转小鼠金属硫蛋白-Ⅰ基因聚球藻7002净化重金属废水的研究

以转小鼠金属硫蛋白-Ⅰ基因（mMT-Ⅰ）聚球藻7002为对象,研究了其在含Cd^2＋、Pb^2＋和Hg^2＋的培养基中的生长特性及其对重金属的净化性能.结果表明,无论从生长速率还是对重金属的耐受特性来看,转mMT-Ⅰ聚球藻7002均明显优于野生藻;随着培养进程的延续和细胞浓度逐渐提高,体系中Cd^2＋、Pb^2＋和Hg^2＋的浓度逐渐降低,降幅最大的时间约在试验开始后1-3 d左右;经3 d培养,转mMT-Ⅰ聚球藻细胞对Cd^2＋、Pb^2＋和Hg^2＋的净化率分别为63.90%、65.99%和96.27%,吸附量分别为10.75、58.89和112.61 mg·g^-1,而野生聚球藻的吸附量分别为3.40、27.01和1.12 mg·g^-1,前者分别是后者的3.16、2.18和100.45倍;并建立了操作时间和细胞浓度对净化率的单因子模型,以及总括动力学模型方程,模型对实验结果拟合良好.

转小鼠金属硫蛋白-Ⅰ基因聚球藻7002对重金属耐受性的研究

研究了野生和转小鼠金属硫蛋白-Ⅰ(mMT-Ⅰ)基因聚球藻7002对Pb、Hg、Cd、Mg、Ni、Cu、Co、Zn和As9种重金属元素的耐受性,以及重金属对藻细胞生长的半抑制浓度(IC50),并与相关文献进行了比较,旨在为转基因藻的工业应用提供依据。结果表明:转mMT-Ⅰ基因聚球藻7002每单位OD750最高可耐受4～5mmol/L的Pb2+、0.4～0.6mmol/L的Cd2+和0.8～1.2mmol/L的Hg2+,耐受性系数分别为1712.4～2140.5、92.9～139.4、331.6～497.3mg/g;相比野生聚球藻7002,它对Pb2+、Cd2+的耐受性提高了4～5倍,对Hg2+的耐受性提高了100倍左右。野生聚球藻7002的重金属耐受性系数(mg/g)大小依次为:As(Ⅲ)>Pb2+>Mg2+>Zn2+>Cu2+>Ni2+>Cd2+>Co2+>Hg2+,而转mMT-Ⅰ基因聚球藻7002的重金属耐受性系数(mg/g)大小依次为:As(Ⅲ)>Mg2+>Pb2+>Hg2+>Zn2+>Cu2+>Cd2+>Ni2+>Co2+。转mMT-Ⅰ基因聚球藻7002在重金属溶液中生长的IC50明显大于野生聚球藻7002和其他藻,其对Pb2+、Cd2+和Hg2+的IC50分别为96.60(72h)、3.94(72h)、7.57(96h)mg/L。

固定化转小鼠金属硫蛋白-Ⅰ基因聚球藻去除重金属的研究

利用海藻酸钠/CaCl2凝胶包埋法固定转小鼠金属硫蛋白-Ⅰ(mMT-Ⅰ)基因聚球藻7002及其野生宿主藻,就固定化藻的生长、对重金属的耐受性及其去除重金属的性能进行了初步研究。结果表明,固定化藻细胞比游离藻细胞生长较慢,培养周期较长,且最大细胞浓度偏低,但固定化可有效提高藻细胞对重金属的耐受性。固定化转mMT-Ⅰ聚球藻对Pb,Cd和Hg的耐受系数(以每单位的细胞吸光值OD750计)分别为6.077,0.610,1.093 mmol/L,而固定化野生聚球藻对于Pb,Cd和Hg的耐受系数分别为1.981,0.170,0.091 mmol/L;固定化转mMT-I聚球藻对重金属的去除效能明显优于游离藻:经3 d的处理,固定化转MT藻对Pb,Cd,Hg的去除率分别为88.09%,81.23%,91.45%,而固定化野生藻在相同的条件下则分别为77.3%,73.47%,85.44%。

小鼠锌指蛋白基因ZF-12的克隆与基因结构以及5′端启动子活性的分析

人类锌指蛋白ZNF191为类kr櫣ｐｐｅｌ转录因子 ,其可能与神经精神病、心血管疾病和肝癌等疾病的发生或发展有关 ,为了采用基因敲除模型来探讨它的生理功能 ,克隆和定位其在模式生物 (小鼠 )中的同源基因 ,并阐明其结构特征是必需的。通过筛选小鼠λ噬菌体基因组文库 ,获得了它在小鼠中的同源基因ZF 12基因组全长片段。序列分析表明 :该基因含有 4个外显子和 3个内含子 ,内含子都遵循GT AG的剪接模式 ;第 91密码子处存在单核苷酸多态性 ;可能存在 2种大小不同的 3′端的非翻译区 (3′ UTR) ;与锌指蛋白基因Zfp 35相连锁 ,可将其定位于 18号染色体的B3 C带上或附近 ;5′端上游存在 1个约 2 5 0bp高度富含GC的启动子序列。ZF 12基因的 5′端系列缺失荧光素酶基因报告载体的瞬时转染实验表明 :其上游序列 (- 76 2～ +70bp)具有启动子转录活性 ,在更上游的序列(- 82 4～ - 76 2bp)上可能存在负调控元件。这项研究结果为进一步的基因敲除研究奠定了基础。

