拟蜘蛛拖丝蛋白基因在小鼠颗粒细胞中的整合及其鉴定

为了探讨拟蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体（2S）在小鼠颗粒细胞基因组中整合和建立转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的小鼠颗粒细胞系的可能性,试验将在前期工作中人工合成的拟蜘蛛拖丝蛋白基因2S连接到具有CMV启动子、IRES序列和GFP报告基因的表达载体,并转染小鼠颗粒细胞。结果表明：原代培养的幼鼠卵巢的颗粒细胞在培养后的第4天达到85%汇合,继代培养1-7代时每代达到85%的汇合时间约为3 d,细胞的形态与原代培养细胞相似,呈现多角形或梭形;筛选阳性细胞的最佳G418浓度为500μg/mL;将线性化的CMV-2S-pIRES2-EGFP转染颗粒细胞,再用500μg/mLG418筛选12 d后仍有存活细胞,但是续培养细胞的增殖能力逐渐丧失;经PCR鉴定,阳性细胞扩增出目的条带。

重组胰岛素生长因子-1对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的研究

目的:验证胰岛素生长因子-1(IGF-1)对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。方法:将小鼠卵巢颗粒细胞分为两组,空白对照组和IGF-1培养组,IGF-1培养组在颗粒细胞培养液中添加100ng/ml IGF-1。通过CCK-8检测两组细胞分别在6、9、12h细胞的增殖情况;通过western blot检测细胞增殖核抗原(PCNA)的蛋白表达水平。结果:CCK-8结果显示,与空白对照组相比,IGF-1培养组在颗粒细胞培养9h细胞增殖最快;western blot结果显示,与空白对照组相比,IGF-1培养组中PCNA蛋白表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:IGF-1可促进颗粒细胞增殖。

FSH对缺血缺氧诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

目的探究促卵泡刺激素(FSH)对缺血缺氧损伤的小鼠原代卵巢颗粒细胞的保护作用。方法21日龄雌性ICR小鼠注射孕马血清(PMSG)42 h后,体外分离并培养小鼠原代卵巢颗粒细胞,分为对照组、单纯缺血缺氧组、缺血缺氧FSH干预组(0.1、0.2、0.4、0.6 IU·mL^(-1) FSH)。对单纯缺血缺氧组及缺血缺氧FSH干预组的细胞分别进行缺血缺氧处理及不同浓度FSH干预,通过TUNEL染色及流式细胞术检测细胞凋亡情况;通过Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白Bax的表达情况。结果TUNEL检测细胞结果显示:单纯缺血缺氧组TUNEL阳性细胞数最多、细胞凋亡率最高,FSH干预能够减少细胞凋亡,其中0.4、0.6 IU·mL^(-1) FSH干预组TUNEL阳性细胞较其他干预组减少,细胞凋亡率降低(P均<0.01);流式细胞术结果显示:除对照组外,其余各组凋亡率均有所增加(P均<0.01),在添加不同浓度FSH干预后,细胞凋亡被抑制,其中0.4 IU·mL^(-1) FSH干预组细胞凋亡率低于单纯缺血缺氧组和0.1 IU·mL^(-1) FSH干预组(P均<0.05);Western blot检测凋亡相关蛋白结果显示:与对照组相比,其余各组Bax蛋白表达均上调,Bcl-2蛋白表达量、Bcl-2/Bax比值均降低,0.4 IU·mL^(-1) FSH干预组的Bcl-2蛋白表达量、Bcl-2/Bax比值均高于单纯缺血缺氧组和其他干预组(P均<0.01)。结论添加FSH能抑制缺血缺氧诱导的小鼠颗粒细胞凋亡,降低细胞凋亡率,增强细胞的抗凋亡能力。

