/HO-1信号通路有关。

基于TRPM2/Akt/GSK3β通路探讨24-乙酰泽泻醇A保护脑缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞的机制

目的:探讨24-乙酰泽泻醇A(24A)改善小鼠脑缺血再灌注后脑微血管内皮细胞(BMECs)损伤的作用机制。方法:将45只雄性10周龄C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、24A组,每组15只。模型组、24A组采用20 min双侧颈总动脉结扎后再灌注的方法构建小鼠脑缺血再灌注损伤(CI/RI)模型,假手术组小鼠只分离颈总动脉和迷走神经,不结扎。24 A组采用24 A灌胃,剂量为30 mg/(kg·d);假手术组和模型组则给予等体积的生理盐水进行灌胃,3组均灌胃1次/d,连续干预7 d。分别采用神经功能缺损评分(mNSS)评估小鼠神经功能受损程度;采用新物体识别测试(NORT)和水迷宫(MWM)评价小鼠认知功能;采用免疫荧光法检测内皮细胞CD31表达;采用Western blot法检测脑组织闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白-5(Claudin-5)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、瞬时受体电位离子通道-2(TRPM2)、磷酸化苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-GSK3β)蛋白表达水平。结果:①神经功能:与假手术组比较,模型组mNSS在第1、3、5、7天均明显升高(P<0.05);与模型组比较,24A组第3、7天mNSS明显降低(P<0.05)。②认知功能:与假手术组比较,模型组NORT 1、24 h识别指数明显降低(P<0.05);与模型组比较,24A组NORT 1、24 h识别指数明显升高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组干预后第2~4天逃避潜伏期明显延长,穿越目标平台次数明显减少(P<0.05);与模型组比较,24A组干预后第3、4天逃避潜伏期明显缩短,穿越目标平台次数明显增加(P<0.05)。③内皮细胞CD31、ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达:假手术组CD31荧光表达较为密集,呈现红色荧光;与假手术组比较,模型组CD31荧光表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,24A组CD31荧光表达明显升高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显下降(P<0.05);与模型组比较,24A组ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显升高(P<0.05)。④p-NF-κB、IL-1β、TNF-α、TRPM2、p-Akt、p-GSK3β蛋白表达:与假手术组比较,模型组p-NF-κB、IL-1β、TNF-α、TRPM2表达明显增加,p-Akt、p-GSK3β表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,24A组p-NF-κB、IL-1β、TNF-α、TRPM2蛋白表达水平明显下降,p-Akt、p-GSK3β表达明显增加(P<0.05)。结论:24A可有效改善CI/RI小鼠的神经功能、认知功能,降低炎症反应,改善BMECs损伤,其机制可能与TRPM2/Akt/GSK3β通路的调控有关。

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。

PI3K/Akt信号转导通路对脑微血管内皮细胞生物学行为的影响

目的观察PI3K特异性抑制剂LY294002对脑微血管内皮细胞迁移、增殖和血管发生改变及PI3K/Akt信号途径的影响。方法不同浓度(5、10及20μmol/L)LY294002处理后,用体外"伤口愈合"实验、细胞增殖试剂盒和缺乏生长因子的Matrigel胶观察内皮细胞迁移、增殖和血管发生情况,并用Western印迹法检测磷酸化PI3K和磷酸化Ak(t苏氨酸308)的表达变化。结果与正常对照组相比,实验组脑微血管内皮细胞迁移明显减少(均P<0.01)、细胞存活率降低(均P<0.01)、血管发生改变(包括血管床面积、平均血管长度、毛细血管数和血管分支点数)及磷酸化PI3K、磷酸化Akt(苏氨酸308)的表达均降低(均P<0.05或P<0.01),且随LY294002浓度增高抑制作用增强(均P<0.05或P<0.01)。结论 PI3K/Akt信号途径下调可抑制内皮细胞的迁移、增殖和血管发生。

