小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析

目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM。方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率。结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965。以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个。其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出。统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求。结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段。

碳-二氧化硅纳米复合颗粒促进小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的研究

目的研究碳-二氧化硅纳米复合颗粒(carbon-silica nanocomposite,CSN)对M2型小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)极化的影响。方法将介孔二氧化硅纳米复合颗粒(mesoporous silica nanoparticle,MSN)包覆葡萄糖,再经碳化制备得到CSN。利用红外光谱、能量色散X射线谱、透射电子显微镜和扫描电子显微镜对CSN进行表征;CCK-8实验检测CSN对小鼠BMDM的细胞活性的影响;将小鼠BMDM铺于6孔板,设置M0、M1、M2和M2+CSN组,用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测M1巨噬细胞中CD86、白介素6(interleukin-6,IL-6)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)及M2型巨噬细胞中CD206、精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的mRNA表达水平;Western blot检测iNOS和Arg1的蛋白表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞分子标志物CD80和CD206的表达情况。结果CSN由碳、氧和硅元素组成,元素比例分别为36.6%、35.5%和27.9%,呈均匀分散的球形纳米结构,直径分布为80~90nm。CSN在0、3.125、6.25、12.5、25、50μg/ml浓度下对小鼠BMDM的细胞活性影响无明显差异(P>0.05),与M0组比较,M1组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.01),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);M2组CD206和Arg1 mRNA表达水平均升高(P<0.001,P<0.01),Arg1蛋白表达升高(P<0.01),CD206表达升高(P<0.001)。与M2组比较,M2+CSN组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.001),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);CD206和Arg1 mRNA表达水平均降低(P<0.05,P<0.001),Arg1蛋白表达降低(P<0.05),CD206表达降低(P<0.05)。结论CSN能促进M2型巨噬细胞向M1型转化,调节肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)中M1/M2比例。

弱激光照射对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的调控作用

目的研究不同能量参数的810 nm弱激光照射对于巨噬细胞极化状态的影响。方法体外分离、培养BALB/c小鼠来源的骨髓巨噬细胞,应用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)条件性培养基培养的骨髓细胞,流式细胞术检测F4/80表达鉴定培养结果。脂多糖-γ干扰素(LPS-IFN-γ)刺激进行M1细胞极化诱导,反转录PCR检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、精氨酸酶1(Arg1)、CD86 mRNA水平,Western blot法检测i NOS和Arg1蛋白水平。应用(1、2、3、4)J/cm2的810 nm弱激光对体外培养的M1细胞进行照射,MTT法检测细胞增殖,免疫荧光细胞化学染色检测i NOS、Arg1的表达,反转录PCR检测M1细胞i NOS、Arg1 mRNA水平,Western blot法检测M1细胞i NOS、Arg1蛋白水平。结果流式细胞术结果证明分离细胞的F4/80阳性率达99.9%。骨髓源性巨噬细胞在LPS-IFN-γ刺激下,高表达i NOS和CD86 mRNA。Western blot法检测发现,给予极化刺激后,骨髓源性巨噬细胞高表达i NOS和CD86蛋白。不同能量的弱激光照射M1型巨噬细胞,MTT法检测发现,(1、2、3)J/cm2弱激光刺激时,M1细胞活力与对照组比较无显著性差异;4 J/cm2刺激时,M1细胞活力降低。免疫荧光细胞化学染色显示,与对照组比较,(1、2)J/cm2照射时,M2型巨噬细胞标志物Arg1阳性细胞数无明显差异,照射剂量为(3、4)J/cm2时,Arg1阳性细胞数显著增多,M1型巨噬细胞标志物i NOS阳性细胞数显著减少。与对照组比较,照射剂量为(1、2)J/cm2时,i NOS及Arg1 mRNA和蛋白表达水平无明显变化,在照射剂量为(3、4)J/cm2时,i NOS mRNA和蛋白水平表达下降,Arg1 mRNA和蛋白水平表达升高。结论 (1、2)J/cm2的810 nm弱激光对于M1型巨噬细胞活力及极化无影响。照射剂量为3 J/cm2时,M1型巨噬细胞可向M2型巨噬细胞极化,且细胞活性无明显变化。但照射能量为4 J/cm2时,M1型细胞虽然可向M2型细胞极化但同时伴有细胞活性降低。