β-肌动蛋白启动子指导下人bcl-2转基因小鼠模型的建立

目的 :通过原核注射法将肌动蛋白启动子 /bcl 2基因转入小鼠受精卵 ,制作转bcl 2基因的小鼠 .方法 :构建 β actin启动子 /bcl 2表达载体 ,小鼠进行超排获得原核期胚胎 ,应用原核注射法进行转基因操作 ,对新生小鼠通过基因组DNAPCR和Southernblot方法进行鉴定 .结果 :注射成功率为5 8% (5 80 / 10 0 0 ) ,新生小鼠为 33只 ,PCR检测转基因阳性为 8只 ,经过Southern杂交检测有 4只转基因阳性鼠 .结论 :通过原核注射法获得转bcl 2基因的阳性小鼠 ,建立bcl 2转基因动物模型 ,为脑缺血再灌注损伤的机制研究提供手段 .

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。

小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子的克隆与序列分析

目的克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein ,DSPP)基因启动子片段。方法培养MDPC - 2 3细胞,从培养的细胞中提取基因组DNA ,利用设计的上下游引物,进行PCR反应。将扩增得到的DSPP基因启动子片段克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后,进一步进行DNA序列测定。结果酶切结果表明成功构建重组质粒,序列分析结果与国外报道一致。结论成功克隆获得小鼠DSPP基因的启动子片段。

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .

嗜上皮细胞特异性启动子ED-L2转基因小鼠的建立

目的 :利用ED L2启动子构建载体 ,建立鼻咽癌转基因动物模型 .方法 :将ED L2 pEGFP质粒用XhoI酶切线性化 ,胶回收线性化片段 ,稀释浓度 4mg·L-1 ,采用显微注射法 ,将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内 .结果 :产 1 2只小鼠 ,PCR检测基因整合 ,其中阳性 9只 ,阳性率 75 % ,SouthernBlot检测阳性 2只 ,阳性率 1 6 .6 7% .结论 :嗜上皮细胞特异性启动子ED

UHS-拟蜘蛛拖丝蛋白基因转染小鼠成纤维细胞及其鉴定

为了获得转拟蜘蛛拖丝蛋白基因2S的阳性小鼠成纤维细胞,本研究将前期工作中人工合成的拟蜘蛛拖丝蛋白基因2S和克隆获得的小鼠超高硫角蛋白启动子(UHS),与带有IRES序列和GFP报告基因的表达载体连接,构建真核表达载体UHS-2S-pIRES2-EGFP;将UHS-2S-pIRES2-EGFP线性化后,采用脂质体法转染小鼠皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得neo基因抗性阳性细胞。结果表明:(1)成功构建UHS-2S-pIRES2-EGFP;(2)转基因细胞的最佳G418筛选浓度为400μg/mL;(3)筛选获得呈梭形的转基因细胞,对其进行传代培养时,细胞增殖缓慢,细胞未呈现正常细胞的"S"型的生长曲线;(4)PCR检测结果显示,UHS-2S-pIRES2-EGFP载体已经整合到G418抗性细胞的基因组中。

C/EBPα参与小鼠胰岛β细胞囊泡谷氨酰胺转运子2基因表达的调控

目的:探讨转录调节因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在小鼠胰岛β细胞株MIN6的囊泡谷氨酰胺转运子2(VGLUT2)基因表达过程中的调控作用。方法:克隆小鼠VLGUT2基因的启动子区,并对其中C/EBPα的结合位点进行了核酸定点突变,以荧光素酶活力方法观察突变后的启动子活性改变情况。通过电泳迁移率实验(EMSA)检测C/EBPα与含有小鼠VGLUT2启动子区核酸序列的核苷核探针的结合能力,以CEBPαsiRNA特异性抑制转录调控因子C/EBPα的基因表达,通过荧光素酶,RT-PCR和Western blotting方法观察抑制C/EBPα基因表达后小鼠VGLUT2的基因表达情况。结果:在对小鼠VGLUT2启动子区C/EBPα结合位点进行核酸定点突变后,小鼠VGLUT2启动子活性下降约50%,EMSA实验表明C/EBPα可与小鼠VGLUT2启动子区结合,当以C/EBPαsiRNA特异性地下调C/EBPα的表达时,小鼠VGLUT2的启动子活性、mRNA和蛋白水平也相应各自下降约60%、40%及45%。结论:C/EBPα参与了小鼠VGLUT2的基因表达调控。

