人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对肝纤维化小鼠模型的治疗作用及其机制分析

目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对肝纤维化小鼠的治疗作用及其机制。方法 选取18只SPF级6周龄C57BL/6小鼠,使用随机数字表法随机分为3组,分别为对照组、CCl_(4)模型组(CCl_(4)组)和h UC-MSC治疗组(MSC组),每组6只。CCl_(4)组和MSC组腹腔注射CCl_(4)溶液构建小鼠肝纤维化模型,对照组同时注射相同剂量玉米油,MSC组在注射CCl_(4)的过程经尾静脉注射hUC-MSC。于第8周末采取小鼠血清,处死小鼠,取小鼠肝脏固定。使用酶联免疫吸附法测定炎症因子水平,自动生化检测仪检测肝功能相关指标,HE染色、Masson染色、天狼星红染色及α-SMA免疫荧光用于评估肝纤维化情况;TGF-β刺激的肝星状细胞(HSC)分别在有无几丁质酶3样蛋白1(CHI3L1)添加的培养基中与hUC-MSC共培养,Western Blot试验检测蛋白表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。结果 Masson染色、天狼星红染色提示CCl_(4)组小鼠纤维化较对照组明显(P值均<0.05),MSC组小鼠纤维化较CCl_(4)组减轻(P值均<0.05)。CCl_(4)组IL-1β、IL-6、AST、ALT和ALP水平较对照组明显升高(P值均<0.05),MSC组IL-6、AST、ALT及ALP水平较CCl_(4)组明显降低(P值均<0.05)。CCl_(4)组CHI3L1和α-SMA的表达均高于对照组和MSC组(P值均<0.05)。细胞培养实验显示,MSC+HSC组Bax表达高于HSC组和MSC+CHI3L1组(P值均<0.05),提示CHI3L1逆转了MSC对活化的HSC的促凋亡作用。结论 hUC-MSC治疗可以改善小鼠肝纤维化,其作用机制可能与抑制CHI3L1从而促进HSC的凋亡相关。

过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进小鼠皮肤创面愈合

背景:神经调节蛋白1具有促进细胞增殖、分化以及血管生长等特性。人羊膜间充质干细胞是组织工程领域重要的种子细胞,已被证实参与组织修复及再生过程。目的:构建过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞,探究其增殖、迁移能力以及对创面愈合的影响。方法:(1)体外分离培养人羊膜间充质干细胞并对其进行鉴定;(2)构建神经调节蛋白1过表达慢病毒,将人羊膜间充质干细胞分为空载组、神经调节蛋白1组、对照组,分别转染空载慢病毒、过表达神经调节蛋白1慢病毒,对照组不进行转染;(3)EdU实验检测各组细胞增殖能力,Transwell实验检测各组细胞迁移能力;(4)构建C57BL/6小鼠创面损伤模型,随机分成对照组、空载组和神经调节蛋白1组,每组8只,分别在创面局部多点均匀注射1 mL转染空载慢病毒或转染过表达神经调节蛋白1慢病毒的人羊膜间充质干细胞,对照组注射等量的生理盐水;(5)造模后1,7,14 d观察创面愈合情况,苏木精-伊红染色观察创面愈合组织学变化,免疫组化观察创面CD31的表达。结果与结论:(1)成功构建过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞,细胞内神经调节蛋白1的mRNA、蛋白表达较空载组明显上调(P<0.05);(2)过表达神经调节蛋白1促进了人羊膜间充质干细胞的迁移(P<0.01)和增殖(P<0.05);(3)过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进了小鼠创面愈合(P<0.05)和创面的血管生成(P<0.05)。结果表明,过表达神经调节蛋白1提高了人羊膜间充质干细胞的增殖和迁移能力,以及增强了促进创面愈合和创面血管生成的能力。

