汉黄芩素对青光眼小鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制研究

目的观察汉黄芩素对青光眼小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用,并探究其相关作用机制。方法10只(10眼)C57BL/6J小鼠作为对照组;40只(40眼)DBA/2J小鼠用于制备青光眼模型,并分为模型组和实验1、2、3组,每组各10只。对照组、模型组小鼠灌胃生理盐水,实验1、2、3组小鼠分别灌胃50、100、150 mg·kg^(-1)汉黄芩素。以小鼠右眼为入选眼,比较各组小鼠灌胃前和灌胃2周、4周、8周眼压;苏木素-伊红染色并比较各组小鼠RGC数量、视网膜厚度;比色法检测各组小鼠视网膜组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)水平;酶联免疫吸附法检测各组小鼠视网膜组织白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot检测各组小鼠视网膜组织核苷酸寡聚化结构域样受体家族3(NLRP3)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白表达水平。结果灌胃前,与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。灌胃2周、4周、8周:与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均降低,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与实验1组相比,实验2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论汉黄芩素可改善青光眼小鼠视网膜厚度,缓解视网膜组织氧化损伤和炎症反应,其作用机制可能与抑制NLRP3炎性小体激活有关。

小鼠视网膜神经节细胞在视神经损伤后的基因表达谱分析

目的:揭示小鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的分子机制和潜在的治疗靶点。方法:构建视神经损伤(ONC)小鼠模型,对视网膜组织进行HE染色观察组织病理学改变,并使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RGCs标志物—具有多重剪接的RNA结合蛋白(Rbpms)的mRNA表达水平;透射电镜(TEM)观察RGCs线粒体损伤情况;采用转录组测序分析ONC 7 d组小鼠的视网膜差异表达基因,并对差异表达基因进行Gene Ontology(GO)功能、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集和韦恩分析,RT-qPCR检测差异基因mRNA表达水平。结果:与正常组相比,ONC 7 d组RGCs数量显著减少,细胞排列疏松不规则,RGCs标志物Rbpms的mRNA表达水平显著降低(P<0.001),ONC小鼠模型构建成功。透射电镜结果表明,ONC 7 d组RGCs的线粒体出现肿胀,嵴消失;转录组测序结果表明,ONC 7 d组与正常组比,存在562个差异表达基因,其中152个基因表达下调和410个基因表达上调。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析表明ONC后差异表达基因主要富集于神经元损伤修复的多个重要信号通路;RT-qPCR结果显示,与正常组相比,与神经元损伤修复相关的基因Ecel1、Atf3、Sprr1a的表达均在损伤后第4天显著上调(均P<0.05),与测序结果一致。结论:ONC小鼠RGCs凋亡与线粒体损伤有关,而神经元损伤修复相关基因Atf3、Ecel1、Sprr1a在视神经损伤的早期参与了小鼠视神经损伤后RGCs的保护。

CYP1B1基因敲除小鼠视网膜神经节细胞和视乳头结构的观察

目的探讨CYP1B1基因敲除小鼠是否存在视网膜神经节细胞(RGCs)和视乳头结构的改变,以及这些改变与前房角发育之间是否存在关系。方法采用18只成年CYP1B1基因敲除小鼠作为实验对象,随机分成3组,每组6只,分别对视网膜、视乳头及前房角进行光学显微镜和透射电子显微镜观察,并用末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿苷缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡的视网膜神经细胞。以同龄C57BL/6J小鼠作对照研究。结果正常对照小鼠未发现视网膜、视乳头及前房角的异常改变。CYP1B1基因敲除小鼠中,光镜组观察发现2只眼视乳头形态结构的改变;电镜组观察发现2只眼RGCs呈现进行性的细胞浆和细胞核的浓缩;TUNEL染色组显示3只眼RGCs层和内核层出现TUNEL阳性细胞。上述7只眼均存在较严重的房角发育畸形。结论CYP1B1基因敲除小鼠部分存在RGCs的变性和视乳头结构的改变,这些改变与前房角发育畸形存在一定的相关性。