小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤及对沉默信息调节因子2相关酶1信号通路的影响

本试验旨在通过探究不同浓度过氧化氢(H_(2)O_(2))对小鼠卵巢颗粒细胞(MOGC)氧化应激损伤的影响,以构建MOGC氧化应激模型,并探究氧化应激损伤对沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)信号通路的影响。试验选用MOGC,采用单因素试验设计,分别用0(对照组)、100、200、400和800μmol/L H_(2)O_(2)处理24 h,测定细胞凋亡、细胞内活性氧(ROS)生成量、相关抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量以及凋亡相关基因表达。结果表明:1)与对照组相比,不同浓度H_(2)O_(2)组细胞活力均显著降低(P<0.05),当H_(2)O_(2)浓度大于200μmol/L并且作用时间超过24 h时,细胞活力低于50%。2)与对照组相比,不同浓度H_(2)O_(2)组细胞凋亡率显著提高(P<0.05)。3)与对照组相比,200、400和800μmol/L H_(2)O_(2)组细胞内ROS生成量显著提高(P<0.05)。4)与对照组相比,400μmol/L H_(2)O_(2)组细胞内超氧化物歧化酶活性显著降低(P<0.05);400、800μmol/L H_(2)O_(2)组细胞内过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和还原型谷胱甘肽含量显著降低(P<0.05),细胞内MDA含量显著提高(P<0.05);200μmol/L H_(2)O_(2)组细胞内GSH-Px活性显著降低(P<0.05),细胞内MDA含量显著提高(P<0.05)。5)与对照组相比,800μmol/L H_(2)O_(2)组细胞中B细胞淋巴瘤-2相互作用的细胞死亡中介物(Bim)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),细胞中B细胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);400μmol/L H_(2)O_(2)组细胞中Caspase-3 mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),细胞中Bcl-xL mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);此外,200、400和800μmol/L H_(2)O_(2)组细胞中SIRT1 mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),而细胞中叉头盒蛋白O1(FoxO1)、p53 mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)。结果提示,200μmol/L H_(2)O_(2)处理24 h为建立MOGC氧化应激模型的理想条件,并且SIRT1-FoxO1/p53通路参与了H_(2)O_(2)诱导的MOGC凋亡。

MiR-145靶向作用激活素受体ⅠB抑制小鼠卵巢颗粒细胞增殖

目的探讨miR-145对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的调控作用。方法制备Ad-miR-145重组腺病毒,分离培养3周龄的SPF级ICR雌性小鼠卵巢颗粒细胞(mGC),以不同浓度的Ad-miR-145(0 mol、50 mol、100 mol)感染m GC,48 h后通过CCK-8增殖实验检测细胞的增殖活力;收集细胞通过TRIZOL法提取细胞总RNA,反转录后进行实时定量PCR检测细胞增殖相关基因细胞周期蛋白cyclin D2 mRNA的表达情况;提取细胞蛋白,通过Western blot检测其中cyclin D2的蛋白水平;同时采用双荧光素酶报告基因调查miR-145对其预测靶基因激活素受体ⅠB(ACVRⅠB)的调控作用。结果成功获得滴度为8.91×10^(10) ifu/mL的高表达miR-145腺病毒,该腺病毒可在mGC中高表达miR-145;腺病毒介导的miR-145高表达可抑制m GC的增殖活力,并可抑制m GC中cyclin D2的m RNA和蛋白的表达;miR-145可抑制ACVRⅠB 3’-UTR的荧光素酶活性。结论 miR-145通过靶向作用ACVRⅠB抑制小鼠m GC增殖。

乙醇对感觉刺激诱发小鼠小脑颗粒细胞反应的影响机制

目的探讨乙醇对小脑颗粒细胞感觉信息传递的影响,揭示急性酒中毒对小脑皮质感觉信息传递与整合影响的部分机制。方法 ICR小鼠（6~8周龄）经腹腔注射乌拉坦（1.3 g/kg体重.）麻醉后,在小脑Crus II相应部位行直径为1~1.5 mm的开颅术,除去硬脑膜,脑表面暴露部位持续灌流人工脑脊液（ACSF）;三叉神经感觉刺激选用吹风刺激同侧触须垫,电生理记录选用GC场电位记录,通过膜片钳放大器及数据采集软件记录感觉刺激诱发GC场电位变化;电生理实验数据分析采用Clampfit 10.1软件,采用SPSS软件进行数据统计学分析。结果（1）吹风刺激（60 ms,50~60 psi）小鼠触须垫,可诱发小脑Crus II区颗粒细胞高保真反应。（2）小脑表面灌流乙醇对诱发反应的潜伏期没有明显影响,但可逆性地抑制颗粒细胞的感觉刺激诱发反应。（3）乙醇对小脑颗粒细胞的感觉刺激诱发反应的抑制作用有浓度依存性,最小抑制浓度为0.5 mmol/L,最大抑制浓度300 mmol/L。（4）高浓度乙醇（500 mmol/L）明显降低P1振幅中值（half-width）、振幅下面积（area）、P1上升参数（rise tau）和衰减参数（decay tau）,表明高浓度乙醇严重影响递质传递与信息传导。（5）阻断GABAA受体活性增强P1振幅,同时完全阻断乙醇对GC感觉刺激诱发反应的抑制作用,表明乙醇通过增强GABAA受体活性来抑制GC感觉刺激诱发反应。结论乙醇通过增强GABAA受体活性对小脑颗粒细胞感觉刺激诱发反应产生明显的抑制作用,表明乙醇抑制小脑颗粒细胞对感觉信息的传递,提示急性酒中毒对小脑运动调节功能的损害可能与乙醇抑制小脑皮质感觉信息传递有关。

