小鼠脑脊髓炎病毒自然感染调查以及人工感染小鼠试验

目的了解小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)自然感染情况,探究人工感染TMEV小鼠体内各脏器组织中病毒分布及血清抗体变化。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法对2010年~2015年广东地区采集的SPF级小鼠、开放环境饲养的小鼠以及野生褐家鼠临床样本进行TMEV检测。36只ICR小鼠经脑内接种TMEV BeAn病毒,每天观察动物的临床症状,在接种第0、3、7、10、17、21、31、39、46天每个时间点分别对3只动物安乐死,剖检并取血清和组织脏器样本进行TMEV检测。结果 SPF级小鼠TMEV抗体阳性率为5.29%(n=2834),核酸阳性率为27.27%(n=457);开放环境饲养的小鼠的抗体和核酸阳性率分别为71.95%(n=82)和53.66%(n=82);野生褐家鼠中核酸阳性率为25.93%(n=27)。TMEV阳性小鼠中仅有两只小鼠表现有明显的临床症状。盲肠内容物、粪便和脑是qRT-PCR检测的最佳选择样本。ICR小鼠脑内接种TMEV BeAn病毒后第3 d可在脑、心脏、肝脏、肺脏和胃中检测到病毒核酸,脾脏、肾脏和盲肠中未检测到病毒核酸。肝脏、心脏、肺脏和胃中的病毒在接种后第10天已完全清除,脑中的病毒一直持续存在到第46天试验结束。小鼠感染后第7天可以检测到抗体,随后抗体水平逐渐升高,接种后17 d抗体阳性率达100%,并一直到46 d都可以维持较高的抗体水平。人工感染小鼠呈隐性感染,临床上并未表现明显症状和眼观病理变化。结论广东地区实验小鼠和野生褐家鼠均存在TMEV感染,且感染率较高。小鼠接种TMEV BeAn毒株后呈隐性感染,感染小鼠第7天可以产生抗体且持续存在。病毒在感染小鼠肝脏、心脏、肺脏和胃中短时间存在,而在脑中长期存在。qRT-PCR与ELISA两种检测方法具有较好的一致性,qRT-PCR检测方法可作为实验动物国家标准的有力补充。

小鼠脑脊髓炎病毒标准血清制备及间接ELISA检测方法的应用

目的制备小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）标准血清，建立ELISA检测方法，实现一种病毒多种检测方法的比对研究。方法用TMEV感染3周龄SPF级BALB／c小鼠，制备免疫用抗原。分别在0、7、14d以腹腔注射的方式免疫SPF级6-8周龄BALB／c小鼠，免疫血清用IFA、IEA法进行鉴定；TMEV感染BHK-21细胞，制备EHSA抗原，确定酶结合物、抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度，建立TMEVEHSA检测方法，进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。结果制备TMEV免疫血清，以IFA、IEA测定血清效价分别为1：640和1：320，与痘苗病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒和呼肠孤病毒-Ⅲ型均无交叉反应；建立了ELISA检测方法，确立了各种试剂的最佳工作浓度，其中酶结合物最佳工作浓度为1：10000，抗原为2.5μg／mL，阳性参考血清为1：200；EHSA检测灵敏度为1：3200。板内特异抗原、正常抗原平均变异系数为4.67％和5.7％，板间为4.39％和7.61％。稳定性实验相对偏差均小于20％。结论本研究制备的TMEV免疫血清可作为血清学检测方法中的标准质控血清；建立的ELISA方法重复性、稳定性好，敏感性和特异性强，可用于小鼠脑脊髓炎病毒血清抗体检测。