膳食诱导的肥胖型C57BL/6小鼠视网膜神经节细胞凋亡的机制

目的:探讨高脂饮食诱导的C57BL/6肥胖小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的机制。方法:高脂饲料喂养19wk后,小鼠分为肥胖抵抗(DIOR)组和肥胖倾向(DIO)组,同时对照组(CON)小鼠给予基础饲料。TUNEL法检测各组小鼠RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。结果:TUNEL法凋亡检测结果显示,DIO组小鼠视网膜神经节细胞层可见较多黄色着染的凋亡细胞,其凋亡指数为(6.7±1.2)%,显著高于对照组和DIO-R组(P<0.01,P<0.05);对照组和DIO-R组间比较无显著差异(P>0.05)。激光共聚焦结果显示,与对照组和DIO-R组比较,DIO组小鼠视网膜神经节细胞内Ca2+荧光染色明显增强,其荧光染色强度比值显著升高(均P<0.01);对照组和DIO-R组视网膜神经节细胞内Ca2+荧光染色强度无明显差异(P>0.05)。结论:细胞内钙离子超载可能介导了肥胖型C57BL/6小鼠视网膜神经节细胞的凋亡过程。

神经球蛋白对慢性高眼压小鼠视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景神经球蛋白（Ngb）是2000年发现的球蛋白，可以在缺氧或氧化应激的环境中保护细胞。Ngb在视网膜神经元中呈高表达，提示视网膜很可能是Ngb发挥其功能的重要场所。目的研究Ngb对小鼠高眼压所致视网膜神经节细胞（RGCs）损伤的保护作用及作用机制。方法本研究分为体外实验和体内实验两部分。将体外纯化培养的成年野生型（WT）小鼠和本实验室培育的Ngb转基因（Ngb-Tg）新生小鼠RGCs用不同浓度的谷氨酸作用3d后，以dead／live双染试剂盒染色计算RGCs的存活率，比较Ngb对不同浓度谷氨酸环境下培养的RGCs存活率的影响。将聚苯乙烯荧光微球注入WT和Ngb-Tg小鼠前房内以制备小鼠慢性高眼压模型，将小鼠分为WT小鼠对照组（n=18）、Ngb-Tg小鼠对照组（n=18）、WT小鼠微球单次注射组（n=38）、Ngb-Tg小鼠微球单次注射组（n=38）、WT小鼠微球2次注射组（n=6）及Ngb-Tg小鼠微球2次注射组（n=6）。另设WT小鼠PBS注射组（n=6）、Ngb-Tg小鼠PBS注射组（n=6）观察PBS前房注射对眼压的影响。分别于前房注射微球后即刻（对照组），3d及1、4、8周处死小鼠，用实时荧光定量PCR、Westernblot和免疫组织化学法定量分析NgbmRNA及其蛋白在视网膜中的表达变化和RGCs的存活率，并对比两种小鼠视网膜中过氧化物和ATP表达水平。结果5．0、7．5、10．0mmol／L谷氨酸处理后Ngb小鼠RGCs存活率均明显高于WT小鼠，差异均有统计学意义（t=2．810、3．020、3．110，P〈0．01）。WT小鼠微球单次注射组及Ngb-Tg小鼠微球单次注射组小鼠眼压均明显高于WT小鼠对照组及WT小鼠PBS注射组，高眼压状态持续至4周，2次微球注射后眼压复升，高眼压可维持至8周。WT小鼠微球单次注射组第3天视网膜中Ngb含量明显上调，而Ngb-Tg小鼠视网膜中Ngb呈持续高表达。与Ngb-Tg小鼠相比，WT小鼠RGCs凋亡率在前房注射微球后第1、4、8周均逐渐升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）。1周时，Ngb-Tg小鼠微球单次注射组视网膜中DHE含量明显低于WT小鼠微球单次注射组（t=3．212，P=0．008），而ATP的含量则明显高于WT小鼠微球单次注射组（t=2．864，P〈0．01）。结论Ngb可能是青光眼损伤的内源性神经保护因子，对高眼压所致RGCs损伤有保护作用，其机制可能是通过降低氧化应激和改善线粒体功能实现的。

