巨噬细胞示踪小鼠的构建及在PCOS研究中的应用

目的构建骨髓来源单核-巨噬细胞谱系示踪小鼠,并探究其在多囊卵巢综合征(PCOS)卵巢免疫机制研究中的应用。方法基于Cre/LoxP系统构建巨噬细胞荧光示踪小鼠模型,将Lyz2^(Cre)工具鼠与R26-CAG-LSL-tdTomato示踪小鼠交配,通过PCR鉴定,筛选得到Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox小鼠;收取各器官组织制作冰冻切片,通过激光共聚焦成像,检测Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox小鼠中巨噬细胞的示踪效果;并对示踪小鼠进行高脂喂养联合来曲唑灌胃,构建肥胖型PCOS模型。通过功能学及组织病理学方法评估PCOS模型构建是否成功;通过免疫荧光多重标记结合激光共聚焦成像检测Td-tomato示踪的巨噬细胞在生理性卵巢及PCOS卵巢中的分布及分型。结果在肝、肺、脾脏、卵巢及子宫等巨噬细胞丰富的组织中可见清晰的Td-tomato荧光信号与巨噬细胞分布相符;PCOS模型组卵巢呈多囊样改变,且小鼠体质量、卵巢湿重与血糖均升高(P均<0.05);免疫荧光多标检测结果显示,与对照组相比,PCOS组卵巢中骨髓来源巨噬细胞增多(P<0.05)并浸入囊状卵泡腔中,且M1型占比升高(P<0.05)。结论成功构建了巨噬细胞谱系示踪小鼠(Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox),PCOS小鼠卵巢骨髓来源巨噬细胞呈现M1型,可能是导致PCOS卵巢免疫微环境失衡的关键因素。

Lyz2+单核-巨噬细胞在多囊卵巢综合征小鼠子宫中的谱系示踪

目的在骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠上建立多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)模型,通过谱系示踪方法揭示巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中的分布特点。方法利用Cre/LoxP系统构建骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠,分别构建Td-tomato^(flox/flox)小鼠和Lyz2^(Cre)工具小鼠,使两者进行交配,得到Lyz2^(Cre)Tdtomato^(flox/flox)小鼠,其骨髓来源单核-巨噬细胞均被标记上红色荧光蛋白(Td-tomato),再通过来曲唑联合高脂饲料构建PCOS小鼠模型,通过免疫荧光多标结合激光共聚焦共定位方法检测PCOS小鼠子宫中巨噬细胞的分布及数量。结果成功构建了骨髓来源单核-巨噬细胞谱系示踪小鼠(Lyz2^(Cre)Td-tomato^(flox/flox)),并在谱系示踪小鼠上成功构建了PCOS小鼠模型。PCOS小鼠子宫的HE染色结果显示结构异常;免疫荧光多重标记检测发现,在PCOS小鼠子宫中巨噬细胞分布在子宫外膜、肌层、内膜,且M2型巨噬细胞数量增多(P<0.05)。结论本研究构建了肥胖型PCOS小鼠模型,发现骨髓来源的M2型巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中增多。