通络救脑注射液及其组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3表达及其功能的影响

目的:观察通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞谷氨酸受体3(glutamate receptor 3,GluR3)表达及其功能的影响。方法:采用大鼠原代培养脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血模型,分别用通络救脑注射液及其2组分栀子苷、三七总皂苷对细胞进行干预,采用PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中GluR3 mRNA及蛋白表达水平,并用免疫蛋白印迹法检测GluR3调节的下游分子基质金属蛋白酶诱导因子CD147、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表达情况。结果:通络救脑注射液及其组分能够从基因到蛋白水平显著下调GluR3的表达,对CD147、MMP-9也有显著下调作用,且通络救脑注射液疗效优于2组分。结论:通络救脑注射液及其组分可调节拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3的表达及其功能,这可能是其在脑缺血性损伤中保护血脑屏障、减轻炎症反应的机制之一。通络救脑注射液效果优于2组分,显示了复方配伍发挥整合调节的疗效优势。

lncRNA MALAT1靶向miR-532-3p对脑出血继发脑损伤大鼠脑微血管内皮细胞模型凋亡和氧化损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)肺癌转移相关转录本1(MALAT1)靶向miR-532-3p对脑出血(ICH)继发脑损伤的大鼠脑微血管内皮细胞(RCMECs)凋亡和氧化损伤的影响。方法采用双重荧光素酶报告基因实验和实时定量PCR(RT-qPCR)确定MALAT1和miR-532-3p的靶向调控关系。首先将细胞分为对照组(正常培养的RCMECs)与模型(H_(2)O_(2))组(RCMECs氧化损伤模型),采用RT-qPCR分析并对比两组MALAT1和miR-532-3p的表达量。随后将细胞分为H_(2)O_(2)-si-NC组、H_(2)O_(2)-si-MALAT1组、H_(2)O_(2)-miR-mimics-NC组、H_(2)O_(2)-miR-532-3p mimics组、H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC组、H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor组,分别转染si-NC、si-MALAT1、miR-mimics-NC、miR-532-3p mimics、共转染si-MALAT1与miR-inhibitor-NC、共转染si-MALAT1与miR-532-3p inhibitor后,构建RCMECs氧化损伤模型,然后采用流式细胞术分析RCMECs凋亡情况,采用试剂盒测定丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,采用蛋白质印迹法(Wes-tern blot)检测B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2和Bcl相关x蛋白(Bax)表达量,并比较组间差异。结果MALAT1可与miR-532-3p特异性结合并负调控miR-532-3p表达(P<0.05)。与对照组比较,H_(2)O_(2)组中MALAT1的表达量显著升高,miR-532-3p的表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与H_(2)O_(2)-si-NC组比,H_(2)O_(2)-si-MALAT1组沉默MALAT1可显著减弱H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡,并降低MDA含量、升高SOD和CAT活性、降低Bax蛋白相对表达量、升高Bcl-2蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。与H_(2)O_(2)-miR-mimics-NC组比,H_(2)O_(2)-miR-532-3p mimics组过表达miR-532-3p可显著减弱H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡,并降低MDA含量、升高SOD和CAT活性、降低Bax蛋白相对表达量、升高Bcl-2蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。与H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC组比,H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor组沉默MALAT1同时抑制miR-532-3p表达,可显著增加H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡,并升高MDA含量、降低SOD和CAT活性、升高Bax蛋白相对表达量、降低Bcl-2蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论沉默MALAT1通过负调控miR-532-3p能够减弱H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡和氧化损伤。

一种简易稳定的乳小鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法

目的寻找一种简单并稳定的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法。方法采用两次酶消化法及4℃梯度离心法获得细胞,光镜和电镜下观察细胞形态,用检测Ⅷ因子相关抗原等方法鉴定细胞。结果光镜下细胞呈多角形或短梭形,岛屿样聚集,随细胞生长及不断融合而出现"漩涡状"、"铺路石"样排列。电镜下观察可见紧密连接结构。Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性。结论上述方法可获得纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞,为其原代培养提供了一种经济、简易、重复性好的操作方法,也为进一步的生理、生化、药理及体外血脑屏障或共培养等方面的研究提供了材料来源。