小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白片段实时荧光定量PCR标准品的构建

目的构建小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）非编码蛋白（UTR）片段标准品，用于实时荧光定量PCR检测小鼠脑脊髓炎病毒。方法RT-PCR扩增TMEVuTR片段上80-1094nt之间长度为1014bp的片段，将目的片段连接至pMD18-T载体，转化至DH5α感受态细胞。分别经PCR鉴定和序列测定验证重组质粒。分光光度计测量重组质粒的吸光值，换算成拷贝数浓度后作10倍梯度稀释制得质粒标准品。然后进行实时荧光定量PCR分析，绘制标准曲线。结果TMEVUTR片段成功克隆至pMD18-T载体中，测序结果表明重组质粒中插入的UTR序列正确，实时荧光定量PCR分析10倍梯度系列稀释的质粒标准品所得到的标准曲线良好，统计学分析显示α值与标准品浓度的对数存在良好线性关系，回归系数在0．99以上。结论成功构建了TMEVUTR片段实时荧光定量PCR标准品，为今后TMEV实时荧光定量PCR检测打下了基础。

抗小鼠白血病病毒单克隆抗体的研制及其初步应用

用密度梯度离心提纯的小鼠白血病病毒（ＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ，ＭｕＬｖ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，采用杂交瘤技术获得６株分泌抗ＭｕＬｖ单克隆抗体的杂交瘤细胞。经检测，它们所分泌的抗体类型分别为ＩｇＭ（Ｆ１０，Ｄ６，Ｃ１２，Ａ８）和ＩｇＧ１（Ａ９．Ｂ６）。腹水效价为１０－３～１０－５。相对亲和力分别为１．２５ｕｇ／ｍｌ（Ｆ１０），１．３０μｇ／ｍｌ（Ｄ６），１．２０μｇ／ｍｌ（Ｃ１２），１．０μｇ／ｍｌ（Ａ８），０．０７μｇ／ｍｌ（Ａ９），０．００１μｇ／ｍｌ（Ｂ６）．Ｆ１０，Ｄ６，Ｃ１２，和Ａ８能识别相同或相近的抗原表位，Ａ９和Ｂ６识别不同的抗原位点。特异性测定结果表明：６株ＭｃＡｂ与１１种鼠源性病毒抗原脑膜炎病毒（ＬＣＭ）；流行性出血热病毒（ＥＨＦ）；鼠痘病毒（Ｅｃｔ．）；鼠肝炎病毒（ＭＨＶ）；仙台病毒（Ｓｅｎｄａｉ），呼肠孤病毒（Ｒｅｏ３）；鼠肺炎病毒（ＰＶＭ）；细小病毒（ＭＶＭ）；鼠腺病毒（ＭＡｄ）；多瘤病毒（Ｐｏｌｙｏｍａ），脑脊髓炎病毒（ＧＤＶＩＩ）均无反应。将ＭｕＬｖ ＭｃＡｂ标记荧光素应用于实际检测，取得较好的实验结果。

S1PR1基因慢病毒转染对EAE小鼠调节性T细胞及IL-17、IFN-γ水平的影响

目的:观察经外周转染S1PR1基因慢病毒(LV-S1PR1)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠调节性T细胞比例及IL-17、IFN-γ水平的影响。方法:将30只健康雌性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、EAE模型组、LV-S1PR1转染组,后两组建立EAE模型,LV-S1PR1转染组经尾静脉注射LV-S1PR1。每日进行神经功能缺损评分;免疫印迹法(Western blot)检测外周血S1PR1表达水平;ELISA法检测外周血1-磷酸鞘氨醇(S1P)水平以及脊髓组织IL-17、IFN-γ水平;流式细胞术检测脾脏中调节性T细胞的比例。结果:与EAE模型组相比较,LV-S1PR1转染组神经功能缺损症状改善;外周血S1PR1表达增加( P <0.05);外周血S1P水平、脾脏中调节性T细胞比例及脊髓组织中IL-17和IFN-γ水平降低( P <0.05)。结论:经外周转染LV-S1PR1可以改善EAE小鼠的发病,其防治作用机制可能与上调外周S1PR1的表达,降低外周S1P水平,使T细胞迁移受阻有关。