脂多糖干预小鼠骨髓来源巨噬细胞的凋亡

背景:巨噬细胞是机体应对外界刺激的一道免疫防线,任何生物材料植入体内后的相关反应均与巨噬细胞介导的免疫反应有联系。目的:探讨脂多糖对小鼠骨髓来源巨噬细胞凋亡的影响。方法:体外分离培养C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞,分别加入含0(对照),10,100,1000μg/L脂多糖的DMEM完全培养基。培养24 h后,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst染色观察细胞形态,RT-PCR检测白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α及凋亡相关因子Bax、P53的mRNA表达。结果与结论:①各质量浓度脂多糖组的细胞凋亡率均高于对照组(P<0.05),其中100,1000μg/L脂多糖组细胞凋亡率高于10μg/L脂多糖组(P<0.05);②Hoechst染色显示,对照组细胞核正常,细胞发生凋亡时染色质浓缩;各质量浓度脂多糖组细胞发生不同程度凋亡,凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染,颜色稍有些发白,尤以1000μg/L最明显;③RT-PCR检测显示,各质量浓度脂多糖组细胞的白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Bax及P53 mRNA表达均高于对照组(P<0.01或P<0.001),且随着脂多糖质量浓度的升高,白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达呈先升高后降低的趋势,Bax、P53 mRNA表达呈升高趋势;④结果表明,脂多糖可诱导骨髓来源巨噬细胞的凋亡。

多发性骨髓瘤细胞通过PI3K/AKT信号通路促进M2巨噬细胞极化的机制研究

背景多发性骨髓瘤发病率长期居高不下,但目前关于磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)信号通路和M2巨噬细胞极化促进多发性骨髓瘤发生进展的研究较少。目的探讨M2巨噬细胞在多发性骨髓瘤患者中的表达及PI3K/AKT信号通路促进M2巨噬细胞极化的机制研究。方法选取2021年10月—2022年4月于桂林医学院附属医院血液内科确诊的多发性骨髓瘤患者48例为试验组,选取同期健康志愿者(血液内科骨髓移植健康供者)30名为对照组。取2组研究对象外周血并分离单个核细胞,流式细胞术检测M2巨噬细胞比例。采用细胞传代培养RPMI8226细胞,通过佛波酯分化培养单核巨噬细胞THP-1为巨噬细胞。根据实验需要将瘤细胞培养并采用siRNA转染沉默磷酸酶基因(PTEN)分成3组:空白组、siRNA-PTEN实验组、siRNA对照组;收集以上3组细胞培养基上清液加入巨噬细胞共培养体系后分为4组:M0巨噬细胞组、瘤细胞上清液组、siRNA-PTEN上清液组、siRNA上清液组。采用Western blot实验检测多发性骨髓瘤细胞培养的空白组、siRNA-PTEN实验组、siRNA对照组的AKT、p-AKT、PI3K-p85、p-PI3K-p85蛋白表达水平。采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测多发性骨髓瘤细胞培养的空白组、siRNA-PTEN实验组、siRNA对照组的基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9的mRNA表达水平。采用流式细胞术检测多发性骨髓瘤上清液共培养的M0巨噬细胞组、瘤细胞上清液组、siRNA-PTEN上清液组、siRNA上清液组M2巨噬细胞中特异性抗体CD163、CD206、F4/80表达水平。采用荧光定量PCR检测多发性骨髓瘤上清液共培养的M0巨噬细胞组、瘤细胞上清液组、siRNA-PTEN上清液组、siRNA上清液组M2巨噬细胞特异标志物精氨酸酶1(ARG-1)、白介素10(IL-10)的mRNA表达水平。结果试验组M2巨噬细胞表达水平高于对照组(t=0.855,P<0.001)。siRNA-PTEN实验组中p-AKT/AKT、p-PI3K-p85/PI3K-p85蛋白表达水平均高于空白组和siRNA对照组(P<0.05)。siRNA-PTEN实验组中MMP2、MMP9的mRNA表达水平均高于空白组和siRNA对照组(P<0.05)。siRNA-PTEN上清液组M2巨噬细胞特异性抗体CD163+F4/80、CD206+F4/80表达水平高于瘤细胞上清液组和siRNA上清液组(P<0.05)。siRNA-PTEN上清液组M2巨噬细胞特异标志物ARG-1、IL-10的mRNA表达水平高于瘤细胞上清液组和siRNA上清液组(P<0.05)。结论多发性骨髓瘤患者中M2巨噬细胞表达上调,多发性骨髓瘤细胞可通过激活PI3K/AKT信号通路促进M2巨噬细胞极化,调控骨髓瘤细胞微环境。