P2X_7受体对缺氧诱发小鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的:探讨嘌呤受体P2X_7对缺氧诱发小鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响。方法:以小鼠视网膜神经节细胞株RGC-5为研究对象,按照不同处理因素将细胞随机分为4组:正常对照组(G1)、缺氧组(G2)、缺氧+激动剂(BzATP)组(G3)、缺氧+拮抗剂(BBG)组(G4);采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的存活率;用Annxin V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot检测细胞内cleave-caspase-3和cleave-PARP蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,RGC-5细胞经缺氧处理后,细胞存活率明显降低;凋亡率显著升高;细胞内cleavecaspase-3和cleave-PARP蛋白表达增加;P2X_7受体激动剂BzATP能明显加重缺氧诱发的细胞凋亡,而BBG预处理可以显著拮抗缺氧所致的细胞凋亡。结论:缺氧能激活视网膜神经节细胞嘌呤受体P2X_7,并参与视网膜神经节细胞的凋亡。

大麻素对人和小鼠视网膜神经节细胞GABA电流的调控差异

目的比较人和小鼠视网膜内源性大麻素类受体1(cannabinoid receptor,CB1)的表达差异,观察大麻素受体激动剂WIN55212-2对不同种属视网膜神经节细胞GABA电流的调控作用。方法采用冰冻切片免疫荧光染色,观察CB1受体在视网膜中的表达。制备视网膜薄片,行全细胞膜片钳记录。在神经节细胞上给予100μmol/L GABA快速加药诱导出电流IGABA,而后观察孵育大麻素受体激动剂WIN55212-2时GABA诱导的IGABA及同时孵育WIN 55212-2和大麻素受体拮抗剂SR141716A的电流IGABA。结果人和小鼠视网膜CB1受体的分布有所不同,人的内核层、外核层、神经节细胞层有显著的CB1表达,但小鼠CB1受体主要表达在内网状层、外网状层上;膜片钳结果显示不管是在人还是在小鼠的视网膜上,孵育WIN55212-2后的GABA诱导电流幅度均有显著减小。不同的是,在人视网膜神经节细胞上,WIN55212-2明显减慢了GABA电流的反应速度,表现在电流达峰时间明显延长,恢复时间缩短(P<0.05)。WIN55212-2对小鼠视网膜神经节细胞GABA的反应速度无明显差别(P>0.05)。结论CB1受体在人和小鼠视网膜中有差异性分布,对神经节细胞的GABA电流影响也不同。孵育WIN55212-2可抑制人和小鼠神经节细胞GABA电流幅度,但仅对人的神经节细胞的GABA电流的动力学速度有影响。

腺相关病毒介导的脑源性神经营养因子对DBA／2J小鼠视网膜神经节细胞的保护作用

背景神经营养因子的缺乏与青光眼的视神经损害密切相关。外源性神经营养因子的补充具有短暂的保护作用。腺相关病毒（AAV）介导的神经营养因子可在眼内长期表达，但是否对青光眼动物的视神经具有持久的保护作用有待研究。目的评估AAV介导的脑源性神经营养因子（BDNF）基因在DBA／2J小鼠眼内的表达及其对视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法健康清洁级DBA／2J小鼠10只从4月龄起，每月使用Tonolab眼压计测量眼压。6月龄时左眼玻璃体腔内注射AAV介导的BDNF和绿色荧光蛋白（GFP）基因（AAV—BDNF—GFP）1μ1，右眼注射等量的生理盐水作为对照。注射后3个月心脏灌流后取出视网膜，荧光显微镜下观察GFP在视网膜中的表达，免疫组织化学法计算存活的RGCs数目并进行比较。结果DBA／2J小鼠4月龄时AAV—BDNF—GFP眼眼压平均为11．90mmHg，对照眼眼压为11．40mmHg。实验眼与对照眼眼压5月龄时均开始升高，8月龄时达到高峰。从4月龄到9月龄，实验组和对照组眼压比较差异无统计学意义（t=-1．78～0．61，P=0．11—0．90）。玻璃体腔注射AAV—BDNF—GFP3月龄后视网膜可以观察到GFP阳性细胞，转染率为46．33％±8．08％。AAV—BDNF—GFP组实验眼的平均RGCs的密度为（3168．13±1319．33）mm^2，对照眼为（2024．81±796．38）mm^2，差异有统计学意义（t=2．75，P=0．02）。结论AAV介导的BDNF对DBA／2J小鼠RGCs有保护作用。

