转染嵌合性T细胞受体基因小鼠T淋巴细胞的体外抗肿瘤作用

目的:研究小鼠T淋巴细胞在转染嵌合性T细胞受体基因后的体外抗肿瘤作用。方法:应用重组DNA技术,将HER2特异性嵌合性T-细胞受体构建入逆转录病毒载体;转入包装细胞后,收集病毒上清,转染小鼠T淋巴细胞,转基因后的小鼠T淋巴细胞分别与HER2阳性(SK-OV-3)或阴性(MCF-7)的肿瘤细胞系共培养,检测其细胞因子γ干扰素释放,51Cr释放法检测CTL评价其抗肿瘤效应。结果:所构建载体经酶切鉴定符合要求,乒乓法转染包装细胞系GP+E86,检测病毒滴度为1.2×106,Retronectin结合离心法转染经抗CD3/CD28单抗活化的小鼠T淋巴细胞,转染效率可达50%以上;转染嵌合性T细胞受体基因的T淋巴细胞与HER2阳性或阴性的肿瘤细胞系共培养后可检测到HER2特异性的细胞因子γ干扰素释放,51Cr释放法测CTL可见转染嵌合性T细胞受体基因T淋巴细胞对HER2阳性的肿瘤细胞具显著杀伤效应。结论:转染嵌合性T细胞受体基因的小鼠T淋巴细胞在体外可通过细胞因子释放和CTL效应发挥显著的抗肿瘤作用。

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞(英文)

背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常。神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体。目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达。设计:细胞-基因学观察。材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠。方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液。取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCl中制备JetPEI/DNA复合体。用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×108L-1,向24孔板中每孔加入400μL细胞悬液、100μLJetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中,分别于转染24,48,72h后收集神经干细胞。主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达。结果:转染24h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%。各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24h条带亮度较低,72h时外源基因表达水平最高。结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达。

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。

腹腔内注射TNF基因转染的LAK细胞对于腹水型肝癌小鼠的疗效

在逆转录病毒介导下将TNF基因转染入鼠LAK细胞中,结果发现,转染TNF基因的LAK细胞比正常LAK细胞和转染对照基因的LAK细胞分泌更高水平的TNF,其体外生长能力和杀伤活性均显著升高,抗TNF单抗可显著抑制其体外杀伤活性,表明其杀伤活性升高是由基因转染后所表达的TNF介导的.将较低数量的TNF基因转染的LAK细胞与IL～2联合腹腔内注射后,对腹水型肝癌小鼠有显著的治疗效果.

口服转胸腺素α1基因聚球藻对小鼠T细胞亚群作用的研究

为探讨口服后转胸腺α1(Tα1)基因聚球藻对T细胞亚群的作用,将小鼠随机分为空白对照组、野生藻组、转化藻(小剂量、中剂量和大剂量)组和日达仙组,用灌服的方式,给予空白对照组20mL·kg^(-1)的生理盐水,野生藻组0.4g·kg^(-1)的野生聚球藻;转化藻小、中、大剂量组,分别0.2g·kg^(-1)、0.4g·kg^(-1)和0.6g·kg^(-1)的转Tα1基因聚球藻;日达仙组则肌注给予3.2mg·kg^(-1)的胸腺素α1(日达仙)。结果表明转Tα1基因藻口服后可显著提高CD3亚群水平,显著提高CD4亚群水平,明显提高CD4/CD8的比值。提示转Tα1基因聚球藻具有增强机体免疫功能的作用。

IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM细胞免疫生物学特性的影响

目的分析转染IL-18基因后,小鼠卵巢癌OVHM细胞的IL-18mRNA及蛋白表达、培养上清中IL-18含量、IFN-γ诱生能力等免疫生物学特性的变化,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值。方法将逆转录病毒携带的小鼠活性IL-18基因转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型OVHM作为对照。分别采用RT-PCR及免疫细胞染色法检测3组细胞的IL-18mRNA及蛋白表达;ELISA方法测定细胞培养上清中IL-18的含量、及其诱生小鼠脾细胞产生IFN-γ的能力。结果OVHM/IL-18细胞中可检测到IL-18mRNA及蛋白的表达,而OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞中未见表达。OVHM/IL-18细胞可分泌IL-18,于培养24h时达高峰(138.25pg/mL±12.36pg/mL),之后逐渐减弱;OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞上清中未检测出IL-18。OVHM/IL-18细胞培养上清诱生IFN-γ的水平明显高于VHM/LXSN和野生型OVHM细胞(分别为33.84pg/mL±2.36pg/mL、18.80pg/mL±1.06pg/mL、18.43pg/mL±2.64pg/mL,P<0.01),VHM/LXSN与野生型OVHM细胞之间未见显著差异(P>0.05)。结论IL-18基因转染可有效提高小鼠卵巢癌细胞IL-18mRNA的表达及其蛋白的合成释放、诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ。IL-18基因转染可纠正肿瘤细胞的IL-18低表达状态,诱导IL-18的抗瘤效应,可能对抑制肿瘤生长、促进肿瘤消退有一定的应用价值。

重组小鼠干细胞逆转录病毒载体高效基因转染CD41^+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞

目的 :研究重组小鼠干细胞逆转录病毒载体介导基因转染 ,探索一条高效基因转染的途径 ,为重组小鼠干细胞逆转录病毒载体在基因转染中的应用提供理论依据和奠定实验基础。方法 :①逆转录病毒载体的构建 :EC1- 4 (repeats 1- 4ofcadherin - 5extracellulardomains)基因克隆产物和mutant(Ser2 2 2A)MEK 1基因克隆产物 ,Bg1Ⅱ和EcoRⅠ限制性内切核酸酶切割后 ,克隆进入逆转录病毒表达载体pMSCV。②CD4 1+ 细胞的获取和细胞培养 :从脐带血分离的CD34+ 细胞通过TPO诱导表达CD4 1,FACS分离CD4 1+ 细胞。高糖DMEM培养液培养NIH 3T3和MDA -MB - 4 35细胞 ,U937细胞培养在RPMI- 16 4 0培养液 ,UT7细胞是细胞因子依赖性细胞株 ,Iscove’smodifiedDulbeco’s培养液中加入GM -CSF。③测定病毒滴度 :逆转录病毒载体转入包装细胞 2 93,36h后收集病毒上清液 ,感染NIH3T3细胞 ,流式细胞仪测定病毒滴度。④Westernblot:基因转染CD4 1+ 、UT7、U937和MDA -MB - 4 35细胞 ,Westernblot检测基因产物的表达。结果 :2 93细胞产生高滴度MEK1pMSCV病毒 :3 1× 10 7,高滴度EC1- 4pMSCV病毒 :1 0×10 8。用稀释 8倍的病毒转染基因 ,重组逆转录病毒MEK1pMSCV转染白血病细胞株UT7和U973,GFP阳性细胞 (转染阳性细胞 )分别是 6 0 73%、