巨噬细胞示踪小鼠的构建及在PCOS研究中的应用

目的构建骨髓来源单核-巨噬细胞谱系示踪小鼠,并探究其在多囊卵巢综合征(PCOS)卵巢免疫机制研究中的应用。方法基于Cre/LoxP系统构建巨噬细胞荧光示踪小鼠模型,将Lyz2^(Cre)工具鼠与R26-CAG-LSL-tdTomato示踪小鼠交配,通过PCR鉴定,筛选得到Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox小鼠;收取各器官组织制作冰冻切片,通过激光共聚焦成像,检测Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox小鼠中巨噬细胞的示踪效果;并对示踪小鼠进行高脂喂养联合来曲唑灌胃,构建肥胖型PCOS模型。通过功能学及组织病理学方法评估PCOS模型构建是否成功;通过免疫荧光多重标记结合激光共聚焦成像检测Td-tomato示踪的巨噬细胞在生理性卵巢及PCOS卵巢中的分布及分型。结果在肝、肺、脾脏、卵巢及子宫等巨噬细胞丰富的组织中可见清晰的Td-tomato荧光信号与巨噬细胞分布相符;PCOS模型组卵巢呈多囊样改变,且小鼠体质量、卵巢湿重与血糖均升高(P均<0.05);免疫荧光多标检测结果显示,与对照组相比,PCOS组卵巢中骨髓来源巨噬细胞增多(P<0.05)并浸入囊状卵泡腔中,且M1型占比升高(P<0.05)。结论成功构建了巨噬细胞谱系示踪小鼠(Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox),PCOS小鼠卵巢骨髓来源巨噬细胞呈现M1型,可能是导致PCOS卵巢免疫微环境失衡的关键因素。

Lyz2+单核-巨噬细胞在多囊卵巢综合征小鼠子宫中的谱系示踪

目的在骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠上建立多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)模型,通过谱系示踪方法揭示巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中的分布特点。方法利用Cre/LoxP系统构建骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠,分别构建Td-tomato^(flox/flox)小鼠和Lyz2^(Cre)工具小鼠,使两者进行交配,得到Lyz2^(Cre)Tdtomato^(flox/flox)小鼠,其骨髓来源单核-巨噬细胞均被标记上红色荧光蛋白(Td-tomato),再通过来曲唑联合高脂饲料构建PCOS小鼠模型,通过免疫荧光多标结合激光共聚焦共定位方法检测PCOS小鼠子宫中巨噬细胞的分布及数量。结果成功构建了骨髓来源单核-巨噬细胞谱系示踪小鼠(Lyz2^(Cre)Td-tomato^(flox/flox)),并在谱系示踪小鼠上成功构建了PCOS小鼠模型。PCOS小鼠子宫的HE染色结果显示结构异常;免疫荧光多重标记检测发现,在PCOS小鼠子宫中巨噬细胞分布在子宫外膜、肌层、内膜,且M2型巨噬细胞数量增多(P<0.05)。结论本研究构建了肥胖型PCOS小鼠模型,发现骨髓来源的M2型巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中增多。