间充质干细胞-透明质酸水凝胶促进脑缺血小鼠的神经修复

目的:探讨携带骨髓源间充质干细胞(MSCs)的透明质酸(HA)水凝胶对小鼠脑缺血损伤的修复作用。方法:制备HA水凝胶,培养骨髓源MSCs,将MSCs接种于HA水凝胶上共培养,形成HA-MSCs复合水凝胶;制备小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,2周后分别将HA水凝胶、HA-MSCs复合水凝胶植入小鼠脑缺血损伤区,观察MCAO组、HA组、HA-MSCs组小鼠运动功能恢复情况;材料植入8周后将小鼠灌注取脑,观察材料与脑组织整合情况,尼氏染色观察细胞向材料植入区迁移情况,电镜下观察材料植入区神经再生情况。结果:HA水凝胶电镜下呈蜂窝状结构,MSCs形态多样,可在HA水凝胶上粘附生长、增殖;HA-MSCs复合水凝胶植入小鼠脑缺血损伤区4周后可见小鼠前肢运动功能明显恢复(P<0.05);材料植入8周后取材发现植入的材料与脑组织整合良好,尼氏染色显示植入的材料部分降解,有大量细胞向材料植入区迁移、浸润,电镜下可见HA-MSCs植入区有细胞形成连接,有新生的血管和丰富的神经纤维存在。结论:携带MSCs的HA水凝胶可促进小鼠脑缺血后组织修复和运动功能恢复。

低强度脉冲超声增效脂肪间充质干细胞源性外泌体修复糖尿病小鼠皮肤创面的实验研究

目的探讨低强度脉冲超声(LIPUS)对脂肪间充质干细胞源性外泌体(ADSCs-Exos)修复糖尿病小鼠皮肤创面的增效作用。方法将ADSCs-Exos与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养,评估LIPUS对HUVECs摄取ADSCs-Exos的影响。选取SPF级C57BL/6雄性小鼠36只,构建糖尿病小鼠皮肤创面模型,将其随机分为对照组、Exos治疗组及LIPUS+Exos治疗组,每组各12只,应用活体成像观察ADSCs-Exos的分布及作用时间,冰冻切片观察糖尿病小鼠皮肤组织摄取ADSCs-Exos情况;比较各组小鼠治疗后3 d、7 d、10 d、14 d创面闭合率,以及14 d组织学检测情况。结果LIPUS可显著增加HUVECs对ADSCs-Exos的摄取,辐照后ADSCs-Exos的荧光强度(2.98×105)较未辐照者(0.31×105)显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。活体成像观察显示,LIPUS辐照能有效改善皮下注射后ADSCs-Exos的分布,促进其聚集于创面及周围组织,延长外泌体的作用时间;LIPUS+Exos治疗组治疗后1 h、6 h、36 h创面区域ADSCs-Exos的荧光强度分别为24.14×10^(9)、146.93×10^(9)、26.59×10^(9),均高于Exos治疗组(15.23×10^(9)、52.38×10^(9)、10.72×10^(9)),差异均有统计学意义(均P<0.05)。冰冻切片显示,LIPUS+Exos治疗组ADSCs-Exos阳性细胞率为(41.20±1.10)%,高于Exos治疗组[(23.16±1.16)%],差异有统计学意义(P<0.01)。LIPUS+Exos治疗组小鼠治疗后3 d、7 d、10 d、14 d创面闭合率均高于其余两组,差异均有统计学意义(均P<0.05);以LIPUS+Exos治疗组14 d创面闭合率最高,达(98.52±1.14)%。组织学检测显示,与对照组和Exos治疗组比较,LIPUS+Exos治疗组小鼠皮肤新生血管面积最大[(35.12±1.93)mm2],瘢痕长度最短[(1.20±0.20)mm],胶原容积分数最高[(62.35±1.72)%],差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论LIPUS能有效促进细胞对ADSCs-Exos的摄取,增强血管新生,加速糖尿病小鼠皮肤创面的修复。