成骨细胞条件性视黄酸信号失活小鼠模型的构建与验证

目的·构建并验证可模拟维生素A缺乏症(vitamin A deficiency,VAD)导致的颅颌面骨畸形且出生后可存活的模型小鼠。方法·运用Cre-LoxP重组酶系统,通过将Osx^(Cre)与Rosa26dnRARα/dnRARα基因型的小鼠多代杂交,构建成骨细胞视黄酸受体α显性负突变体(dominant-negative retinoid acid receptorαmutation,dnRARα)条件性过表达小鼠Osx^(Cre);Rosa26^(dn/dn),实现成骨细胞视黄酸信号条件性失活以模拟VAD状态。取Osx^(Cre);Rosa26^(dn/dn)小鼠及其同窝对照小鼠股骨骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)与颅顶骨细胞,成骨诱导后,采用蛋白质印迹法(Western blotting)验证成骨细胞中视黄酸受体α(retinoid acid receptorα,RARα)蛋白的表达水平。取Osx^(Cre);Rosa26^(dn/dn)小鼠及其同窝对照小鼠颅顶骨细胞经诱导形成的成骨细胞,采用双荧光素酶报告基因技术验证视黄酸信号通路抑制程度。同时分别应用表达Cre、eGFP的腺病毒(Ad-eGFP与Ad-Cre)感染Rosa26^(dn/dn)小鼠股骨BMSC与颅顶骨细胞,成骨诱导后运用相同方法评价显性负突变蛋白表达水平与视黄酸信号通路抑制程度。取6周龄小鼠颅骨,运用Micro-CT及三维重建技术验证Osx^(Cre);Rosa26^(dn/dn)模型小鼠颅颌面骨畸形表型。结果·Western blotting结果显示,Osx^(Cre);Rosa26^(dn/dn)小鼠股骨及颅顶骨成骨细胞相较同窝对照小鼠表现出RARα蛋白水平上调。双荧光素酶报告基因实验结果显示Osx^(Cre);Rosa26^(dn/dn)小鼠成骨细胞的视黄酸反应元件(retinoid acid response element,RARE)活性相较同窝对照小鼠下调(P<0.05)。同时,Ad-Cre感染后Rosa26^(dn/dn)小鼠股骨及颅顶骨成骨细胞相较Ad-eGFP感染后表现出RARα蛋白水平上调,成骨细胞的RARE活性下调(P<0.05)。Micro-CT及三维重建结果显示,6周龄Osx^(Cre);Rosa26^(dn/dn)小鼠颅骨呈现长度缩短、骨发育不全等VAD样颅颌面骨畸形。结论·成功构建了成骨细胞条件性视黄酸信号失活小鼠模拟VAD所致颅颌面骨畸形,为未来VAD所致颅颌面骨畸形出生后致病机制与潜在靶点的研究提供了新的模型与途径。

人白细胞介素1受体拮抗剂基因转染人胚颞颌关节软骨细胞的实验研究

目的 研究人白细胞介素 1受体拮抗剂 (hIL_1ra)基因转染人胚颞颌关节软骨细胞的方法和表达。方法 分离培养人胚颞颌关节软骨细胞 ,将hIL_1ra基因以阳离子脂质体Lipefectine介导进行基因转染 ,免疫细胞化学染色和ELISA法检测转染细胞中hIL_1ra蛋白的表达。结果 使用阳离子脂质体介导hIL_1ra基因转染人胚颞颌关节软骨细胞 ,免疫细胞化学染色hIL_1ra蛋白呈阳性表达 ,瞬时转染和稳定转染时 ,转染细胞胞浆内和培养基上清液中均有目的基因的表达 ,与未经转染的对照组存在显著性差异 (P <0 0 1)。结论 体外实验证实脂质体介导hIL_1ra基因转染方法切实可行 ,为今后颞颌关节骨关节病的基因治疗提供了依据。

采用病毒受体基因转移技术建立EB病毒细胞感染模型

ＥＢ病毒感染人上皮细胞是受到许多条件限制的。通过补体受体（ＣＲ２）使ＥＢ病毒感染人上皮细胞是研究ＥＢ病毒与鼻咽癌关系的重要手段之一。我们把ＣＲ２基因的ｃＤＮＡ（３２１９ｂｐ）片段重组于真核表达载体＊Ｃ５中，并使之在人羊膜细胞（ＷＢｈ）和人鼻咽癌肿瘤组织传代细胞（ＣＮＥ３）中表达。ＣＲ２基因在细胞中的最高表达率可达总细胞数的５％。最后用ＥＢ病毒Ｂ９５－８株感染上述两种细胞，病毒在细胞中增殖成功。在病毒感染细胞后的２－２５天中，可以不同程度地在细胞中检出ＥＢ病毒相关抗原。抗原检出高峰出现在细胞被感染后的第４天。通过我们的实验，成功地建立了ＥＢ病毒细胞感染模型。为进一步研究ＥＢ病毒与鼻咽癌的关系建立了条件。