Alpha-黑素细胞刺激素及其新型类似物对小鼠脑微血管内皮细胞产生组织因子的抑制作用

目的：研究Alpha-黑素细胞刺激素（α-MSH）及其新型类似物（STY39）对原代小鼠脑微血管内皮细胞（ MBMEC）在脂多糖（ LPS）刺激下产生组织因子（ TF）和组织因子途径抑制物（ TFPI）的影响。方法选用雌性BALB/c小鼠,纯化并原代培养MBMEC,培养至57 d,采用免疫荧光法检测Ⅷ因子相关抗原,鉴定MBMEC模型。将MBMEC分为PBS对照组,LPS刺激组,LPS刺激后1、2、3 h加入10-7mol/L的α-MSH或STY39组（LPS＋α-MSH,LPS＋STY39）,共8组,每组4孔。分别在LPS刺激后6 h和8 h收集细胞培养上清液和细胞,应用酶联免疫吸附法检测细胞上清液的TF和TFPI浓度,RT-PCR检测细胞TF mRNA表达水平。结果（1） LPS 可诱导 MBMEC 产生 TF 和TFPI蛋白,细胞培养上清液中TF水平于6 h达到高峰, TFPI水平于8 h达到高峰。（2） LPS刺激 MBMEC后1、2、3 h给予10-7mol/L的α-MSH或 STY39,均可显著降低细胞上清液中 TF蛋白含量（P〈0.01）,尤其在 LPS刺激后1 h给予α-MSH 或 STY39的效果最显著（P 〈0.05）, STY39降低TF含量的作用较α-MSH明显（P〈0.05）；但α-MSH和STY39对LPS诱导MBMEC产生TFPI均没有显著的上调作用。（3）在LPS刺激后不同时间点给予10-7mol/L的α-MSH 或STY39,均可显著下调MBMEC TF mRNA的表达水平（P〈0.01）,其中1 h时间点作用最显著（P〈0.05）,但α-MSH与STY39的作用差异无统计学意义。结论α-MSH和 STY39均能抑制LPS诱导原代 MBMEC 产生 TF 蛋白和表达 TF mRNA,且 LPS 刺激1 h 后给药效果较好；STY39对MBMEC产生TF蛋白的抑制作用优于α-MSH。

肿瘤坏死因子-α通过Wnt通路对脑卒中小鼠缺血再灌注后脑微血管内皮细胞的影响研究

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通过Wnt通路对脑卒中小鼠缺血再灌注后脑微血管内皮细胞的影响。方法:40只C57小鼠建立脑卒中模型,分为A组(缺血0 min)、B组(缺血时间30 min)、C组(缺血时间45 min)、D组(缺血时间60 min)。建模成功后,ELISA检测血清TNF-α表达。Evans blue法检测血脑屏障功能。免疫组化检测Wnt3a表达。qPCR技术检测Axin2、APCDD1表达。结果:A组TNF-α水平较低,B、C、D组TNF-α水平逐渐上升(F=2064.955,P<0.001)。A组左脑Evans blue浓度较低,B、C、D组Evans blue浓度逐渐上升(F=242.961,P<0.001)。各组右脑Evans blue浓度无明显变化(F=0.335,P=0.800)。A组小鼠Wnt3a表达很少,B、C、D组表达依次增多。A、B、C、D组Axin2、Apcdd1 mRNA相对表达依次增多(F=292.512,1237.411,P<0.001)。结论:TNF-α可能通过激活Wnt通路,进一步促进靶基因的表达来降低脑卒中小鼠脑微血管内皮细胞功能。

GA结合蛋白转录因子亚基β1的反义RNA对过氧化氢诱导的大鼠脑微血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨GA结合蛋白转录因子亚基β1的反义RNA(GABPB1-AS1)对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠脑微血管内皮细胞损伤的影响及可能机制。方法体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,分为对照(Con)组、模型(Model)组、A组(Model加用si-NC)、B组(Model加用si-GABPB1-AS1)、C组(Model加用si-GABPB1-AS1及anti-miR-NC)和D组(Model加用si-GABPB1-AS1及anti-miR-101-3p)。RT-qPCR检测细胞中GABPB1-AS1和miR-101-3p表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、活化的半胱天冬酶3(Cleaved-caspase 3)和活化的半胱天冬酶9(Cleaved-caspase 9)蛋白表达,试剂盒检测上清液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平及细胞中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。采用双荧光素酶报告基因实验验证GABPB1-AS1和miR-101-3p靶向调控关系。结果Con组、Model组、A组及B组GABPB1-AS1、miR-101-3p、细胞凋亡率、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9、MDA、SOD、IL-1β和TNF-α水平差异均有统计学意义(F=724.541、450.866、368.481、154.595、107.850、103.824、62.514、371.871、210.219、1726.871、488.217,P<0.05)。与Con组比较,Model组细胞中GABPB1-AS1表达升高,miR-101-3p表达降低,细胞凋亡率、Bax、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9蛋白水平、MDA含量及IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平和SOD活性降低(P<0.05)。与A组和Model组比较,B组GABPB1-AS1表达、细胞凋亡率、Bax、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9蛋白水平、MDA含量及IL-1β和TNF-α水平降低,miR-101-3p表达、Bcl-2蛋白水平和SOD活性升高(P<0.05)。GABPB1-AS1靶向负调控miR-101-3p表达。与C组比较,D组细胞凋亡率、Bax、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9蛋白水平、MDA含量及IL-1β和TNF-α水平升高(t=13.360、9.779、5.644、5.156、13.545、37.810、25.132,P<0.05),Bcl-2蛋白水平和SOD活性降低(t=9.311、12.752,P<0.05)。结论干扰GABPB1-AS1可能通过上调miR-101-3p表达抑制H2O2诱导的大鼠脑微血管内皮细胞凋亡、氧化应激反应及炎症因子表达。