模拟失重后骨髓来源巨噬细胞转录组高通量测序及分析

目的探索模拟失重对小鼠骨髓来源巨噬细胞基因表达的影响。方法采用尾悬吊法构建模拟失重小鼠模型,对照组不做尾吊处理。模拟失重28 d后提取小鼠骨髓来源巨噬细胞并将其分别诱导为M0型和M1型巨噬细胞。随后,提取细胞总RNA进行转录组测序及分析,并通过实时定量RT-PCR验证重要基因的差异表达。结果转录组测序结果显示,模拟失重组与对照组之间的M0型巨噬细胞共有807个基因差异表达;模拟失重组与对照组之间的M1型巨噬细胞共有898个基因差异表达。GO分析表明,M0型巨噬细胞差异表达基因主要集中于免疫应答、趋化等生物学过程中;M1型巨噬细胞差异基因主要富集于炎症反应、细胞迁移的正调控和单核细胞趋化等生物学过程中。KEGG通路分析发现M0型巨噬细胞的差异基因主要涉及趋化因子、细胞因子-细胞因子受体相互作用等信号通路;M1型巨噬细胞的差异基因主要涉及造血细胞谱系、流体剪切应力等信号通路。进一步分析发现,尾吊组与对照组在M0或M1型巨噬细胞中的差异基因均在细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路中富集,其中尾吊组的M0与M1型巨噬细胞中调节单核细胞/巨噬细胞迁移和浸润的关键趋化因子Ccl2均显著高表达,并进一步通过RT-PCR实验得到验证。结论模拟失重可显著影响小鼠巨噬细胞中以Ccl2为代表的与炎症发生和加重密切相关的基因表达水平,这些改变的基因富集于多个生物学过程,可能对巨噬细胞的黏附、迁移等功能产生影响。

小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析

目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM。方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率。结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965。以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个。其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出。统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求。结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段。

微小RNA-155在小鼠骨髓来源M1和M2巨噬细胞中表达的差异

背景:目前对微小RNA-155在巨噬细胞中的表达和功能的研究还集中在总体单核巨噬细胞水平。目的:了解小鼠骨髓来源M1和M2巨噬细胞中微小RNA-155表达的差异。方法:用100U/mL干扰素γ和5μg/L脂多糖诱导骨髓细胞来源的巨噬细胞向M1分化,用10μg/L白细胞介素4诱导出M2巨噬细胞。结果与结论:流式细胞检测显示实验诱导的M1和M2巨噬细胞纯度分别达91%和95%。RT-PCR检测显示诱导型一氧化氮合酶mRNA在M1巨噬细胞中高表达,在M2中则基本不表达;而Ⅰ型精氨酸酶、发现于炎症区域1mRNA在M2中高表达,在M1中则表达较低;炎症因子肿瘤坏死因子αmRNA在M1中的表达明显高于M2,相反白细胞介素10mRNA在M2中的表达高于M1(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测显示M1巨噬细胞中微小RNA-155的表达量明显高于M2(P<0.05)。提示微小RNA-155可作为鉴别M1,M2巨噬细胞的标志。

基于差异接种细胞数的高效骨髓来源巨噬细胞分离方法的建立与评价

目的探索不同铺板细胞数接种骨髓细胞对分离小鼠骨髓来源巨噬细胞得率的影响.方法依据文献中给定的常用细胞铺板范围,将分离的小鼠骨髓细胞按六种不同细胞数接种在细胞培养皿中,使用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞后,利用细胞计数法比较各组间贴壁细胞的比例差异,采用流式细胞术、间接免疫荧光法检测巨噬细胞的标志物F4/80,根据F4/80来判断巨噬细胞分化的阳性率,并最终比较各组之间骨髓来源巨噬细胞的得率.结果在6.7×10^(5)个/cm^(2)~14.7×10^(5)个/cm^(2)细胞数范围内,按照6.7×10^(5)个/cm^(2)细胞数进行铺板,能够获得最高的贴壁细胞比例且贴壁细胞中F4/80^(+)巨噬细胞得率最高,在获得相同数量巨噬细胞的前提下,该细胞数能够节省40%~53%制备巨噬细胞所需要的模型小鼠.结论按照6.7×10^(5)个/cm^(2)的铺板细胞数进行骨髓细胞铺板,骨髓来源巨噬细胞的得率最高.

