AMPK信号通路在调节小鼠骨髓巨噬细胞抗菌性自噬效应中的作用

目的观察AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)对小鼠骨髓巨噬细胞自噬及杀菌活性的调节作用,并探讨其可能机制。方法分离和体外培养小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDM),观察大肠埃希菌刺激后对BMDM细胞自噬水平及AMPK活化状态的影响。使用AMPK激动剂和抑制剂干预其活化,进一步观察大肠埃希菌感染的BMDM细胞中AMPK活化、自噬水平以及杀菌能力的变化。结果大肠埃希菌感染后的小鼠BMDM细胞自噬相关分子LC3B和Beclin1的表达显著升高,同时LC3Ⅱ/Ⅰ比值也明显升高,且其AMPK的磷酸化水平也随之显著上调。AMPK活性增强后,能够进一步上调BMDM细胞的自噬水平以及对细菌的降解清除。而AMPK活性被抑制后,细胞自噬水平和杀菌活性均显著下降。结论 AMPK分子及其相关信号通路可能在调节巨噬细胞自噬水平以及抗菌效应方面发挥重要作用。

小鼠骨髓巨噬细胞分离培养及吞噬能力检测综合实验的设计

目的 细胞培养是现代生物技术中最核心、最基础的技术。目前细胞生物学实验课程对原代细胞分离培养技术培训不足。因此文章设计了实验以进一步提高医学生细胞培养技能。方法 分离4~6周龄雄性ICR小鼠骨髓细胞,在体外使用含有巨噬细胞集落刺激因子的RPMI 1640培养液培养七天,于第三天更换培养液一次,第七天通过乳胶珠吞噬实验检测细胞吞噬能力。结果 小鼠原代骨髓单核细胞经巨噬细胞集落刺激因子诱导一周后,分化为巨噬细胞,同时该细胞具有吞噬能力。结论通过实验,学生掌握了相关实验技能;加深对相关理论课程的理解;科研能力及综合素质得到有效提升。

睾酮诱导的小鼠骨髓巨噬细胞凋亡途径研究

用睾酮诱导,研究小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs)凋亡过程中Fas/FasL途径上caspase-8表达的改变。以BMMs经L929条件培养基(LCM)诱导5d后,用流式细胞仪分选出F4/80阳性细胞,并将细胞分为两大组。第1组是空白对照组,睾酮(100nmol·L-1,下同)处理组,去除LCM组,去除LCM同时用睾酮处理组。第2组用FADD反义寡核苷酸(ASODN)转染BMMs后,重复第1组的4个处理组,并以FADD错义寡核苷酸(MSODN)转染后的睾酮处理组作为对照。处理12h后,用流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡情况,并通过RT-PCR、Real-timeRT-PCR和WesternBlot方法检测各组中caspase-8基因及蛋白的表达。结果显示,在缺少LCM或用睾酮处理时,睾酮可在体外诱导小鼠骨髓巨噬细胞凋亡,并伴随caspase-8的活化。FADD反义寡核苷酸能抑制睾酮诱导的小鼠骨髓巨噬细胞的凋亡,其下游的caspase-8表达也被抑制。

小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析

目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM。方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率。结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965。以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个。其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出。统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求。结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段。

烟曲霉孢子侵染小鼠骨髓源巨噬细胞的转录组研究

目的揭示小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)被烟曲霉(Aspergillus fumigatus)A1160c孢子侵染之后与未处理对照组BMMs相比表达出现差异的免疫信号通路及孢子吞噬和清除等相关基因。方法提取小鼠原代骨髓细胞并将其诱导分化成巨噬细胞。烟曲霉孢子感染并分别提取感染组和对照组BMMs的总RNA,进行RNA测序和分析比较。结果提取小鼠原代骨髓细胞并成功将其诱导分化成BMMs。BMMs在感染烟曲霉孢子后,表面受体Tlr2和C型凝集素受体Clec4e和Clec5a的转录被激活。NF-κB信号传导通路也被激活,如Il1b、Tnf、Nfkb1等炎症因子基因和Jun、Gsk3b、Tec、Cd83等相关基因转录上调。同时,Cxcl1、Cxcl2、Ccl4等多种趋化因子基因转录水平也上调。另外,活性氧产生相关基因Bax、Nos2、Glul、Nlrp3的转录水平明显升高。结论在感染烟曲霉A1160^(c)孢子过程中,BMMs通过上调Toll样受体和C型凝集素受体基因转录水平激活NF-κB等免疫信号传导通路,促进趋化因子及活性氧产生相关基因的表达,引发对烟曲霉孢子的免疫响应和清除。