温肾通络止痛方抑制巨噬细胞衰老改善BMSC成骨分化和老年性骨质疏松模型小鼠骨丢失的研究

目的探讨温肾通络止痛方调控巨噬细胞衰老对老年性骨质疏松症(Senile osteoporosis,SOP)的干预作用。方法利用过氧化氢制备衰老巨噬细胞模型并随机分为对照组、模型组、含药血清低剂量组、含药血清高剂量组。β-半乳糖苷酶染色以及qPCR、Western blot检测衰老指标p21和p53的mRNA及蛋白表达水平,探讨含药血清对巨噬细胞衰老的影响。使用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)染色和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测巨噬细胞线粒体功能。qPCR检测巨噬细胞极化相关分子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、CD206、一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA水平,免疫荧光检测巨噬细胞极化相关分子精氨酸酶(Arginase,ARG1)和iNOS的蛋白表达,评估含药血清对巨噬细胞极化的影响。qPCR检测成骨相关指标骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen typeⅠα1,Col1a1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的mRNA水平以及ALP染色和茜素红染色,评估含药血清处理的巨噬细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)成骨分化的影响。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、温肾通络止痛方低剂量组、温肾通络止痛方高剂量组,D-半乳糖制备SOP小鼠模型。Micro-CT分析小鼠股骨微结构,HE染色检测小鼠股骨病理变化,Western blot检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53和成骨相关指标OCN、Runx2蛋白表达水平,qPCR检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53 mRNA和巨噬细胞极化相关分子IL-6、iNOS、CD206、IL-10 mRNA的表达水平,评估温肾通络止痛方对小鼠SOP模型的影响。结果与模型组相比,温肾通络止痛方含药血清干预后,衰老阳性细胞数量明显减少,p21和p53 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。此外,含药血清可显著抑制H_(2)O_(2)诱导的巨噬细胞ROS的产生(P<0.05,P<0.001)、线粒体膜电位下降(P<0.05)。含药血清处理后,巨噬细胞M1相关基因iNOS的mRNA表达下调(P<0.01),M2相关基因CD163和CD206 mRNA表达上调(P<0.05),iNOS荧光强度显著降低(P<0.01),ARG1的荧光强度显著增加(P<0.05)。含药血清处理的巨噬细胞条件培养基可增加ALP阳性细胞数(P<0.01,P<0.001)、茜素红阳性面积(P<0.05),以及升高成骨相关基因Runx2、Col1a1和OCN mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。Micro-CT结果显示,与模型组相比,温肾通络止痛方组小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001),Tb.Sp显著降低(P<0.05,P<0.01);HE结果显示,骨小梁明显改善,数量增多变宽。此外,温肾通络止痛方可显著抑制D-半乳糖诱导的小鼠胫骨衰老相关基因p21和p53 mRNA和蛋白上调(P<0.05,P<0.001,P<0.0001),促进成骨相关指标OCN、Runx2蛋白表达(P<0.01,P<0.0001),促进M1相关基因IL-6和iNOS下调(P<0.05),同时可促进M2相关基因IL-10和CD206表达(P<0.05,P<0.01)。结论温肾通络止痛方可能通过抑制巨噬细胞衰老,促进BMSC成骨分化,从而发挥抗骨质疏松效应。

绞股蓝多糖提高小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能

研究不同浓度(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μg/mL)绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino]多糖(GPP)对小鼠腹腔巨噬细胞的影响,探讨GPP对机体免疫功能的调节作用及其可能的作用机制。采用中性红法、Griess法、CCK8法、ELISA法和荧光定量PCR法检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、增殖、细胞因子(NO、LDH、TNF-α、IL-1β)的分泌量、CaM和GSα基因的表达水平。结果表明,GPP激活小鼠腹腔巨噬细胞,随着GPP浓度的增加小鼠腹腔巨噬细胞增殖能力增强,当GPP浓度为50.0、100.0、200.0μg/mL时,吸光度与空白对照处理相比差异显著;GPP刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,吞噬能力强于空白对照处理,GPP浓度为200.0μg/mL时,小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力最强;GPP促进小鼠腹腔巨噬细胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌;GPP上调CaM和GSα基因的表达,GPP浓度为100.0、25.0μg/mL时CaM、GSα基因表达量分别达到最高。