不同波长光刺激下小鼠视网膜神经节细胞的光反应规律

目的探索离体视网膜神经节细胞(RGC)在不同色光刺激下电活动反应的作用规律。方法选取3周龄SPF级C57BL/6小鼠30只,制作离体全视网膜铺片。通过膜片钳系统on cell模式记录RGC在蓝光(400nm)、绿光(580nm)和白光3种色光刺激下RGC的电活动参数;将所有RGC根据不同色光反应分为400nm色光敏感RGC、580nm色光敏感RGC和色光不敏感RGC,进一步根据光反应类型、响应模式将RGC分为ON型、ON/OFF型和OFF型。组间比较不同色觉类型RGC的基线放电模式(放电基线频率及簇发放电频率)和光反应放电模式(响应模式分布、光反应放电频率及放电频率增幅)。结果共记录82个RGC的色光反应信息。RGC的自发放电活动频率范围为0.00~32.33Hz。400nm色光敏感RGC为52个,占63.41%;580nm色光敏感RGC共29个,占35.37%;色光不敏感RGC 1个,占1.22%。400nm敏感组的OFF型RGC比例为32.69%,高于580nm敏感组的0.00%;580nm敏感组的ON/OFF型瞬时响应RGC比例为34.48%,高于400nm敏感组ON/OFF型瞬时响应RGC的7.69%;400nm敏感RGC与580nm敏感RGC组间光刺激响应模式分布比较,差异有统计学意义(χ^2=18.069,P=0.000)。580nm敏感RGC放电频率增幅为(22.93±10.23)Hz,显著高于400nm敏感RGC的(14.44±10.11)Hz,580nm敏感ON型RGC放电频率增幅为(24.17±8.98)Hz,显著高于400nm敏感ON型RGC的(11.12±10.35)Hz,差异均有统计学意义(t=4.060,P=0.044;t=5.373,P=0.021),其余放电信息的组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论从RGC色觉敏感角度对RGC分类所得动作电位反应规律无明确特异性,需进一步实验以验证能否通过电刺激参数模拟某类色觉RGC激活后的放电模式,从而产生色觉。

洛美利嗪对膳食诱导的C57BL/6J肥胖小鼠视网膜神经节细胞凋亡的保护作用

目的:探讨洛美利嗪(LOM)对高脂饮食诱导的C57BL/6J肥胖小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的保护作用。方法:小鼠54只随机分为两组,高脂饲料喂养19wk,其中一组同时每天按80mg/kg给予LOM灌胃。筛选出肥胖组(DIO)和肥胖+洛美利嗪组(DIO+LOM),对照组(CON)小鼠给予基础饲料。至第19wk末,应用透射电镜观察各组小鼠RGCs的超微结构改变,采用TUNEL法检测各组小鼠RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。结果:透射电镜结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠RGCs体积变小,细胞质分布紊乱,核染色质发生固缩,而DIO+LOM组小鼠RGCs的形态学改变较DIO组明显减轻。TUNEL法检测结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠GCL层可见较多的凋亡细胞,其细胞凋亡率显著升高(P<0.01),DIO+LOM组RGCs的凋亡率与DIO组比较显著降低(P<0.05)。激光共聚焦结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠RGCs内Ca2+荧光染色明显增强,其荧光染色强度比值显著升高(P<0.01),而DIO+LOM组RGCs内Ca2+荧光染色强度较DIO组有明显下降(P<0.01)。结论:洛美利嗪对肥胖引起的RGCs的损伤和凋亡具有保护作用,其机制可能与减轻细胞内Ca2+超载有关。

