细胞密度和血清对小鼠骨髓基质细胞体外生长的影响

目的:研究不同细胞接种密度、血清浓度及种类对小鼠骨髓基质细胞体外生长的影响。方法:设置不同细胞密度、不同种类血清及血清量的培养体系,观察细胞贴壁情况,细胞80%贴壁时间,用台盼蓝排斥试验检测活细胞率,MTT法检测细胞增殖情况,HE染色光镜下观察细胞形态。结果:原代全血培养的小鼠骨髓基质细胞适宜接种密度为1～4×106/ml;细胞最适生长的血清浓度为10%～20%;与胎牛血清相比马血清对小鼠骨髓基质细胞的促增殖作用更好(P<0.05);不同种类血清培养的小鼠骨髓基质细胞类型有一定差异(P<0.05)。结论:不同细胞接种密度及血清浓度和血清种类对小鼠骨髓基质细胞体外生长有一定影响。

叶酸代谢抑制剂对小鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响

采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法、细胞形态分析法及诱导分化法结合油红O染色法研究叶酸代谢中二氢叶酸还原酶抑制剂甲氨喋呤（methotrexate,MTX）、甲氨苄啶（trimethoprim,TMP）和乙胺嘧啶（pyrimethamine,PTM）对OP9小鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响,探讨叶酸代谢与脂质合成的关系。MTT实验结果显示,在一定浓度范围内,3种叶酸抑制剂均能抑制OP9细胞增殖,并呈现一定的剂量-效应依赖关系。且3种叶酸抑制剂在高浓度时对OP9细胞有毒性作用。倒置显微镜观察和油红O染色检测结果显示,TMP在500~1 000μmol/L浓度范围内对OP9细胞分化为脂肪细胞具有抑制作用。荧光定量聚合酶链式反应分析表明,TMP会使叶酸代谢途径中二氢叶酸还原酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶的转录水平发生下调,这可能是TMP抑制脂肪细胞诱导分化的原因。

Tet-off系统调控人IFNγ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达

背景与目的:Tet-off系统是一个高效、低毒、具有严密开关功能的基因调控系统,本研究构建质粒pTre-IFNγ,初步探讨Tet-off系统调控人干扰素γ(interferon-gamma,IFNγ)基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达。方法:SacⅡ、XbaⅠ双酶切载体pTre及目的基因,T4连接酶连接,重组体经双酶切、测序鉴定;脂质体介导pTet-off及pTre-IFNγ共转染小鼠骨髓基质细胞;RT-PCR法检测IFNγmRNA,ELISA法检测分泌到培养液中的IFNγ蛋白,分析共转染后IFNγ的分泌规律、共转染后48h中不同浓度盐酸四环素对IFNγ蛋白分泌的影响及在共转染后第48h加入盐酸四环素在不同时间阶段对IFNγ蛋白分泌的影响。结果:双酶切及测序证实质粒pTre-IFNγ构建成功;共转染后48hRT-PCR检测到IFNγmRNA表达;ELISA法示IFNγ蛋白分泌持续6天,第3天的分泌高峰为每1×106个细胞(720.09±241.51)pg;共转染后48h中蛋白分泌量随四环素浓度增加逐渐减少,10～100ng/ml四环素存在时蛋白分泌接近零;第48h时添加盐酸四环素后8h即能明显抑制IFNγ蛋白表达,延长作用时间,抑制效应加重。结论:Tet-off系统能迅速而高效地下调人IFNγ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达。

活性氧在900MHz微波辐射诱导小鼠骨髓基质细胞适应性反应中的作用

[目的]探讨活性氧(ROS)在900 MHz微波辐射诱导γ射线致小鼠骨髓基质细胞DNA损伤的适应性反应中的作用。[方法]给予小鼠骨髓基质细胞120μW/cm^2,900 MHz微波照射,4 h/d,连续5 d,微波照射结束4 h后给予1.5 Gyγ射线照射,照射结束后立即采用碱性单细胞凝胶电泳试验和γ-H2AX焦点形成试验检测DNA损伤,观察微波辐射诱导的适应性反应;采用500 nmol/L褪黑素(ROS抑制剂)在微波照射前4 h处理细胞,流式细胞仪检测ROS水平的变化,观察适应性反应的变化情况。[结果]微波照射后细胞内ROS水平(2.10)较对照组(1.16)升高(P<0.01)。与单独给予γ射线照射的彗星尾长、尾矩和γ-H2AX焦点形成数(分别为21.62μm、5.68、19.73)相比,预先给予微波照射可明显减轻随后γ射线照射造成的DNA损伤,彗星尾长、尾矩和γ-H2AX焦点形成数(分别为8.57μm、2.58、5.28)明显减少(P<0.001),诱导出适应性反应。褪黑素预处理细胞后,微波诱导产生的ROS下降为1.53(P<0.01),微波拮抗γ射线照射造成的DNA损伤程度也随之下降,彗星尾长、尾矩和γ-H2AX焦点形成数(分别为17.90μm、4.10、20.8)明显升高(P<0.001),适应性反应受到抑制。[结论]ROS可能在900 MHz微波辐射诱导细胞适应性反应中发挥作用。

适当质量浓度黄芪注射液可增强骨髓基质细胞的表面黏附性

背景:研究发现很多益气补血类中药均是通过影响骨髓基质细胞分泌一些细胞因子来促进造血干细胞的分化增殖,或者促进骨髓基质细胞和造血干细胞的黏附而发挥作用。目的:观察黄芪注射液对小鼠骨髓基质细胞表面细胞间黏附分子1、血管细胞间黏附分子1表达的影响。方法:采用全骨髓贴壁细胞分离筛选法培养小鼠骨髓基质细胞,倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色光镜及透射电镜观察小鼠骨髓基质细胞的形态。MTT法检测黄芪注射液促进骨髓基质细胞增殖的最佳浓度。流式细胞术检测黄芪注射液干预后小鼠骨髓基质细胞表面细胞间黏附分子1、血管细胞间黏附分子1的表达。结果与结论:倒置显微镜和光镜观察到骨髓基质细胞呈贴壁生长,细胞呈梭形或不规则形态,有突起;透射电镜观察到细胞内细胞器丰富,如粗面内质网、分泌小泡、线粒体等。黄芪注射液质量浓度为400和600 mg/L时可促进小鼠骨髓基质细胞增殖(P<0.05),且两种剂量组间比较差异无显著性意义。600 mg/L黄芪注射液可增加小鼠骨髓基质细胞表面细胞间黏附分子1、血管细胞间黏附分子1蛋白表达。结果表明适当质量浓度黄芪注射液能够增强基质细胞的黏附性,对造血微环境有改善作用。