hsstr2基因转染肿瘤细胞的受体显像研究

目的将人生长抑素受体2亚型(hsstr2)基因转染至该受体表达阴性的肿瘤细胞,并进行该受体介导的肿瘤显像。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hsstr2基因并构建真核表达载体,将hsstr2基因转染至肺腺癌A549细胞系(hsstr2表达阴性),用RT—PCR及流式细胞术检测受体表达情况;采用高表达细胞株进行该受体体外结合特性研究,建立裸鼠肿瘤模型,探讨该受体介导的肿瘤显像方法。结果获得经测序完全正确的hsstr2基因,RT-PCR及流式细胞术鉴定选取高表达的细胞株,体外结合实验测得平衡解离常数Kd=5.65×10-10mol/L,最大结合容量Bmax=2.01×104结合位点/细胞,半数抑制浓度IC50=1.88×10-9mol/L。裸鼠肿瘤模型显像示,静脉注射显像剂99Tcm-RC-160后0.5-1 h肿瘤显影明显,24 h后肿瘤部位第2次显影。结论将hsstr2转染至该受体表达阴性的肿瘤细胞并进行受体介导的肿瘤显像是可行的,适宜显像时间为0.5-1 h。

腺病毒介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2R)基因表达对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖、迁移和凋亡等生物学行为的影响 ,用同源重组方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV AT2R) ,体外转染VSMC ,用流式细胞仪检测AT2R转染表达率 ,RT PCR方法检测AT2RmRNA表达 ,VSMC增殖用MTT比色法和 5 溴脲苷 (BrdU)掺入法检测 ,迁移用改良Boyden趋化小室法检测 ,细胞凋亡用流式细胞仪、原位末端标记法检测。结果表明 ,AdCMV AT2R转染后 ,VSMC表达率为 89.5 1% ;AT2R峰值表达时 ,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低 6 1.4%和 5 1.6 % (P <0 .0 1) ,VSMC的跨膜迁移数减少 6 2 .2 % (P <0 .0 5 ) ,细胞凋亡增加约 3.2倍 ,bax表达增加 76 .3% (P <0 .0 5 )。提示AT2R表达可介导抑制VSMC的增殖和迁移 。

精原干细胞体内转染途径建立转基因小鼠的可行性研究

目前,生产转基因动物的难度很大,成功率很低,这是因为制备转基因动物的主要方法是向受精卵原核中注射DNA。这种方法有其弱点,首先作为外源基因受体细胞的受精卵数量有限;其次外源基因的整合和表达的筛选工作不能在细胞水平上进行,只能在子代动物出生后,即在个体水平上进行选择,这就增加了工作量,而且周期长,成功率低,成本大,在大动物上实施起来尤其困难。这就要求我们找到一种更为有效而又简捷的转基因动物的制备方法。

小鼠干细胞因子基因以脂质体介导转染骨髓基质细胞

目的 小鼠干细胞因子 (SCF)以脂质体介导转染骨髓基质细胞并表达。方法 采用 PCR技术从 p RC/CMV(含 SCF c DNA)中钓取SCF c DNA膜外段活性区 ,克隆入真核表达载体 pc DNA3,转染体外富集的骨髓基质细胞 ;用 RT- PCR方法检测 m RNA表达水平及通过协同刺激集落形成来检测转染细胞上清的生物学活性。结果 转染 SCF c DNA的骨髓基质细胞 SCF m RNA水平表达量高于对照组 ,其细胞培养上清协同 GM-CSF刺激骨髓细胞形成集落数比 GM- CSF单独作用高。结论 脂质体介导质粒载体转染培养富集的骨髓基质细胞并表达 ,且转染上清具有生物学活性。

TNF-αⅠ型受体对小鼠脑血管内皮细胞iNOS和HO-1基因表达的影响

目的探讨TNFαⅠ型受体(TNFR1)对小鼠脑血管内皮细胞iNOS、HO1基因表达水平的影响。方法体外培养TNFR1基因敲除的小鼠脑血管内皮细胞(BVECTNFR1)和野生型小鼠脑血管内皮细胞(BVEC),分别给予5ngmLTNFα刺激24h后,用实时荧光定量PCR技术及Westernblot方法检测两种细胞iNOS基因和HO1mRNA和蛋白表达量。结果给予TNFα刺激后,iNOSmRNA和蛋白表达仅在野生型脑血管内皮细胞内明显增高,而在受体敲除脑血管内皮细胞无明显变化。HO1mRNA和蛋白表达量在野生型小鼠脑血管内皮细胞和受体敲除小鼠脑血管内皮细胞均明显增高。结论TNFα可能作用于脑血管内皮细胞TNFR1,增加iNOS表达,HO1表达增高并非由TNFR1介导,而由TNFα的其他受体介导。