白细胞介素-4和白细胞介素-12对纯化培养小鼠视网膜神经节细胞存活的影响

目的观察白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)对于纯化培养条件下视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)生存率的影响,进一步探讨自身免疫调节紊乱与视网膜神经节细胞损害之间的关系。方法应用抗小鼠Thy1.2抗体粘附两步纯化法,得到纯化的小鼠视网膜神经节细胞。Thy1.2单克隆抗体联合神经微管蛋白-2多克隆抗体对RGCs进行免疫细胞化学双标记法鉴定RGCs纯度。TUNEL染色法检测凋亡细胞、通过细胞形态学观察计数细胞。实验分为两个阶段,首先观察IL-4和IL-12对RGCs的直接影响;然后观察在NMDA兴奋性毒性作用下IL-4和IL-12对于RGCs的影响。结果正常培养条件下,除10 U/mLIL-4外,IL-4和IL-12其余浓度组的RGC存活率均较对照组降低(P<0.0083);当有NMDA存在时,1、10、100 U/mL的IL-4和IL-12浓度组的RGCs存活率分别为79.2%、87.2%、69.5%及77.5%、76.4%和73.7%,均较单纯NMDA处理组的RGCs存活率62.25%明显提高(P<0.0083)。结论纯化的RGCs培养条件下,IL-4和IL-12不具有直接的神经保护作用,但具有增强细胞对抗NMDA兴奋性毒性损伤的作用,提示自身免疫调节紊乱可能损伤RGCs,与青光眼等发病有关。

离体电转染pCAGGS-EGFP对小鼠视网膜神经节细胞的标记

目的：通过离体电转染将GFP对胚胎期小鼠视网膜神经节细胞（RGC）进行标记来观察其形态．方法：剥离胚胎小鼠E14的视网膜连同晶状体，放入定制的电转杯中进行电转染，以8～16V电压将pCAGGS—EGFP质粒导入RGC，体外培养视网膜1～5d，观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况。结果：以12V，50ms，950InS的间隔，5个脉冲转染效率最高，为81．25％：20～144h期间GFP依次由胞体向轴突、树突扩散分布。结论：在体外培养基中培养1～5d．pCAGGS—EGFP经过最适电压转染后能够在小鼠视网膜神经节细胞中持续扩散表达.

低氧对小鼠视网膜神经节细胞-5中根蛋白表达的影响

目的观察低氧对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)-5中根蛋白(radixin,RDX)表达的影响,探讨低氧损伤中RGC的损伤机制和可能的保护途径。方法常规培养RGC-5,用RGC特异表面标记性抗原Thy-1鉴定;CoCl2法建立低氧模型,以含终浓度为100μmol·L-1CoCl2培养基培养RGC-5 3 h、6 h、12 h、24 h、48 h,采用Real-time RT-PCR和Western blot检测RDX mRNA及其蛋白在RGC-5中的表达情况,采用免疫荧光观察RDX在RGC-5细胞中的表达及定位。结果体外培养的RGC-5呈梭形或多边形,特异性表面标记性抗原Thy-1反应阳性。Real-time RT-PCR结果显示,低氧组RDX mRNA表达呈进行性增强,于低氧6 h达到高峰后开始下降;正常对照组RDX mRNA的相对表达量为1.00±0.11,低氧3 h、6 h、12 h、24 h、48 h分别为1.37±0.18、1.75±0.32、1.21±0.23、0.91±0.19、0.63±0.26,总体比较差异有统计学意义(F=813.717,P=0.000)。Western blot结果显示,不同培养条件下RGC-5细胞中RDX蛋白的总体比较差异有统计学意义(F=1.279,P=0.000)。低氧3 h、6 h、12 h、24 h组RDX/GAPDH A值均高于正常对照组,差异均有统计学意义(t=55.301,P=0.000;t=139.986,P=0.000;t=37.552,P=0.000;t=4.183,P=0.014);低氧48 h组RDX/GAPDH A值(0.24±0.03)低于正常对照组(0.33±0.02),差异有统计学意义(t=38.889,P=0.000)。在低氧组内不同时间点比较,RDX/GAPDH A值随时间的延长呈逐渐上升趋势,于低氧6 h达高峰,然后开始下降,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光观察发现RDX蛋白阳性表达在RGC-5细胞中,与正常对照组相比,低氧组RDX的表达先增强(6h)后减弱。结论低氧条件下小鼠RGC-5细胞中RDX表达水平先升高后降低,可能与视网膜新生血管疾病中RGC凋亡相关。

藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤小鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制研究