辣椒来源外泌体样纳米囊泡通过ERK1/2通路拮抗巨噬细胞向泡沫细胞转化

[目的]研究辣椒来源外泌体样纳米囊泡(CDELN)抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫化的作用机制。[方法]通过组织破碎、差速/超速离心及蔗糖密度梯度离心等步骤,分离提纯CDELN。利用ox-LDL刺激THP-1源性巨噬细胞24 h建立泡沫细胞模型,并进一步研究CDELN对巨噬细胞泡沫化的作用及其机制。采用激光共聚焦显微镜检测THP-1源性巨噬细胞对CDELN和人DiL标记乙酰化低密度脂蛋白(DiL-ac-LDL)的摄取;采用油红O染色检测细胞内胆固醇含量,通过分析细胞油红O染色阳性面积评估细胞内脂质累积影响;RT-qPCR和Western blot检测清道夫受体A(SRA)、脂肪酸转运蛋白(CD36)、凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、ATP结合盒转运体A1/G1(ABCA1/G1)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路p-ERK、p-p38 MAPK和p-c-Jun的mRNA和蛋白表达水平。[结果]CDELN是大小均一、具有双层膜结构、富含蛋白质和核酸的外泌体样纳米囊泡,能被巨噬细胞摄取。DiL-ac-LDL摄取实验提示CDELN可抑制巨噬细胞的胆固醇摄取。油红O染色实验提示CDELN可减轻ox-LDL诱导下的胞内胆固醇蓄积。RT-qPCR及Western blot显示,CDELN能够显著降低ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)、SRA、CD36、LOX-1的mRNA水平,以及降低p-ERK、SRA、CD36、LOX-1蛋白水平。加入p-ERK激动剂Yoda1后,CDELN的保护作用被明显逆转。[结论]CDELN可显著抑制巨噬细胞泡沫化,该作用可能与抑制MAPK通路ERK1/2的磷酸化水平有关。

模拟失重后骨髓来源巨噬细胞转录组高通量测序及分析

目的探索模拟失重对小鼠骨髓来源巨噬细胞基因表达的影响。方法采用尾悬吊法构建模拟失重小鼠模型,对照组不做尾吊处理。模拟失重28 d后提取小鼠骨髓来源巨噬细胞并将其分别诱导为M0型和M1型巨噬细胞。随后,提取细胞总RNA进行转录组测序及分析,并通过实时定量RT-PCR验证重要基因的差异表达。结果转录组测序结果显示,模拟失重组与对照组之间的M0型巨噬细胞共有807个基因差异表达;模拟失重组与对照组之间的M1型巨噬细胞共有898个基因差异表达。GO分析表明,M0型巨噬细胞差异表达基因主要集中于免疫应答、趋化等生物学过程中;M1型巨噬细胞差异基因主要富集于炎症反应、细胞迁移的正调控和单核细胞趋化等生物学过程中。KEGG通路分析发现M0型巨噬细胞的差异基因主要涉及趋化因子、细胞因子-细胞因子受体相互作用等信号通路;M1型巨噬细胞的差异基因主要涉及造血细胞谱系、流体剪切应力等信号通路。进一步分析发现,尾吊组与对照组在M0或M1型巨噬细胞中的差异基因均在细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路中富集,其中尾吊组的M0与M1型巨噬细胞中调节单核细胞/巨噬细胞迁移和浸润的关键趋化因子Ccl2均显著高表达,并进一步通过RT-PCR实验得到验证。结论模拟失重可显著影响小鼠巨噬细胞中以Ccl2为代表的与炎症发生和加重密切相关的基因表达水平,这些改变的基因富集于多个生物学过程,可能对巨噬细胞的黏附、迁移等功能产生影响。

L929细胞上清诱导小鼠骨髓巨噬细胞脓毒症耐受模型的建立与鉴定

目的采用L929细胞培养上清分化小鼠骨髓巨噬细胞(BMDMs)建立脓毒症脂多糖(LPS)耐受模型。方法收集L929细胞培养上清,诱导BMDMs分化成熟后,使用显微镜观察BMDMs形态,流式细胞仪鉴定BMDMs纯度及成熟度。采用5 ng/ml LPS预处理分化成熟的BMDMs 4 h后,使用100 ng/ml LPS再处理6 h以建立脓毒症LPS耐受模型。采用ELISA法检测BMDMs耐受模型细胞上清中IL-6及TNF-α释放水平;利用q RT-PCR和Western blot方法检测BMDMs耐受模型细胞中IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88和NF-κB p65 m RNA和蛋白表达。结果研究结果表明L929上清中M-CSF因子在第6天释放水平最高;L929上清诱导BMDMs 6 d后细胞分化成熟呈梭形,加入M-CSF阻断剂后细胞未分化;使用F4/80标记分化成熟的BMDMs,阳性率为96.9%;LPS能够剂量及时间依赖性增加分化成熟的BMDMs中IL-6及TNF-α释放水平;在BMDMs、小鼠腹腔巨噬细胞(PMs)、RAW264.7细胞LPS耐受模型中,其耐受组的IL-6及TNF-α释放水平均有不同程度的降低;qRT-PCR及Western blot实验结果均表明在耐受组中IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB表达水平显著下调。结论本研究利用L929上清成功诱导BMDMs分化,并建立LPS耐受模型,且LPS诱导BMDMs建立的耐受模型是长期实验的最佳模型,此研究为脓毒症免疫抑制作用及机制提供了理想的细胞模型。