低氧促进小鼠卵泡颗粒细胞凋亡

为研究低氧是否能促进小鼠卵泡颗粒细胞凋亡,将体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞分成对照组和低氧处理组。对照组的细胞一直在常规的二氧化碳培养箱内培养,低氧处理组的细胞先在常规二氧化碳培养箱内培养一段时间后放入三气培养箱内(1%的氧气,5%的二氧化碳,94%的氮气)培养,一定时间后收集两组细胞样:用流式细胞仪结合Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况;用荧光定量PCR检测HIF1α及BNIP3基因在两组细胞中的mRNA转录水平;用TUNEL染色法检测两组细胞的DNA断裂情况;在小鼠颗粒细胞中过表达HIF1α,检测BNIP3基因的mRNA转录情况。结果表明:与对照组相比,低氧处理能够显著促进体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡;低氧处理组HIF1α和BNIP3基因的mRNA转录水平显著高于对照组;低氧处理的小鼠卵泡颗粒细胞内有明显的核固缩现象,但DNA断裂多发生在胞质内;在小鼠颗粒细胞中过表达HIF1α能够引起BNIP3的mRNA转录水平升高。这些结果表明低氧处理能促进小鼠卵泡颗粒细胞的凋亡及细胞内HIF1α与BNIP3基因的表达量升高;由低氧处理后小鼠卵泡颗粒细胞内DNA断裂多发生在细胞质内,推测低氧引起小鼠颗粒细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径实现的。

JAK2/STAT3通路参与过氧化氢抑制小鼠原代颗粒细胞增殖的研究

目的通过过氧化氢(H2O2)处理体外培养的小鼠原代颗粒细胞(mGC),探讨JAK2/STAT3信号通路在H2O2抑制mGC增殖中的作用。方法应用H2O2、JAK2抑制剂AG490(不同浓度、不同作用时间)处理mGC;用CCK-8、增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)水平检测细胞增殖情况,RT-PCR检测JAK2mRNA水平,Western blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1的蛋白表达水平。结果 H2O2与AG490均以剂量和时间依赖方式降低mGC活率。750μmol/L的H2O2处理mGC 24h明显降低细胞活率(P<0.01),降低PCNA蛋白水平(P<0.01),并下调JAK2mRNA和蛋白表达水平(P<0.01);80μmol/L的JAK2抑制剂AG490可降低细胞活率(P<0.01),且使细胞中的p-JAK2、JAK2、STAT3、p-STAT3、PCNA、Cyclin D1表达均下降(P<0.05)。结论 H2O2抑制mGC增殖可能与JAK2/STAT3信号通路有关。

纳米银对小鼠卵巢颗粒细胞GRM02毒性作用研究

纳米银(nAg)的使用增加了人类健康潜在风险,这迫切需要对nAg做出安全评估。本研究方法:选取20,50,80 nm粒径nAg,2,4,8,16,32,64,128和256μg/mL不同浓度,对小鼠卵巢颗粒细胞(GRM02)处理24 h,MTT法检测计算细胞存活率,并筛选出不引起细胞大量凋亡或死亡的20 nm nAg,在20μg/mL浓度下处理GRM02细胞24 h,通过对培养细胞膜关键损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)活力,抗氧化酶系统活性以及关键凋亡因子检测分析。结果表明:处理组相较实验组细胞膜损伤关键指标LDH含量升高约3.2倍(p<0.01),CAT降低约86%(p<0.01),caspase-3含量提高了32.72%。结论:nAg会诱导GRM02细胞产生氧化应激,降低抗氧化酶活性,破坏细胞膜结构,激活了凋亡因子Caspase-3相关途径,介导细胞凋亡或死亡。