目的研究藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用及其机制。方法将144只C57BL/6小鼠随机分为3组假手术组、模型组、藏红花素治疗组。模型组和藏红花素治疗组小鼠建立RIRI模型,藏红花素治疗组小鼠造模前30 min腹腔注射50 mg·kg^(-1)藏红花素。RIRI后14 d,视网膜铺片染色比较各组小鼠RGC密度差异。RIRI后24 h,HE染色比较各组小鼠视网膜内层厚度差异。于RIRI后不同时间点(0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h)取各组小鼠视网膜组织,通过多重基因定量分析系统检测NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素-1β(IL^(-1)β)mRNA的表达变化。RIRI后6 h和12 h取各组小鼠视网膜组织,Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL^(-1)β蛋白的表达,ELISA检测IL^(-1)β蛋白的含量,并对比分析。结果小鼠RIRI后14 d,视网膜铺片染色结果显示,藏红花素治疗组较模型组小鼠RGC密度增加约18.5%(P<0.05)。RIRI后24 h,HE染色结果显示,藏红花素治疗组小鼠视网膜内层厚度较模型组显著降低(P<0.01)。多重定量分析系统检测结果显示,RIRI后6 h、9 h及12 h,藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中Caspase-1以及IL^(-1)βmRNA表达较模型组均显著降低(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中Caspase-1以及IL^(-1)β蛋白表达较模型组均显著降低(均为P<0.05)。RIRI后6 h、12 h,模型组小鼠视网膜组织中NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达与假手术组相比无显著变化(均为P>0.05)。ELISA检测结果进一步证实,RIRI后6 h和12 h,藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中IL^(-1)β蛋白含量较模型组均显著降低(均为P<0.05)。结论藏红花素通过抑制Caspase-1和IL^(-1)β表达保护RIRI小鼠RGC。

辛伐他汀对视神经夹伤后小鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨辛伐他汀对视神经损伤后(optic nerve crush,ONC)视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的保护作用。方法将60只昆明鼠分为正常组、假损伤组、损伤组和辛伐他汀修复组。正常组不作任何处理,假损伤组只暴露视神经不损伤,损伤组行左眼视神经夹伤手术后,玻璃体内注射平衡溶剂(50 mg·m L^(-1)乙醇和1 mol·L^(-1)Na OH的混合溶剂,并用1 mol·L^(-1)盐酸激活并调节p H值为7.2),辛伐他汀修复组行左眼视神经夹伤手术后,玻璃体腔注射不同浓度辛伐他汀(0.5g·L^(-1)、1.0 g·L^(-1)、1.5 g·L^(-1))。Brn3a免疫荧光染色、HE染色、甲苯胺蓝染色检测RGC凋亡及视神经的病理变化。结果术后7 d,损伤组RGC凋亡明显,RGC存活率降低至(35.1±3.9)%,RGC层到外核层厚度由(123.13±1.04)μm降低至(97.48±2.33)μm,与正常组相比,差异有统计学意义(P<0.01);视神经纤维束状排列消失,神经胶质细胞轴突聚集成团,肿胀变形,退行性病变严重,与正常组相比差异显著。玻璃体内注射1.0 g·L^(-1)辛伐他汀后,RGC存活率增加至(76.3±3.7)%(P<0.05),RGC层到外核层厚度增加至(111.39±4.06)μm,与损伤组相比,差异有统计学意义(P<0.01),视神经退行性病变明显改善,胶质细胞轴突和神经纤维束状结构趋于正常。结论玻璃体内注射辛伐他汀可以减缓视神经退行性病变,提高RGC存活率。

阻断DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路对ITON小鼠视网膜神经节细胞存活的影响

目的研究阻断DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路的表达能否促进间接性创伤性视神经病变(ITON)小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的存活并比较阻断不同位点产生的阻断效果。方法使用能够产生创伤性轴突损伤(TAI)的撞击加速(IA)模型对6~8周龄的小鼠进行处理模拟间接性创伤性视神经病变,筛选出符合条件的小鼠分为4组:空白对照组,IA组,IA+sunitinib组,IA+SP600125组。在实验要求的各个时间点留取标本,进行γ-synuclein或p-c-JUN免疫荧光染色、TUNEL染色和Western blot检测,并进行统计学分析。结果免疫荧光染色结果显示,与IA组相比,IA+sunitinib组和IA+SP600125组存活的RGCs密度显著升高、p-c-JUN(+)RGCs密度显著降低(P<0.05);TUNEL检测结果显示,与IA组相比,IA+sunitinib组和IA+SP600125组凋亡的RGCs密度显著降低(P<0.05);Western blot检测结果显示,与IA组相比,IA+sunitinib组和IA+SP600125组DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路中的相应下游蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路的激活与ITON小鼠中RGCs的存活率相关,应用DLK抑制剂或JNK抑制剂可有效阻断该通路的蛋白表达,并促进RGC的存活,且后者效果更佳。