碳-二氧化硅纳米复合颗粒促进小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的研究

目的研究碳-二氧化硅纳米复合颗粒(carbon-silica nanocomposite,CSN)对M2型小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)极化的影响。方法将介孔二氧化硅纳米复合颗粒(mesoporous silica nanoparticle,MSN)包覆葡萄糖,再经碳化制备得到CSN。利用红外光谱、能量色散X射线谱、透射电子显微镜和扫描电子显微镜对CSN进行表征;CCK-8实验检测CSN对小鼠BMDM的细胞活性的影响;将小鼠BMDM铺于6孔板,设置M0、M1、M2和M2+CSN组,用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测M1巨噬细胞中CD86、白介素6(interleukin-6,IL-6)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)及M2型巨噬细胞中CD206、精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的mRNA表达水平;Western blot检测iNOS和Arg1的蛋白表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞分子标志物CD80和CD206的表达情况。结果CSN由碳、氧和硅元素组成,元素比例分别为36.6%、35.5%和27.9%,呈均匀分散的球形纳米结构,直径分布为80~90nm。CSN在0、3.125、6.25、12.5、25、50μg/ml浓度下对小鼠BMDM的细胞活性影响无明显差异(P>0.05),与M0组比较,M1组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.01),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);M2组CD206和Arg1 mRNA表达水平均升高(P<0.001,P<0.01),Arg1蛋白表达升高(P<0.01),CD206表达升高(P<0.001)。与M2组比较,M2+CSN组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.001),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);CD206和Arg1 mRNA表达水平均降低(P<0.05,P<0.001),Arg1蛋白表达降低(P<0.05),CD206表达降低(P<0.05)。结论CSN能促进M2型巨噬细胞向M1型转化,调节肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)中M1/M2比例。

小鼠骨髓来源巨噬细胞培养模型的建立及鉴定

目的建立小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)培养模型,并对BMDM进行细胞表面标志物及吞噬能力鉴定。方法采用32℃培养10 d和37℃培养3 d的方式培养L929细胞,检测细胞上清中巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的浓度。获取小鼠骨髓细胞后,分别以M-CSF和两种条件培养的L929细胞上清进行诱导分化,通过光学显微镜对诱导分化后的BMDM进行形态学观察;流式细胞术检测CD11b阳性细胞株所占百分比,免疫荧光法观察诱导后巨噬细胞表面标志抗原CD11b和CD16的表达;对表达绿色荧光蛋白的大肠埃希菌进行吞噬试验鉴定BMDM的吞噬功能。结果32℃培养10 d的L929细胞上清中M-CSF的浓度显著高于37℃培养3 d(P<0.05)。3种诱导方式均可使小鼠骨髓源细胞分化成熟,经32℃培养10 d的L929细胞上清诱导分化后的BMDM生长状态最佳。流式细胞术检测显示巨噬细胞表面标志抗原CD11b阳性率为80.62%,免疫荧光检测显示诱导分化后的BMDM细胞表面有巨噬细胞标志性抗原CD11b和CD16的表达,且具有对表达绿色荧光蛋白的大肠埃希菌良好的吞噬能力。结论成功制备了小鼠BMDM,并优化了制备和鉴定的条件,为研究免疫细胞功能、病原微生物与巨噬细胞相互作用提供了理想的细胞模型制备方法。

源于C57BL/6小鼠的原代破骨细胞氯化钴模拟低氧模型的建立

【目的】探索C57BL/6小鼠骨髓来源的原代破骨细胞氯化钴诱导的低氧模型的建立方法。【方法】提取4~6周龄雄性C57BL/6小鼠股骨及胫骨骨髓细胞,通过流式细胞术鉴定单核巨噬细胞(bone marrow-derived mononuclear macrophages,BMMs)表面标记物;BMMs经巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核刺激因子-κB受体配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导4 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察BMMs向原代破骨细胞诱导分化情况;利用MTT法确定氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)模拟原代破骨细胞低氧浓度;运用Western blotting技术检测原代破骨细胞低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达量。【结果】BMMs簇分化抗原11b(cluster differentiation 11b,CD11b)呈强阳性,阳性率为97.90%;BMMs经过M-CSF和RANKL诱导后,产生了大量破骨细胞,TRAP染色为阳性;MTT和Western blotting技术确定原代破骨细胞CoCl2模拟低氧最相似浓度为50μmol/L。【结论】本研究成功地将BMMs诱导分化为破骨细胞,采用50μmol/L的CoCl2可建立该原代破骨细胞的低氧模型。