补阳还五汤激活PI3K-AKT通路促进氧糖剥夺再灌注损伤的脑微血管内皮细胞血管生成

目的:探讨补阳还五汤促进氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤的大鼠脑微血管内皮细胞(RBMEC)血管生成的机制。方法:RBMEC经补阳还五汤含药血清孵育24 h后,构建OGD/R细胞损伤模型。将细胞随机分为正常对照组、模型对照组、补阳还五汤组(给予补阳还五汤含药血清)和LY294002组[给予补阳还五汤含药血清前使用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002预处理1 h]。采用CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell迁移实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移和形成管腔能力。蛋白质印迹法检测PI3K、蛋白激酶B(AKT)、低氧诱导因子(HIF)-1α及血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白的表达。结果:与模型对照组比较,补阳还五汤组RBMEC存活率、迁移能力及管腔形成能力显著增强(均P<0.01),磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达增加(均P<0.05),而LY294002可阻断上述效应。结论:补阳还五汤含药血清可促进OGD/R损伤的RBMEC血管生成,其机制可能与其激活PI3K-AKT信号通路上调HIF-1α和VEGF表达有关。

内皮素-1对小鼠脑微血管内皮细胞环氧化酶-2、前列腺素E2表达的影响

目的：探讨内皮素-1（ET-1）对小鼠脑微血管内皮细胞中环氧化酶-2（COX-2）及前列腺素E2（PGE2）表达的影响。方法：培养小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3株,分别加入不同浓度（1、10、100和1 000 nmol/L）的ET-1处理2、4、6、16和24 h,用Western blot技术检测不同浓度ET-1处理不同时间后细胞内COX-2表达的变化;另取生长良好的细胞与10 nmol/L的ET-1在37℃下分别培养2、4、6、16和24 h,以不加ET-1培养的细胞为对照,检测各组细胞上清液中PGE2水平的变化。结果：bEnd.3细胞经不同浓度ET-1处理不同时间后,COX-2蛋白表达在2-4h时显著增加,6 h时达到高峰,具有浓度及时间依赖性（F浓度=127.079,F时间=40.158,F交互=5.783,P均〈0.001）。10 nmol/L的ET-1处理不同时间后各组bEnd.3细胞上清液中PGE2释放水平于4 h开始升高,6 h达峰,24 h下降,差异有统计学意义（F=195.630,P〈0.001）。结论：ET-1可上调bEnd.3细胞中炎症因子COX-2的表达及PGE2的释放,最终对bEnd.3细胞株造成损伤。

一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法

背景:脑微血管内皮细胞是神经科学研究领域的重要工具细胞,如何获得高纯度的脑微血管内皮细胞一直是体外研究的关键和难点。目的:探索一种简便易操作,高纯度的原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法:使用6-8周龄C57BL/6小鼠,经酶消化及梯度离心法获得微血管段,使用药物进一步纯化内皮细胞,利用CD31和GFAP免疫荧光染色鉴定内皮细胞纯度。使用Claudin-5免疫荧光染色鉴定紧密连接蛋白的表达情况。结果与结论:1细胞呈旋涡状或铺路石样排列、生长;2免疫荧光显示内皮细胞纯度达99%以上,并广泛表达紧密连接蛋白;3结果表明,实验建立了一种简便、易操作的,可以获得大量高纯度的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法。