Thy1-YFP转基因小鼠视网膜神经节细胞的存活率

目的:研究转基因小鼠Thy1-YFP在视神经钳夹(ONC)模型和谷氨酸兴奋性毒性(NMDA)模型中YFP阳性视网膜神经节细胞(YFP^(+)RGCs)的存活率与总体RGCs(RBPMS^(+)RGCs)的存活率差异,以期为Thy1-YFP小鼠在视神经退行性病变中的进一步研究提供实验数据支持。方法:8周龄Thy1-YFP小鼠(雌雄不限)共20只,采用随机数字表法将小鼠随机分为正常组、ONC模型组和NMDA模型组。正常组小鼠进行左右眼对照;模型组小鼠均采用单眼造模,对侧眼为对照眼。其中,ONC小鼠于钳夹后7 d取材,NMDA小鼠于NMDA玻璃体腔注射后24 h取材。取材后,通过全视网膜铺片荧光染色和激光共聚焦拍照的方式获取RGCs信息,利用Image J计数YFP^(+)RGCs和总体RBPMS^(+)RGCs。统计分析ONC模型和NMDA模型中YFP^(+)RGCs的存活率与总体RBPMS^(+)RGCs的存活率差异,存活率差异以实验眼与对照眼的YFP^(+)RGCs(或RBPMS^(+)RGCs)的密度比值计算。结果:Thy1-YFP转基因小鼠视网膜上YFP^(+)RGCs和RBPMS^(+)RGCs的平均密度左右眼一致,具有可比性,其中YFP^(+)RGCs约占总RGCs的0.19%。在ONC模型中,与对照眼相比,ONC眼的YFP^(+)RGCs与RBPMS^(+)RGCs的密度都出现了大幅度下降。YFP^(+)RGCs的平均存活率为(59.4±8.2)%,而RBPMS^(+)RGCs为(33.0±1.7)%,差异达26.4%(P<0.001)。在NMDA模型中,与对照眼相比,NMDA注射眼的YFP^(+)RGCs与RBPMS^(+)RGCs的密度亦都出现了大幅度下降。YFP^(+)RGCs的存活率为(46.1±6.0)%,而RBPMS^(+)RGCs为(32.4±3.5)%,差异达13.7%(P<0.01)。结论:转基因小鼠ONC模型与NMDA模型表明YFP^(+)RGCs存活率并不能良好地反映总RGCs的存活率,说明Thy1-YFP小鼠的RGCs并不能代表总体RGCs,存在一定的RGCs亚类特异性。本研究结果为Thy1-YFP小鼠在视神经退行性病变中的研究提供了数据支持,进一步加深了研究者对于Thy1-YFP转基因小鼠的认识,为将来的研究提供了方向和借鉴。

MFG-E8抑制青光眼大鼠视网膜神经节细胞凋亡的机制研究

目的 探讨乳脂肪球表皮生长因子8 (MFG-E8)在青光眼大鼠视神经保护中的作用与机制。方法 构建青光眼大鼠模型,将MFG-E8或D89E注射至大鼠玻璃体腔内。检测大鼠的眼压变化。通过HE染色、TUNEL染色、免疫荧光染色分别检测大鼠视网膜组织病理损伤、节细胞凋亡和小胶质细胞激活水平;通过Western blotting检测视网膜组织中cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9和BAX蛋白表达;通过ELISA和实时定量PCR检测视网膜组织中IL-10、TGF-β和NGF的表达水平。结果 与对照组相比,青光眼大鼠的眼压显著增加,视网膜神经节细胞复合体(GCC)层变薄,凋亡节细胞增加,cleaved-caspase 3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9和BAX水平升高,IBA1阳性细胞数增加,且IL-10、TGF-β、NGF水平增高;经MFG-E8治疗后,青光眼大鼠视网膜GCC层厚度增加,cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9、BAX水平降低,IBA1阳性细胞数和IL-10、TGF-β、NGF水平均增加;而MFG-E8失活异构体D89E处理后,大鼠青光眼进展进一步加重。结论 MFG-E8能够介导小胶质细胞激活,抑制神经节细胞凋亡,减缓大鼠青光眼的进展。