人脐带间充质干细胞改善早发卵巢功能不全小鼠卵巢功能

目的:采用4-乙烯基环己烯二环氧(VCD)建立早发性卵巢功能不全(POI)小鼠模型,探讨人脐带间充质干细胞(HUMSCs)改善小鼠卵巢功能的作用机制。方法:选取连续14d动情周期正常的ICR雌性小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组各10只。模型组和治疗组连续20d腹腔注射VCD(160mg/kg)建立POI模型,对照组连续20天腹腔注射等量芝麻油。对治疗组连续两日注射人脐带间充质干细胞(10^(6)/ml)0.2ml/只/d,对模型组注射等剂量生理盐水,D 21检测各级卵泡数量、闭锁卵泡数量、血清雌二醇(E_(2))、促卵泡生成素(FSH)、抗穆勒管激素(AMH)水平,卵巢组织铁含量、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平,卵巢组织SCL7A11、GPX4、ACSL4、DMT1蛋白表达水平。结果:与模型组相比,治疗组体重升高,动情周期长度缩短,卵巢形态改善,卵泡数增多,闭锁卵泡数减少,血清E_2、FSH水平提高,AMH水平减少,卵巢组织铁含量下降,MDA含量下降、GSH水平提高,卵巢组织SCL7A11、GPX4、DMT1蛋白表达水平均升高,ACSL4蛋白表达水平降低(均P<0.05)。结论:HUMSCs可以通过抑制卵巢中铁死亡从而改善VCD致POI小鼠的卵巢功能。

小鼠骨髓间充质干细胞分离方法的比较与探讨

目的探讨可高效分离小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)的技术方法。方法分别采用骨片消化爬片法、全骨髓贴壁法、骨片消化液上清法和骨片消化研钵法等四种方法分离7~9周龄雄性C57BL/6小鼠的mBMSCs;于倒置显微镜下观察原代mBMSCs形态;运用流式细胞术检测mBMSCs特征性免疫表型;采用多向分化诱导检测mBMSCs成骨分化能力与成脂分化能力。结果分离获得的原代细胞首次换液后于倒置显微镜下观察:骨片消化爬片法分离的细胞,仅见大量骨碎片和杂细胞,该法所分离细胞不再进行后续检测评估;全骨髓贴壁法分离的细胞,仅可见少量多角形贴壁细胞,夹杂大量杂细胞;骨片消化液上清法分离的细胞也可见较多长梭形、三角形贴壁细胞,但杂细胞较多;骨片消化研钵法分离的细胞,可见较多长梭形、多角形贴壁细胞,杂细胞少。分离细胞经培养传代到第3代(P3代)时,一方面采用流式细胞术分析mBMSCs特征性免疫表型,结果表明骨片消化液上清法和骨片消化研钵法分离的mBMSCs纯度均较高,全骨髓贴壁法不理想;另一方面,进行成骨分化诱导与成脂分化诱导,结果表明与全骨髓贴壁法分离的细胞相比,骨片消化液上清法和骨片消化研钵法所分离出的细胞具有较强的多向分化潜能。结论骨片消化液上清法和骨片消化研钵法分离获得的mBMSCs纯度较高、质量较好。

