小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。

鸡骨骼肌卫星细胞系的建立及分析

旨在通过慢病毒包装SV 40-LT基因并转导PMSCs以构建鸡骨骼肌卫星细胞系。本研究采集20~30枚15胚龄健康AA鸡的胸部组织,采用混合酶消化法分离培养PMSCs。将细胞随机分为两组,每组3个重复,处理组选择SV 40-LT慢病毒转染48 h后,更换含1μg·mL^(-1)的嘌呤霉素筛选培养基于处理组和对照组(病毒不转染)。待对照组细胞全部死亡,对处理组细胞进行不断传代培养,最终获得鸡骨骼肌卫星细胞系。免疫荧光试验分析鸡骨骼肌卫星细胞标志基因PAX7的表达;采用CCK-8和细胞周期分析检测细胞增殖特性;血清依赖性和软琼脂分析检测其恶性转化情况;构建诱导分化模型检测其诱导分化能力。结果表明,PMSCs中有92%细胞PAX 7基因呈阳性,可用于后续研究。SV 40-LT基因在鸡骨骼肌卫星细胞系(IMSCs P12)中的表达是原代鸡骨骼肌卫星细胞的15倍,且连续传代至12代后,IMSCs P12与PMSCs均呈纤维样状。IMSCs P12具有更高的增殖活性且没有发生恶性转化,随后,对IMSCs P12进行诱导分化,在其增殖至70%到诱导分化1 d这一阶段,IMSCs P12与PMSCs的PAX 7基因表达下调,而MyoD和MyHC基因表达上调。结果提示,本研究通过转染SV 40-LT基因成功培养了鸡骨骼肌卫星细胞系,其具有与原代鸡骨骼肌卫星细胞相似的特性。该细胞系的建立为研究家禽骨骼肌相关的功能基因提供了新的平台,也为SV 40-LT基因在家禽细胞永生化的研究奠定了基础。

小鼠骨骼肌挫伤修复过程中周细胞数量变化及其与损伤时间相关性

目的观察小鼠骨骼肌挫伤后不同时间段周细胞数量变化规律,并探讨其在损伤时间推断中的作用。方法制作小鼠腓肠肌挫伤模型,应用免疫荧光染色法对小鼠骨骼肌挫伤后1、3、5、7、9、14、28d的周细胞形态及数量进行检测。结果与正常骨骼肌周细胞细长形态相比,挫伤区周细胞体积增大、形态变圆,胞核呈圆形,其中部分周细胞表达卫星细胞标记物配对盒转录因子(paired-box transcription factor,Pax7)或生肌决定因子(myoblast determination,MyoD) 1。挫伤后骨骼肌周细胞数量变化具有时间规律性,并随损伤时间延长呈单峰性分布。挫伤中心区周细胞数量于挫伤后5d达到峰值,挫伤周边区周细胞数量在挫伤后5d和7d达到峰值。结论小鼠骨骼肌挫伤后,挫伤区周细胞数量变化具有一定的时间规律性,提示其可能作为肌肉损伤时间推断的一个参考指标,并参与骨骼肌损伤后的肌肉修复再生过程。

小鼠快、慢肌卫星细胞的分离培养及β肌动蛋白的表达

目的体外分离培养和纯化小鼠快、慢肌卫星细胞,观察细胞内β肌动蛋白(β-actin)的表达情况。方法采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法及差速贴壁法纯化ICR小鼠后肢骨骼肌腓肠肌(快肌)和比目鱼肌(慢肌)卫星细胞,免疫荧光抗体细胞化学染色法鉴定。取第2代快、慢肌卫星细胞提取总RNA,以GAPDH作为内参行RT-PCR,半定量分析快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量。结果体外分离及传代培养快、慢肌卫星细胞的快、慢肌肌浆蛋白表达阳性,细胞生长和增殖情况良好。快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量分别为3.71072和2.106028,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论小鼠快肌卫星细胞内β-actin表达高于慢肌,提示骨骼肌卫星细胞内β-actin表达可能与肌纤维类型有关。

小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及慢病毒转染

骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell)是位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖和分化潜力的生肌干细胞,这些细胞对于出生后骨骼肌的生长和再生具有重要的意义。取小鼠后肢肌肉组织,取出脂肪,采用胰酶消化法获得细胞悬液,经差速贴壁法纯化骨骼肌卫星细胞,通过免疫细胞化学方法鉴定骨骼肌卫星细胞,用此法分离到了小鼠骨骼肌卫星细胞。

不同氧浓度下C2C12细胞的Nrf2抗氧化系统对H2O2刺激的反应

目的:探讨不同氧浓度下小鼠骨骼肌卫星细胞系(C2C12细胞)对H2O2刺激反应的变化及其机制。方法:小鼠骨骼肌卫星细胞系(C2C12细胞),经培养复苏后,将细胞分为7组,每组设8个复孔,各组分别加入浓度为0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L、1mmol/L、2mmol/L的H2O2,分别作用1h、2h后测细胞活力,选择细胞H2O2刺激的最佳作用时间和浓度;C2C12细胞分为不同氧浓度组:21%O2、12%O2、8%O2、5%O2每组设8个复孔,12h后,H2O2作用1h,收集细胞;检测细胞Nrf2蛋白荧光和蛋白表达量,测定Nrf2和抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT、NQO-1、HO-1、GPX-1的mRNA表达量及细胞ROS水平。结果:选择H2O2作用时间相对较短的1h和浓度0.5mmol/L作为本实验的H2O2刺激条件。与21%O2组相比,12%O2组细胞Nrf2蛋白荧光增强,Nrf2的mRNA和蛋白表达以及抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT、NQO-1、HO-1、GPX-1的mRNA表达均显著增加(P<0.05或P<0.01),细胞ROS水平明显降低(P<0.01);8%O2组仅GPX-1mRNA显著增加(P<0.05),其他指标变化不大;5%O2组细胞Nrf2mRNA和蛋白表达以及抗氧化酶SOD1、SOD2、NQO-1、GPX-1的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),细胞ROS水平则明显升高(P<0.01)。结论:不同氧浓度下C2C12细胞中Nrf2介导的抗氧化系统对H2O2刺激反应不同,12h的12%O2浓度可促进C2C12细胞Nrf2的抗氧化作用,而5%O2浓度的严重低氧则作用相反。

家蚕TRAP的表达差异和亚细胞定位

哺乳动物TRAPα是一个糖基化蛋白,大小为34 kD,受Ca2+调控,分布在内质网膜和核被膜;在人类骨髓细胞系中,TRAPα的mRNA转录受到巨噬性粒细胞集落刺激因子的正调控作用。Mesbah等研究发现,在出生后的小鼠骨骼肌和心脏细胞中存在一个略微不同的TRAPα表达。