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞的生物学性状,用聚合酶链反应(PCR)检测目的基因的整合,用RT-PCR鉴定目的基因的表达,并对永生化和非永生化骨髓来源巨噬细胞的生长状况进行比较。结果:构建的骨髓来源巨噬细胞系已扩大培养并稳定传代,经鉴定,SV40LT抗原已整合入细胞并稳定表达。结论:通过慢病毒感染细胞的方法成功构建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系。

弱激光照射对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的调控作用

目的研究不同能量参数的810 nm弱激光照射对于巨噬细胞极化状态的影响。方法体外分离、培养BALB/c小鼠来源的骨髓巨噬细胞,应用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)条件性培养基培养的骨髓细胞,流式细胞术检测F4/80表达鉴定培养结果。脂多糖-γ干扰素(LPS-IFN-γ)刺激进行M1细胞极化诱导,反转录PCR检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、精氨酸酶1(Arg1)、CD86 mRNA水平,Western blot法检测i NOS和Arg1蛋白水平。应用(1、2、3、4)J/cm2的810 nm弱激光对体外培养的M1细胞进行照射,MTT法检测细胞增殖,免疫荧光细胞化学染色检测i NOS、Arg1的表达,反转录PCR检测M1细胞i NOS、Arg1 mRNA水平,Western blot法检测M1细胞i NOS、Arg1蛋白水平。结果流式细胞术结果证明分离细胞的F4/80阳性率达99.9%。骨髓源性巨噬细胞在LPS-IFN-γ刺激下,高表达i NOS和CD86 mRNA。Western blot法检测发现,给予极化刺激后,骨髓源性巨噬细胞高表达i NOS和CD86蛋白。不同能量的弱激光照射M1型巨噬细胞,MTT法检测发现,(1、2、3)J/cm2弱激光刺激时,M1细胞活力与对照组比较无显著性差异;4 J/cm2刺激时,M1细胞活力降低。免疫荧光细胞化学染色显示,与对照组比较,(1、2)J/cm2照射时,M2型巨噬细胞标志物Arg1阳性细胞数无明显差异,照射剂量为(3、4)J/cm2时,Arg1阳性细胞数显著增多,M1型巨噬细胞标志物i NOS阳性细胞数显著减少。与对照组比较,照射剂量为(1、2)J/cm2时,i NOS及Arg1 mRNA和蛋白表达水平无明显变化,在照射剂量为(3、4)J/cm2时,i NOS mRNA和蛋白水平表达下降,Arg1 mRNA和蛋白水平表达升高。结论 (1、2)J/cm2的810 nm弱激光对于M1型巨噬细胞活力及极化无影响。照射剂量为3 J/cm2时,M1型巨噬细胞可向M2型巨噬细胞极化,且细胞活性无明显变化。但照射能量为4 J/cm2时,M1型细胞虽然可向M2型细胞极化但同时伴有细胞活性降低。

丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌诱导骨髓来源巨噬细胞功能的影响

目的观察丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌作用下对体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)炎性因子分泌及向破骨细胞分化能力的影响,并探讨其作用机制。方法体外分离获得小鼠生长良好的BMM,加入不同浓度丹皮酚溶液处理1 h,再加入牙龈卟啉单胞菌进行24 h诱导刺激。采用流式细胞术检测炎症相关蛋白程序性死亡分子配体1(PD-L1)的表达量,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6)水平;在核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激后的BMM中加入不同浓度的丹皮酚溶液处理1 h后,加入牙龈卟啉单胞菌刺激,采用抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞形成情况,Western blot检测破骨细胞形成相关蛋白TRAP和核因子κB受体活化因子(RANK)的表达。结果丹皮酚在10~50μmol·L-1的范围内,对BMM无毒性作用。流式细胞术结果提示丹皮酚可以抑制牙龈卟啉单胞菌诱导PD-L1的表达,并存在剂量依赖效应。ELISA实验证明丹皮酚能以剂量依赖性方式抑制BMM释放TNF-α、IL-1β及IL-6(P<0.01)。牙龈卟啉单胞菌可以明显诱导BMM分化形成破骨细胞;TRAP染色显示丹皮酚各浓度组能抑制BMM向破骨细胞分化;Western blot结果显示丹皮酚抑制TRAP和RANK表达且存在剂量依赖效应。结论丹皮酚可以剂量依赖方式抑制牙龈卟啉单胞菌诱导的BMM炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌及其向破骨细胞分化的能力。