负载Wharton’s Jelly源间充质干细胞来源外泌体的水凝胶可促进小鼠创面修复

目的:探究负载Wharton’s Jelly衍生的间充质干细胞(WJMSC)来源的外泌体(WEX)的水凝胶对创面修复的作用。方法:从WJMSC中提取WEX,通过透射电子显微镜和纳米粒度分析仪分析WEX的形态和大小,通过蛋白质印迹法检测外泌体表面标志物(CD9、CD81和Calnexin)鉴定WEX。通过结合WEX与海藻酸钠水凝胶来制备WEX水凝胶,扫描电子显微镜观察WEX水凝胶的形态,流式细胞仪检测WEX水凝胶的流变行为,BCA法评估WEX水凝胶的体外释药性能。海藻酸纳水凝胶、WEX和WEX水凝胶作用巨噬细胞系RAW264.7后,流式细胞术检测CD86和CD206的表达。建立小鼠全层皮肤创伤模型,将小鼠随机分为空白对照组、WEX对照组和WEX水凝胶组,按照分组分别将磷酸盐缓冲液、WEX和WEX水凝胶覆盖到创面。造模第3天,取小鼠皮肤组织,采用平板计数法评价WEX水凝胶的抗菌功效。造模后第15天处死小鼠,计算残余创面百分比,苏木精-伊红染色及Masson染色后观察皮肤创面组织学变化,免疫组织化学法检测皮肤创面组织中CD86、CD206、CD31和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果:成功从WJMSC中提取出WEX。制备的WEX水凝胶呈现规整的三维网络结构,具有良好的流变学和药物控释性能。WEX水凝胶可以促进体外RAW264.7细胞从M1表型极化为M2表型。空白对照组、WEX对照组和WEX水凝胶组残余创面百分比分别为(27.5±3.4)%、(15.3±1.2)%和(7.6±1.1)%,WEX水凝胶明显增强WEX对小鼠皮肤创面的修复作用(P<0.05),且抗菌性能优于WEX(P<0.05)。WEX水凝胶组的真皮厚度、新生毛囊数和胶原蛋白沉积率均明显高于其余两组(均P<0.05)。WEX水凝胶可抑制皮肤创面组织中CD86的阳性表达,并促进CD206、CD31和VEGF的阳性表达(均P<0.05)。结论:WEX水凝胶能够通过调节巨噬细胞极化明显促进小鼠皮肤创面修复。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体治疗过敏性哮喘小鼠模型的实验研究

目的:构建过敏性哮喘小鼠模型,研究人脐带干细胞来源的外泌体治疗过敏性哮喘模型小鼠的有效性,并探讨外泌体发挥作用的分子机制。方法:本研究中BALB/c小鼠随机分为人脐带间充质干细胞外泌体(hUCMSCs-exos)治疗组、激素治疗对照组、哮喘小鼠模型对照组和正常小鼠对照组。① 模型构建方法:在第1天和第14天给予15只小鼠腹腔内注射0.2 ml含有卵清蛋白(OVA)和AL(OH)3的混合液构建小鼠模型;② 治疗方法:在第21到27天,OVA组每天将致敏小鼠放入有机玻璃箱内给予5% OVA雾化30 min;正常对照组(CON)采用PBS雾化吸入30 min;激素治疗对照组采用布地奈德雾化吸入治疗30 min,每只鼠平均吸入0.02 mg;hUCMSCs-exos治疗组采用人脐带间充质干细胞培养上清制备的浓度为0.7 mg/ml的外泌体每天雾化治疗30 min。③ 标本采取和检测方法:造模和治疗结束后,采用眼周静脉丛采血法采静脉血;取肺组织和肺灌洗液。利用ELISA方法检测静脉血中的IgE及IL-4的浓度;肺组织切片做HE染色;肺灌洗液进行白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数。结果:hUCMSCs-exos干预治疗组的小鼠与模型对照组的小鼠相比炎症明显改善,可明显降低IL-4 (p < 0.05)和IgE (p < 0.01)的水平,BALF中的白细胞总数及嗜酸性粒细胞的指标也明显降低(p < 0.01),小鼠的肺组织炎症也有明显的改善;布地奈德治疗组的干预效果与hUCMSCs-exos治疗组的效果相似,但是从小鼠肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞数量的组间比较,可见hUCMSCs-exos治疗组的降低更加明显(p < 0.01)。结论:本研究结果证明,人脐带间充质干细胞来源的外泌体治疗过敏性哮喘模型小鼠是有效的。