转染弓形虫致密颗粒蛋白-1编码基因的小鼠巨噬细胞生物学特性

目的 探讨转染弓形虫致密颗粒蛋白 1编码基因 (P2 4)前后巨噬细胞生物学性状的改变。 方法 将构建的重组质粒用脂质体介导 ,转染到小鼠巨噬细胞RAW 2 64 .7,抗生素G418筛选出阳性克隆 ,逆转录 聚合酶链反应方法鉴定并比较不同细胞株P2 4的表达。光学显微镜观察形态学改变并绘制生长曲线。 结果 Cyto P2 4 RAW 2 64 .7、Nuc P2 4 RAW 2 64 .7及Mito P2 4 RAW 2 64 .7三株细胞的P2 4mRNA表达水平无显著差异 ,ER P2 4 RAW 2 64 .7明显高于前三者。而转染空载体的 4株细胞未见P2 4 mRNA的表达。ER P2 4 RAW2 64 .7较未转染的细胞贴壁速度快、生长能力强。 结论 P2

人白细胞介素-1受体拮抗剂基因转染人颞颌关节软骨细胞的基因表达

目的研究人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1ra)基因转染人颞颌关节软骨细胞的基因表达情况。方法hIL-1ra基因以阳离子脂质体介导转染体外培养的人颞颌关节软骨细胞,描记细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间,并采用酶联免疫吸附法检测瞬时转染和稳定转染细胞中hIL-1ra蛋白的表达。结果转染细胞与正常细胞的增殖率有一定差异,转染细胞胞浆内和培养基上清液中均有hIL-1ra蛋白的表达。在细胞转染结束后48h,细胞内hIL-1ra蛋白的表达量最高,稳定转染细胞中基因表达最长时间达72d以上。结论经阳离子脂质体介导hIL-1ra基因转染人颞颌关节软骨细胞后,目的基因在细胞内有一定数量的表达。

白介素1受体拮抗剂基因转染髁突软骨细胞的作用

目的:研究经人白介素1受体拮抗剂(hIL-1ra)基因转染后的人颞颌关节髁突软骨细胞对IL-1作用的影响。方法:将hIL-1ra基因以阳离子脂质体介导转染体外培养的人颞颌关节髁突软骨细胞,在转染细胞和对照组细胞培养基中加入IL-1β,描记细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间,MTT法检测细胞增殖情况的变化,硝酸还原酶法测定培养液中NO2-/NO3-浓度的变化。结果:转染细胞与对照组细胞增殖情况存在差异,转染细胞高于对照组,硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO2-/NO3-浓度,细胞培养液中NO的生成显著低于对照组(P<0.01)。结论:转染细胞hIL-1ra基因的表达对于IL-1作用存在拮抗和抑制作用。

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响。方法应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型。将PD大鼠随机分为3组,每组8只。假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1基因的NSCs进行移植。细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达。移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P>0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个。结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的 研究腺病毒 (Ad)介导mIFN β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性。方法 用Ad为载体将mIFN β基因导入B16细胞 ,观察mIFN β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变。结果 当MOI为 5 0～ 10 0 ,即可获得较高的转染效率 ,达 90 %± 1% ,转染细胞能表达分泌mIFN β并具有生物学活性 ;AdmIFN β感染对B16细胞的增殖能力无影响 ,但能显著提高细胞表面MHC Ⅰ类抗原的表达。结论 Ad载体具有较高的转移效率 ,并能使其携带的mIFN β基因有效表达 ;AdmIFN β转染的B16细胞的免疫原性显著增强。提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的。