微小RNA-155在小鼠骨髓来源M1和M2巨噬细胞中表达的差异

背景:目前对微小RNA-155在巨噬细胞中的表达和功能的研究还集中在总体单核巨噬细胞水平。目的:了解小鼠骨髓来源M1和M2巨噬细胞中微小RNA-155表达的差异。方法:用100U/mL干扰素γ和5μg/L脂多糖诱导骨髓细胞来源的巨噬细胞向M1分化,用10μg/L白细胞介素4诱导出M2巨噬细胞。结果与结论:流式细胞检测显示实验诱导的M1和M2巨噬细胞纯度分别达91%和95%。RT-PCR检测显示诱导型一氧化氮合酶mRNA在M1巨噬细胞中高表达,在M2中则基本不表达;而Ⅰ型精氨酸酶、发现于炎症区域1mRNA在M2中高表达,在M1中则表达较低;炎症因子肿瘤坏死因子αmRNA在M1中的表达明显高于M2,相反白细胞介素10mRNA在M2中的表达高于M1(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测显示M1巨噬细胞中微小RNA-155的表达量明显高于M2(P<0.05)。提示微小RNA-155可作为鉴别M1,M2巨噬细胞的标志。

刺槐素对小鼠骨髓巨噬细胞AIM2炎症小体活化的抑制作用

目的 探讨刺槐素对脂多糖(LPS)和双链DNA模拟物poly(dA:dT)共诱导的小鼠骨髓巨噬细胞(BMDMs)黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)炎症小体活化的影响。方法 在小鼠股骨中分离并培养BMDMs,将其分为对照组、LPS组、LPS+poly(dA:dT)组和LPS+poly(dA:dT)+刺槐素组。对照组将BMDMs继续在完全培养基中培养3 h;LPS组将BMDMs在加入含50 ng/mL LPS的完全培养基中培养3 h;LPS组+poly(dA:dT)组将BMDMs在加入含50 ng/mL LPS的完全培养基中培养3 h,再加入poly(dA:dT) 10μmol/L作用0.5 h;LPS+poly(dA:dT)+刺槐素组将BMDMs在加入含50 ng/mL LPS的完全培养基中培养3 h,然后加入刺槐素10μmol/L作用0.5 h,最后加入poly(dA:dT) 10μmol/L作用0.5 h。采用Western blotting法检测细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-白细胞介素(IL)-1β和上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量,ELISA法检测细胞上清液IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白表达,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞上清液LDH浓度。结果 各组细胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与对照组、LPS组比较,LPS+poly(dA:dT)组和LPS+poly(dA:dT)+刺槐素组上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量均升高,且LPS+poly(dA:dT)组升高更明显(P均<0.05)。与对照组、LPS组比较,LPS+poly(dA:dT)组和LPS+poly(dA:dT)+刺槐素组细胞上清液IL-1β、IL-18蛋白表达均升高,且LPS+poly(dA:dT)组IL-1β升高更明显(P均<0.05)。与对照组比较,LPS组、LPS+poly(dA:dT)组和LPS+poly(dA:dT)+刺槐素组细胞上清液TNF-α蛋白表达及LDH水平均升高,且LPS+poly(dA:dT)组和LPS+poly(dA:dT)+刺槐素组升高更明显(P均<0.05)。结论 刺槐素对小鼠BMDMs的AIM2炎症小体活化具有抑制作用,能够减少细胞中Caspase-1、IL-1β蛋白表达,从而减轻炎症反应。