脂肪间充质干细胞对卵巢早衰小鼠卵巢内分泌功能及颗粒细胞凋亡的影响

目的探讨脂肪间充质干细胞对卵巢早衰小鼠卵巢内分泌功能及颗粒细胞凋亡的影响。方法无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级昆明种小鼠36只,将其采用随机数字表法分为3组,即假手术组、卵巢早衰组以及脂肪间充质干细胞组,每组各12只。卵巢早衰组以及脂肪间充质干细胞组小鼠腹腔注射环磷酰胺和白消安建立卵巢早衰模型,假手术组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液。脂肪间充质干细胞组小鼠于造模成功后第1天起每7天经尾静脉注射1ml浓度为1.0×10^(9)/L脂肪间充质干细胞悬液,共注射4次。比较造模前1天、造模成功后14天和造模成功后28天3组小鼠血清雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黄体生成素以及抑制素B水平变化,并比较治疗后3组小鼠对卵巢病理损伤的影响和卵巢中颗粒细胞的凋亡。结果造模成功后14天,卵巢早衰组以及脂肪间充质干细胞组小鼠的血清雌二醇、孕酮以及抑制素B水平均低于假手术组(P均<0.05),促卵泡生成素、黄体生成素水平均高于假手术组(P均<0.05),且造模成功后28天卵巢早衰组小鼠的血清雌二醇、孕酮以及抑制素B水平均低于脂肪间充质干细胞组(33.57±1.98ng/L vs 41.66±1.70ng/L,t=-5.945,P<0.05;7.57±1.12ng/L vs 10.84±1.12ng/L,t=-4.056,P<0.05;110.58±4.18ng/L vs 129.86±2.97ng/L,t=-7.394,P<0.05),促卵泡生成素、黄体生成素水平均高于脂肪间充质干细胞组(5.15±0.20IU/L vs 3.61±0.12IU/L,t=10.401,P<0.05;510.94±7.11IU/L vs 410.14±5.45IU/L,t=22.407,P<0.05)。经脂肪间充质干细胞移植治疗后,卵巢早衰小鼠卵巢病理损伤明显减轻,且凋亡的颗粒细胞数量明显减少。结论脂肪间充质干细胞通过改善卵巢早衰小鼠卵巢内分泌功能,减少颗粒细胞凋亡,对卵巢早衰具有治疗作用。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与纯化培养的实验研究

目的探索小鼠骨髓间充质干细胞的体外纯化培养方法。方法先采用直接贴壁法培养的小鼠股、胫骨髓细胞,再用免疫磁珠法分选第3代中的CD11b-细胞。取分选纯化细胞进行形态学观察,并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞的分化能力。结果①原代及传代培养的小鼠骨髓贴壁细胞多呈梭形,部分呈不规则型,其中含有较多的CD11b+细胞;磁珠分离后的纯化细胞呈现纺锤型、星型及不规则型等多种形态,细胞质丰富,核仁明显,细胞平行排列或漩涡状生长;②成骨诱导3周后mMSCs分化为成骨细胞,茜素红S染色有橘红色磷酸盐胞外基质沉积;③随着成脂化诱导时间的延长,细胞逐渐增大,油红O染色可见胞质内大量橙红色脂肪空泡。结论单纯的贴壁及传代培养不能纯化小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁与免疫磁珠分离相结合才是一种有效的mMSCs体外分离和纯化方法。

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢

背景:脂肪来源间充质干细胞因其取材安全、创伤小、易纯化、增殖快等优点而备受关注。目的:建立一种有效、快速分离培养较高纯度小鼠脂肪间充质干细胞的方法,荧光标记后探索其是否可在体内向肠道归巢。方法:取小鼠腹股沟及附睾脂肪,用0.1%Ⅰ型胶原酶消化得到单细胞,并与剩余未消化脂肪组织块一起接种,贴壁培养获得脂肪间充质干细胞,通过细胞形态、细胞表型、生长动力学、成骨成脂分化潜能4个方面进行鉴定,并将脂肪间充质干细胞用PKH67标记后经尾静脉注射移植到溃疡性结肠炎模型小鼠体内,观察其向肠道的归巢情况。结果与结论:脂肪间充质干细胞镜下呈梭形,快速增殖呈漩涡状排列,细胞高表达CD29、CD44、CD90,不表达CD45。成骨诱导碱性磷酸酶染色显示有黑色颗粒生成,茜素红S染色呈红色结节,成脂诱导油红O染色显示有大量脂滴。细胞生长曲线显示第3-5天为对数增长期,细胞生长活力良好。结肠冰冻切片在荧光显微镜下可见绿色荧光光点,并随时间推移有增加趋势。以上结果表明采用胶原酶消化加组织块贴壁法体外分离培养的脂肪间充质干细胞增殖快、纯度高,可向成骨成脂细胞分化,在体内可向结肠归巢并增殖。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