猪血凝性脑脊髓炎病毒感染对小鼠脑内星形胶质细胞的影响

为阐明猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)感染后小鼠脑内星形胶质细胞的活化情况,本研究通过滴鼻途径将PHEV接种BALB/c小鼠,分别运用qRT-PCR、Western blot和间接免疫荧光方法检测感染后不同时间点小鼠脑组织内星形胶质细胞特异性标志物GFAP的表达情况。结果表明,与正常对照组小鼠相比,接种PHEV后3 d即可检测到GFAP表达水平显著升高,并且GFAP的表达量随着感染时间延长逐渐增加。间接免疫荧光结果发现星形胶质细胞数量增加,分布集中,同时细胞体积增大,突起变多,证明星形胶质细胞在PHEV感染的小鼠脑内发生了活化。上述结果可为后期深入开展PHEV所致神经炎性损伤的机制研究奠定基础。

利用微生物气溶胶发生器评估较低压差状态下独立通风笼盒（IVC）内微生物污染情况

目的 利用微生物气溶胶发生器制造微生物感染环境,评估在低压差条件下独立通风笼盒（IVC）内微生物的污染情况.方法 IVC压差分别设定为3 Pa和10 Pa,放置于负压屏障环境内.分别在笼架外四角、中间的笼盒盖上以及对应的笼盒内放置培养皿,细菌培养皿为血平皿,病毒培养皿为内置直径2 cm吸附滤纸的玻璃平皿.将微生物气溶胶发生器放置于距离笼架 2 m处,间隔48 h分别雾化5 ml的1.9×108个/ml的金黄色葡萄球菌和2.4×10-4 TCID50的小鼠脑脊髓炎病毒,雾化停止后30 min、60 min,用培养法及荧光定量PCR法检测预先放置的平皿内病原.结果 大、小鼠IVC在设定为10 Pa及3 Pa时,实际测定压差分别为2.2 Pa和7.8 Pa,经培养法及荧光定量PCR法检测,金黄色葡萄球菌培养数量在30 min检测最低值为222个/平皿,60 min检测均大于500个/平皿,而放置于笼盒内的平皿未见生长;小鼠脑脊髓炎病毒拷贝数在30 min检测最低为1.23×102,60 min最低为1.61 × 104,而放置于笼盒内的平皿未能检出.结论 IVC笼盒在最小压差为2.2 Pa时也能够防止外来病原的进入.

多发性硬化症免疫缺陷鼠的中枢神经炎症反应观察

脑脊髓脱髓鞘是多发性硬化症(MS)的主要病理特征。为了建立病毒性脑脊髓脱髓鞘免疫缺陷小鼠模型,探索其神经炎症发生发展的潜在机制。NOD-SCID小鼠12只随机分为感染组和对照组,每组6只,分别脑部注射小鼠脑脊髓炎病毒和PBS。每天观察临床病症,第25天处死小鼠。采用HE染色观察脑部病理变化,并采用免疫荧光染色、Western blot和实时定量PCR检测标记物的表达。结果表明小鼠脑脊髓炎病毒在患鼠脑中明显复制并引起了神经损伤,以后肢麻痹为主要表型的神经障碍发生率为100%(6/6),小鼠脑部主要病理变化为神经元损伤、坏死,较多小胶质细胞浸润,海马锥体细胞明显减少。荧光定量PCR发现肿瘤坏死因子α(TNF-α),白细胞介素1α和β(IL-α,IL-1β),信号转导和转录激活因子3(STAT3)mRNA水平均呈现显著上升(P=0.0101,P=0.0121和P=0.0056)。Western blot发现小鼠海马区STAT3表达显著升高(P<0.0395)。免疫荧光染色发现小胶质细胞和星形胶质细胞在海马区显著活化。TMEV成功诱发了免疫缺陷鼠脑脊髓炎脱髓鞘病,TMEV感染提高了免疫缺陷鼠脑部促炎因子如TNF-α、IL-1α和IL-1β的表达及海马体小胶质细胞和星形胶质细胞增殖活化,激发了脑部炎症,从而引起了免疫缺陷小鼠中神经系统疾病。此外,研究发现在病毒性脑脊髓脱髓鞘免疫缺陷小鼠模型中,海马体的STAT3信号通路与脑部炎症密切相关,以上为多发性硬化症及病毒诱发脱髓鞘机制研究提供有力数据支撑。