高表达miR-132-3p间充质干细胞外泌体对缺氧/复氧受损脑微血管内皮细胞功能的改善作用

目的研究高表达miR-132-3p间充质干细胞(MSCs)释放的外泌体(EXs)对缺氧/复氧(H/R)受损内皮细胞功能的作用。方法原代培养从C57BL/6小鼠骨髓中提取的MSCs,采用装载miR-132-3p载体的慢病毒感染MSCs获得MSC^(miR-132-3p),同时采用装载有scramble序列的对照慢病毒感染MSCs获得MSC^(NC)。分离提取MSC^(NC)及MSC^(miR-132-3p)释放的EXs,分别获得MSC-EXs及MSC-EXs^(miR-132-3p)。将所得EXs与H/R受损小鼠脑微血管内皮细胞(bend3)共培养,根据培养条件将细胞分为正常培养组(细胞正常培养)、H/R组(制作H/R模型)、MSC-EXs处理组(MSC-EXs共培养)、MSC-EXs^(miR-132-3p)处理组(MSC-EXs^(miR-132-3p)共培养)、MSC-EXs^(miR-132-3p)+LY294002组[细胞与MSC-EXs^(miR-132-3p)共培养前加入磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)信号通路阻断剂LY294002(20μmol/L)处理]。实时荧光定量聚合酶链反应检测MSCs、MSC-EXs及bend3细胞中miR-132-3p的表达。血管形成试剂盒检测bend3细胞血管形成能力,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测bend3细胞增殖能力,划痕实验检测bend3细胞迁移能力,hochest33258染色显示细胞的凋亡,Western blot检测蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平。结果与H/R组相比,MSC-EXs处理组显著改善H/R诱导下bend3细胞受损的血管形成、增殖、迁移能力及Akt磷酸化水平[H/R组分别为(3±1)条、0. 275±0. 020、(147±8)μm和0. 89±0. 12; MSC-EXs处理组分别为(8±3)条、0. 358±0. 030、(218±10)μm和1. 37±0. 25,均P <0. 01],细胞凋亡明显减少[(47±2)%比(63±2)%,均P <0. 01]。与MSC-EXs处理组比较,MSC-EXs^(miR-132-3p)处理组bend3细胞的血管形成、增殖、迁移能力及Akt磷酸化水平增加[分别为(14±3)条、0. 444±0. 050、(357±10)μm和1. 67±0. 23,均P <0. 01],细胞凋亡明显减少[(34±1)%,P <0. 01]。与MSC-EXs^(miR-132-3p)处理组比较,MSC-EXs^(miR-132-3p)+LY294002组细胞的增殖、迁移、血管形成能力及Akt磷酸化水平明显减少[分别为(5±2)条、0. 304±0. 050、(175±8)μm和0. 95±0. 11,均P <0. 01]。结论高表达miR-132-3p的MSC-EXs能够通过激活PI3K/Akt信号通路改善H/R诱导受损脑血管内皮细胞多种生理功能。

缺氧对鼠脑微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物的影响

目的 探讨缺氧对体外培养鼠脑微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物 (tissue typeplas minogenactivator ,TPA)的影响。方法 分别对新生小鼠脑微血管内皮细胞进行原代和传代缺氧条件下培养 ,常规培养作为空白对照 ,每组各取 8例 ,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA活性。结果 原代培养内皮细胞空白对照组、缺氧组分泌TPA活性分别为 (19.4± 1.7)× 10 -2 IU/ml,(2 2 .5± 1.5 )× 10 -2 IU/ml,两者有显著性差异 (P <0 .0 1) ;传代培养内皮细胞缺氧组与空白对照组分泌TPA活性差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论 体外培养鼠脑微血管内皮细胞能合成分泌TPA ;缺氧状态下原代培养内皮细胞产生的TPA活性增高。内皮细胞分泌的TPA可能是脑缺氧缺血致不可逆神经元损伤的一个重要媒介。

Z-没药甾酮通过激活PI3K/AKT/eNOS通路发挥脑微血管内皮细胞保护作用

目的:探讨Z-没药甾酮(Z-GS)对大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用及药理机制。方法:脑微血管内皮细胞制作氧糖剥夺模型体外模拟缺血性脑卒中,培养的脑微血管内皮细胞分为对照组、模型组、 Z-GS低、中、高(12.5,25,50μmol·L^(-1))剂量组。给药组细胞在OGD造模前分别给予不同剂量的Z-GS处理。在机制研究中,50μmol·L^(-1) Z-GS+抑制剂组在造模给药前加入PI3K抑制剂LY294002。试剂盒检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放和血管活性物质水平;免疫印迹分析磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及磷酸化水平;LY294002用于特异性抑制PI3K表达。结果:Z-GS给药可提高细胞活力、降低LDH释放。同时Z-GS可通过降低内皮素-1和血栓素B2水平、升高血栓调节蛋白和6-酮-前列环素1α水平缓解血瘀。机制研究表明,Z-GS给药可激活PI3K/AKT/eNOS通路,增加一氧化氮(NO)的生成。而在LY294002特异性抑制PI3K后,Z-GS对该通路的调控作用消失。结论:Z-GS可通过调控血管活性物质发挥血管内皮保护作用,其机制与激活PI3K/AKT/eNOS通路,进而促进NO的生成有关。