类胰蛋白酶通过PAR2激活JAK-STAT通路促进小鼠骨髓来源的巨噬细胞向M1表型转换

目的研究类胰蛋白酶促进小鼠巨噬细胞表型转换的作用及其机制。方法体外分离培养小鼠巨噬细胞(对照组),并诱导为M1和M2亚型,经类胰蛋白酶和PAR2激动剂分别作用后,通过real-time PCR和Western blot检测巨噬细胞亚型标志物以及JAK-STAT信号通路的变化。结果成功分离培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞,并诱导其分化为M1和M2亚型。PAR2激动剂(2-Furoyl-LIGRLO-amide)和类胰蛋白酶分别与M1型巨噬细胞分别作用后,M1型标记物iNOS和IL-12高于对照组,而M2型标记物arg1和mrc1与对照相比无明显变化,提示类胰蛋白酶和PAR2激动剂可以促进巨噬细胞向M1型转化,而不会促进M1型向M2型转化。PAR2激动剂和类胰蛋白酶分别与M2型巨噬细胞作用后,M2型标记物arg1和mrc1明显下降,而M1型标记物iNOS和iL-12有所增加,提示类胰蛋白酶和PAR-2激动剂均可促进M2型向M1型转化。类胰蛋白酶作用于M1型巨噬细胞后,JAK2磷酸化水平、STAT和p-STAT的表达水平均无明显变化。类胰蛋白酶作用于M2型巨噬细胞后,JAK2的磷酸化随着时间延长明显升高,STAT的磷酸化水平同时升高,提示类胰蛋白酶可以通过和PAR-2结合而激活JAK2-STAT信号通路,进而引起M2型向M1型转化。结论类胰蛋白酶可能通过与其受体PAR2相互作用后激活JAK-STAT通路,促进小鼠骨髓来源的巨噬细胞向M1亚型转化,起到促进炎症发展的作用,从而进一步加重动脉粥样硬化的发展。

小鼠骨髓来源巨噬细胞培养模型的建立及鉴定

目的建立小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)培养模型,并对BMDM进行细胞表面标志物及吞噬能力鉴定。方法采用32℃培养10 d和37℃培养3 d的方式培养L929细胞,检测细胞上清中巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的浓度。获取小鼠骨髓细胞后,分别以M-CSF和两种条件培养的L929细胞上清进行诱导分化,通过光学显微镜对诱导分化后的BMDM进行形态学观察;流式细胞术检测CD11b阳性细胞株所占百分比,免疫荧光法观察诱导后巨噬细胞表面标志抗原CD11b和CD16的表达;对表达绿色荧光蛋白的大肠埃希菌进行吞噬试验鉴定BMDM的吞噬功能。结果32℃培养10 d的L929细胞上清中M-CSF的浓度显著高于37℃培养3 d(P<0.05)。3种诱导方式均可使小鼠骨髓源细胞分化成熟,经32℃培养10 d的L929细胞上清诱导分化后的BMDM生长状态最佳。流式细胞术检测显示巨噬细胞表面标志抗原CD11b阳性率为80.62%,免疫荧光检测显示诱导分化后的BMDM细胞表面有巨噬细胞标志性抗原CD11b和CD16的表达,且具有对表达绿色荧光蛋白的大肠埃希菌良好的吞噬能力。结论成功制备了小鼠BMDM,并优化了制备和鉴定的条件,为研究免疫细胞功能、病原微生物与巨噬细胞相互作用提供了理想的细胞模型制备方法。