藏红花素通过跨膜受体蛋白/发状分裂相关增强子1信号通路对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的探讨藏红花素对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的作用及其可能机制。方法于2021年1月至2022年1月采用不同浓度藏红花素处理视网膜神经节细胞RGC-5,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养RGC-5细胞并用氯化钴(CoCl_(2))处理建立缺氧模型,分为缺氧组、藏红花素组、阳性对照(抗坏血酸)组和藏红花素+跨膜受体蛋白信号通路抑制剂(DAPT)组,另设对照组。Cell counting kit-8法检测细胞存活情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;钙荧光探针(Flou-4)实验检测各组细胞钙离子水平;实时定量PCR法检测跨膜受体蛋白(Notch1)、发状分裂相关增强子1(Hes-1)mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、钙依赖性蛋白酶家族1(Cal⁃pain1)蛋白表达情况。结果藏红花素组细胞活力0.83±0.08高于缺氧组0.45±0.04,细胞凋亡率(17.92±1.21)%低于缺氧组(51.82±5.36)%,钙离子水平0.27±0.04低于缺氧组0.76±0.05,差异有统计学意义(P<0.05);藏红花素+DAPT组细胞活力0.50±0.06低于藏红花素组0.83±0.08,细胞凋亡率(36.50±3.50)%高于藏红花素组(17.92±1.21)%,钙离子水平0.65±0.05高于藏红花素组0.27±0.04,差异有统计学意义(P<0.05)。与缺氧组比较,藏红花素组Bcl-2蛋白表达水平升高,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与藏红花素组比较,藏红花素+DAPT组Bcl-2蛋白表达水平降低,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论藏红花素对体外培养的缺氧RGC-5细胞凋亡有一定的抑制作用,可能是通过抑制钙离子内流,阻滞Notch1/Hes-1通路,提高细胞内抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平发挥作用。

雌二醇对激素性高眼压大鼠视网膜小胶质细胞和神经节细胞的影响

目的 初步探讨雌二醇对激素性高眼压(OHT)大鼠视网膜中小胶质细胞和视网膜神经节细胞(RGCs)的影响。方法 雄性SD大鼠36只(36眼),随机分为对照组、OHT组和高眼压雌激素处理组(E2-OHT组),每组各12只。其中OHT组和E2-OHT组大鼠在结膜下给予地塞米松磷酸钠注射液,对照组注射相同体积的无菌生理盐水。造模后2周,E2-OHT组大鼠除结膜下注射地塞米松磷酸钠注射液外,同时给予雌二醇滴眼液滴眼。各组大鼠在造模后4周摘取眼球,免疫荧光染色观察大鼠RGCs数量及小胶质细胞活化情况,Western blot检测大鼠视网膜中Brn3a及离子钙结合适配器分子-1(Iba1)蛋白表达,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测大鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA的相对表达水平。结果 造模前各组大鼠眼压比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后1周、2周、3周、4周,各组大鼠眼压比较差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与对照组相比,造模后1周、2周、3周、4周OHT组大鼠眼压均明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与OHT组相比,E2-OHT组大鼠造模后1周、2周眼压差异均无统计学意义(均为P>0.05);造模后3周、4周眼压下降,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,对照组大鼠视网膜小胶质细胞主要位于内丛状层,而OHT组大鼠视网膜小胶质细胞迁移到神经节细胞层并且发生了形态学改变(阿米巴样激活状态),E2-OHT组大鼠小胶质细胞形态及分布形式与对照组大鼠视网膜染色结果基本一致。与对照组相比,OHT组大鼠视网膜中RGCs数量减少,TNF-α和IL-1β mRNA相对表达量、Iba1蛋白表达水平均升高,Brn3a蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与OHT组相比,E2-OHT组大鼠视网膜中RGCs数量增多,TNF-α和IL-1β mRNA相对表达量、Iba1蛋白表达水平均降低,Brn3a蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 雌二醇可以抑制小胶质细胞活化,降低OHT大鼠视网膜中TNF-α和IL-1β的表达,减少对RGCs的损伤。