肌注组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内表达

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是人体内重要的丝氨酸蛋白酶,它能特异地激活血栓中的纤溶酶原,使之成为具有溶解纤维蛋白能力的纤溶酶,临床上将提纯的t-PA作为心血管栓塞性疾病急救和康复治疗的首选药物。由于t-PA在天然材料中含量甚微,难以大量制备,基因工程产品产量有限,临床应用货源紧缺且价格昂贵。

用地高辛标记的PCR-ELISA技术快速检测转基因鱼

取含有小鼠重金属螯合蛋白 (mMT)基因启动子及人生长激素 (hGH)基因的鱼样品 ,以Qiagene核酸纯化技术对鱼组织DNA进行纯化。常规PCR检测显示 ,mMT启动基因和hGH基因的PCR产物分别为2 4 0bp和 130bp ,与设计相符。PCR产物的核酸测序结果证实其扩增产物具特异性。地高辛 PCR(Dig PCR)标记反应显示 ,2个基因均产生 1条Dig标记的特异产物带。Dig PCR ELISA检测敏感性试验显示 ,对mMT启动子和hGH基因的检测敏感性可达 10 - 3,与常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测方法相比 ,检测敏感性可提高至 10 0～ 10 0 0倍。试验证明 ,针对mMT和hGH基因所建立的Dig PCR

小鼠巢蛋白基因启动子及其组织特异性增强子

该发明专利提供了一种小鼠巢蛋白启动子元件和增强子元件，包括这些元件的构建物和载体，以及它们的用途。

携带白蛋白启动子小鼠SCP2基因表达载体的构建

胆汁中胆固醇的过多分泌伴随肝细胞浆内胆固醇的浓度显著增高是形成胆固醇结石的关键因素，其中固醇携带蛋白2（SCP2）是影响肝细胞中游离胆固醇浓度的主要因素。本实验旨在构建携带白蛋白启动子小鼠SCP2基因表达载体。

人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及其功能的验证

构件pbCNCS/LF36经微注射获得转基因小鼠,同时为了准确筛选出整合的单克隆细胞,增加1个Cre/LoxP-GFP-Neo系统构建成pAPLM,将其转染山羊胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果表明:小鼠受体妊娠率28.5%,产仔32个,PCR整合检测4只阳性(3♀、1♂,整合率12.5%)。构件产生的3只母鼠和4号后代母鼠乳汁中重组人乳铁蛋白(hLF)用ELISA方法检测,表达量分别为3.8、2.8、0.9mg.mL-1,4号后代3只母鼠表达量分别为4.2、3.9、3.6mg.mL-1。构件pAPLM片段转染细胞后,经G418筛选,挑取单克隆扩大培养,其中8株PCR阳性克隆细胞荧光显微镜观察100%都有GFP的表达。以上结果证实,双启动子能调控外源基因在乳腺中特异高水平表达hLF,双标记基因可提高筛选阳性供核细胞的准确性,这为进一步作体细胞转基因克隆奠定基础。

小鼠与人重排活化基因2启动子的比较

目的 通过比较小鼠与人重排活化基因 2 (RAG2 )启动子 ,试图寻找与小鼠RAG2启动子特异性结合的转录因子。方法 采用表达luciferase的报告基因载体检测启动子的活性。采用EMSA(electrophoresismobilityshiftassay)检测与启动子结合的转录因子。结果 小鼠RAG2启动子 - 6 0 - 4 1区域存在富G的GA盒子 ,而人RAG2启动子在相应位置却是富A区。突变实验结果显示 ,GA盒子是小鼠RAG2启动子完整活性所必须的。EMSA结果显示 ,Sp1 Sp3结合在小鼠RAG2启动子 - 6 0 - 4 1区域 ,并且Sp1能够协同Pax 5、c Myb活化小鼠RAG2启动子。结论 尽管小鼠与人RAG2启动子同源性很高 ,但它们结合的转录因子和功能有所不同。

在转基因乳汁中生产人表面活化剂

由Yongli Wei领导的Baylor College of Medicine和University of Cincinnati College of Medicine的联合研究小组已研制出能在乳汁中表达人肺表面活化蛋白C(SP-C)的转基因的小鼠,SP-C是肺表面活化剂的一种重要组成成分。

GATA1在造血系统中的作用

GATA1也称为红系转录因子1(erythroid transcription factor 1,Eryf-1)、NF-E1(nuclear factor erythroid 1)或GF-1(globin transcription factor),是GATA转录因子家族中的一员,通过两个特征性锌指结构结合于WGATAR共有序列,在多谱系造血细胞中表达,如红系细胞、巨核细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细包[1].GATA1的结合位点广泛分布于珠蛋白基因和其他红系特异基因的启动子和增强子上,可转录激活所有已知的红系特异基因,因此,被认为是红细胞生成的关键调控因子[2].GATA1不仅调控正常血液系统的细胞分化和增殖,而且在一些血液系统疾病的发生中也发挥重要作用.现就GATA1的生理作用及其基因异常的致病性作一综述.