RNF20影响RNA病毒感染后的巨噬细胞极化

目的 探究环指蛋白20(RNF20)在抗RNA病毒先天免疫中的作用。方法 在293T人胚肾上皮细胞中过表达RNF20,运用双荧光素酶报告基因实验,检测仙台病毒(SeV)感染诱导的干扰素a4(Ifna4)基因启动子活化。构建Rnf20基因髓系条件性敲除小鼠模型(Rnf20F/F;Lyz2-Cre),运用流式细胞术检测Rnf20F/F;Lyz2-Cre和对照Rnf20F/F小鼠骨髓、脾脏和外周血髓系细胞亚群的比例;利用建立的小鼠模型培养骨髓源巨噬细胞(BMDMs),在SeV和水疱性口炎病毒(VSV)感染后,运用免疫印迹检测转录因子干扰素调节因子3(IRF3)和核因子-κB (NF-κB)p65亚基的磷酸化,通过ELISA检测细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-6的表达,通过高通量转录组测序分析转录组的改变,并通过LPS和IL-4分别诱导巨噬细胞M1和M2极化,证实RNF20对于转录组的影响。结果 293T细胞中RNF20过表达不影响SeV感染诱导的Ifna4基因启动子活化。Rnf20F/F;Lyz2-Cre和Rnf20F/F小鼠髓系细胞发育无明显差异,在RNA病毒感染2组小鼠的BMDMs后,IRF3、NF-κB p65的磷酸化和IFN-β、TNF-α、IL-6的表达相似,但是一些与巨噬细胞极化相关的基因表达有显著差异。RNF20的缺失有抑制巨噬细胞M1型极化、促进巨噬细胞M2型极化的趋势。结论RNF20不影响RNA病毒感染诱导的IRF3和NF-κB通路活化,但可通过影响巨噬细胞极化而参与感染后炎症的消退。

基于差异接种细胞数的高效骨髓来源巨噬细胞分离方法的建立与评价

目的探索不同铺板细胞数接种骨髓细胞对分离小鼠骨髓来源巨噬细胞得率的影响.方法依据文献中给定的常用细胞铺板范围,将分离的小鼠骨髓细胞按六种不同细胞数接种在细胞培养皿中,使用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞后,利用细胞计数法比较各组间贴壁细胞的比例差异,采用流式细胞术、间接免疫荧光法检测巨噬细胞的标志物F4/80,根据F4/80来判断巨噬细胞分化的阳性率,并最终比较各组之间骨髓来源巨噬细胞的得率.结果在6.7×10^(5)个/cm^(2)~14.7×10^(5)个/cm^(2)细胞数范围内,按照6.7×10^(5)个/cm^(2)细胞数进行铺板,能够获得最高的贴壁细胞比例且贴壁细胞中F4/80^(+)巨噬细胞得率最高,在获得相同数量巨噬细胞的前提下,该细胞数能够节省40%~53%制备巨噬细胞所需要的模型小鼠.结论按照6.7×10^(5)个/cm^(2)的铺板细胞数进行骨髓细胞铺板,骨髓来源巨噬细胞的得率最高.

左、右归丸对去卵巢大鼠骨髓单核/巨噬细胞破骨分化的影响

目的基于AMPK/mTOR信号通路研究左、右归丸对去卵巢大鼠骨髓单核/巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMMs)破骨分化的作用及机制。方法将60只雌性大鼠随机分为6组,分别为空白组(KB)、假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、补佳乐组(BJL)、右归丸组(YGW)和左归丸组(ZGW)。KB组不做处置,SHAM组模拟卵巢切除手术过程,后4组均将双侧卵巢切除。各组分别灌胃蒸馏水(SHAM、OVX)、补佳乐(BJL)、右归丸(YGW)和左归丸(ZGW)。12周后取大鼠股骨和胫骨骨髓,用差时贴壁法获得大鼠BMMs并进行破骨分化诱导。用抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测试剂盒检测TRAP活性;qrt-PCR法检测TRAP基因的表达;Western blotting法检测TRAP、RANKL、AMPKɑ、p-AMPKɑ、mTORC1、p-mTORC1蛋白的表达。结果左、右归丸能显著降低去卵巢大鼠BMMs破骨诱导后TRAP活性,降低TRAP基因和蛋白的表达,降低与RANK结合的RANKL蛋白的表达。与KB组比较,OVX组AMPKɑ蛋白磷酸化水平降低,mTORC1蛋白磷酸化水平升高;3个用药组皆能对抗上述改变,其中左归丸优于右归丸。结论左、右归丸均能通过AMPK/mTOR信号通路抑制去卵巢大鼠BMMs的破骨分化。

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞的生物学性状,用聚合酶链反应(PCR)检测目的基因的整合,用RT-PCR鉴定目的基因的表达,并对永生化和非永生化骨髓来源巨噬细胞的生长状况进行比较。结果:构建的骨髓来源巨噬细胞系已扩大培养并稳定传代,经鉴定,SV40LT抗原已整合入细胞并稳定表达。结论:通过慢病毒感染细胞的方法成功构建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系。