探索在体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 (Bone m arrow m esenchym al stem cells,BMSCs)的最适条件。以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合 ,在体外分离 BAL B/C小鼠的 BMSCs,通过 MTT法测定了不同离心力、不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对 BMSCs分离和培养的影响。在 5 0 0 g× 30 min的离心力下分离细胞 ,加入 10 %的胎牛血清 ,原代按 (12～ 2 0 )× 10 5/m l的细胞密度接种 ,接种 2 4 h后换液 ,继代种植密度为 6 .4～ 2 5 .6× 10 4 /ml时最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,细胞快速增殖 ,传代后 8h贴壁达 90 %以上 ,2 4 h便进入对数生长期 ,直至第 5 d,细胞约增殖 3倍。本研究建立了在体外分离培养骨髓间充质干细胞的细胞生物学方法和技术参数。

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及其在肝内归巢

目的建立小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)分离培养的方法,并将ADSCs移植于体内,观察其致瘤性及肝脏归巢情况。方法取皮下脂肪用0.075%Ⅰ型胶原酶消化,贴壁培养获取小鼠ADSCs,通过流式细胞技术检测其表面分子、细胞周期;并将ADSCs注射到小鼠皮下观察其致瘤性,及尾静脉注射观察其肝脏的归巢。结果分离培养的细胞高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45、CD11b、CD14;细胞周期显示G0/G1、S、G2/M的细胞所占的比例分别为80.1%、7.9%、12%;ADSCs具有低免疫原性,不表达CD40、CD80、CD86、MHCI、MHCII以及PDL-1。在IFN-γ作用下,可轻度上调CD40、CD80以及PDL-1。ADSCs移植后未见成瘤,且可在肝脏实质内多处定居。结论胶原酶消化、贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离出高纯度的间充质干细胞,且ADSCs移植后能在肝内定居。

小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。

采用高速离心及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体比较及鉴定

比较及鉴定超高速离心法及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体。采用BCA蛋白检测可见ExoQuick-TC法提取的外泌体蛋白含量高于超高速离心法提取的蛋白含量。Exosome Antibodies,Array&ELISA Kits检测可见ExoQuick-TC法提取外泌体的纯度优于超高速离心法提取的纯度。两种方法提取的外泌体电镜下形状无差异,随机选取3个电镜视野进行计数可见ExoQuick-TC法提取外泌体数量多于超高速离心法提取外泌体。ExoQuick-TC法提取的外泌体具有更高的产量及纯度。

小鼠骨髓间充质干细胞向子宫内膜上皮细胞方向分化的体外实验

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外向子宫内膜上皮细胞方向分化的可行性。方法:原代培养小鼠BMSCs和子宫内膜间质细胞(ESCs)并鉴定,将BMSCs与ESCs共培养,并补充生长因子(TGF-β10ng/ml,EGF10ng/ml,PDGF-BB10ng/ml)和雌激素(17-β-雌二醇1×10-7mol/L),应用细胞免疫荧光染色法检测分化的BMSCs是否表达上皮细胞特异标记角蛋白。结果:小鼠BMSCs增殖潜能强,呈克隆性生长,其表面标记Sca-1,CD117,CD29,CD34表达率分别为5.36%,2.41%,2.63%,0.68%。小鼠ESCs特异标记波形蛋白表达阳性,角蛋白阴性。小鼠BMSCs与ESCs共培养5天后大部分细胞形态由成纤维样向上皮样细胞变化,细胞免疫荧光染色方法鉴定诱导分化后的BMSCs表达角蛋白。结论:小鼠BMSCs在ESC分泌和外源性因素诱导下可向子宫内膜上皮细胞方向分化。生长因子和雌激素在此过程中起重要作用。

骨髓间充质干细胞下调类风湿性关节炎小鼠脾脏单个核细胞TLR8及TLR9的表达

背景:间充质干细胞能够缓解类风湿性关节炎小鼠的症状,但是其机制还不清楚。目的:观察骨髓间充质干细胞对类风湿性关节炎小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8及TLR9等的影响。方法:DBA/1J小鼠随机分3组,非造模组不造模,阳性对照组和实验组制备Ⅱ型胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎模型。实验组尾静脉注射移植大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论:与阳性对照组比较,实验组小鼠关节直径明显减小,关节炎症细胞浸润程度明显降低,但比非造模组略高;小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8、TLR9和白细胞介素1β的水平较阳性对照组明显降低(P<0.01或P<0.05);阳性对照组与实验组中TLR8与TLR9的表达均无明显相关性(P>0.05)。说明骨髓间充质干细胞下调了类风湿关节炎小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8及TLR9的水平,但TLR8与TLR9的表达无相关性。

人参皂苷Rb1对体外条件下小鼠骨髓间充质干细胞和粒-巨噬系祖细胞增殖的影响

目的：探讨人参皂苷Rb1在体外培养条件下对小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）生长的影响。方法：设不同终浓度人参皂苷Rb1的细胞培养体系与对照，检测MSC集落生成率，M竹比色法测定MSC集落培养体系细胞的活力。结果：在培养体系中人参皂苷Rb1浓度为10μg／mL时，MSC集落产率和MTT吸光值与对照组无明显差异（P〉0．05）；25～100p．g／mL的范围内，MSC集落培养体系细胞集落产率和MTT吸光值显著高于对照组（P〈0．05），其中浓度为50μ/mL时效应最明显（P〈0．01）；在200μg/mL时，相应检测指标减低，但并未显示抑制作用（P〉0．05）。结论：人参皂苷Rb1在一定浓度范围内对体外培养条件下的小鼠骨髓MSC具有生长促进作用，但在高浓度时，其促进作用反而减弱。

血管紧张素Ⅱ对小鼠骨髓间充质干细胞中ERK1/2和NF-κB信号途径介导的炎症反应的影响

目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对小鼠骨髓间充质干细胞(bmMSC)炎症反应的影响。方法:分别采用0、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L AngⅡ体外诱导培养bmMSC 12 h,然后应用ELISA法检测细胞TNF-α和IL-6的分泌水平,RT-PCR法检测细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达水平,Western blot法检测细胞中ERK1/2和NF-κBP65蛋白磷酸化程度。结果:5组bmMSC TNF-α和IL-6分泌水平、mRNA表达水平,ERK1、ERK2和NF-κB-P65蛋白磷酸化程度差异均有统计学意义(F=34.562、53.940、24.622、30.208、96.129、106.293和24.752,P<0.001)。与0 mol/L AngⅡ组比较,10-8、10-7、10-6和10-5mol/L AngⅡ组细胞TNF-α和IL-6分泌水平升高(P<0.05),TNF-α和IL-6 mRNA表达水平升高(P<0.05),ERK1/2和NF-κB-P65磷酸化程度升高(P<0.05),并且表现出一定的剂量依赖性(P<0.05)。结论:AngⅡ可通过活化ERK1/2和NF-κB信号途径介导bmMSC的炎症反应。

rhBMP-7对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响。方法:采用密度梯度离心法分离骨髓,体外培养扩增,获得小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁培养至第3代,向培养液中加入rhBMP-7,培养5 d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,ALP活性与骨钙素(OC)含量检测,并用RT-PCR法分析成骨细胞标志基因骨钙素(OC)与Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)表达情况,Western blot法检测Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白的分泌量。结果:rhBMP-7诱导组的骨髓间充质干细胞的ALP染色强度、ALP活性及OC含量明显升高,OC与Col-Ⅰ的mRNA表达水平以及Col-Ⅰ的蛋白表达水平均明显提高。结论:rhBMP-7可促进体外培养的小鼠BMSCs向成骨细胞方向分化。