巨噬细胞对小鼠骨髓肥大细胞增殖的调节作用

本文应用体外细胞共培养和免疫细胞化学技术观察小鼠腹腔巨噬细胞对小鼠骨髓来源的肥大细胞生长增殖的影响。结果表明小鼠腹腔巨噬细胞对肥大细胞的生长增殖具有一定的促进作用，不仅表现在肥大细胞数量的增加，而且也能促使肥大细胞进入Ｓ期的比例增加（二者数值均为对照值的２－３倍），还发现上述促增殖作用与巨噬细胞和肥大细胞的浓度有关。文中提出了巨噬细胞促使肥大细胞增殖的最适浓度范围以及两种细胞浓度比值的最佳范围，并就细胞浓度对细胞生长的影响进行了初步探讨。

AMPK信号通路在调节小鼠骨髓巨噬细胞抗菌性自噬效应中的作用

目的观察AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)对小鼠骨髓巨噬细胞自噬及杀菌活性的调节作用,并探讨其可能机制。方法分离和体外培养小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDM),观察大肠埃希菌刺激后对BMDM细胞自噬水平及AMPK活化状态的影响。使用AMPK激动剂和抑制剂干预其活化,进一步观察大肠埃希菌感染的BMDM细胞中AMPK活化、自噬水平以及杀菌能力的变化。结果大肠埃希菌感染后的小鼠BMDM细胞自噬相关分子LC3B和Beclin1的表达显著升高,同时LC3Ⅱ/Ⅰ比值也明显升高,且其AMPK的磷酸化水平也随之显著上调。AMPK活性增强后,能够进一步上调BMDM细胞的自噬水平以及对细菌的降解清除。而AMPK活性被抑制后,细胞自噬水平和杀菌活性均显著下降。结论 AMPK分子及其相关信号通路可能在调节巨噬细胞自噬水平以及抗菌效应方面发挥重要作用。

重组Klotho蛋白对骨髓来源M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转变的影响

目的:探究重组Klotho蛋白对小鼠骨髓来源M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞表型转变的影响。方法:分离并鉴定小鼠骨髓来源性巨噬细胞,用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)转变为巨噬细胞M0,流式细胞术和细胞免疫荧光鉴定细胞,普通光镜观察M0细胞形态。将成熟骨髓来源巨噬细胞细胞M0分成LPS组、LPS+Klotho组和空白组。LPS组用100 ng/mL LPS处理,LPS+Klotho组给与1μg/mL Klotho和100 ng/mL LPS+LPS共同处理。RT-qPCR检测巨噬细胞极化相关分子:M1亚型巨噬细胞相关标志物(IL-1β、IL-6、iNOS)mRNA和M2亚型巨噬细胞相关标记物(Arg-1、IL-10)mRNA表达。Western blotting检测iNOS、Arg-1蛋白表达水平,细胞免疫荧光检测细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)和Arg-1蛋白含量。结果:流式细胞术显示骨髓巨噬细胞纯度为98.4%,光镜和细胞免疫荧光显示骨髓巨噬细胞呈现不规则形态。与空白组相比,LPS组IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA和iNOS、TNF-α蛋白相对表达量明显提高(P<0.001)。而与LPS组相比,LPS+Klotho组降低M1亚型巨噬细胞标记物IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA和iNOS、TNF-α蛋白相对表达量(P<0.001),显著提高了M2型巨噬细胞标志物Arg-1、IL-10 mRNA和Arg-1的蛋白的表达(P<0.001)。结论:重组Klotho蛋白可促进骨髓来源性巨噬细胞由M1表型向M2表型转变。

碳-二氧化硅纳米复合颗粒促进小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的研究

目的研究碳-二氧化硅纳米复合颗粒(carbon-silica nanocomposite,CSN)对M2型小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)极化的影响。方法将介孔二氧化硅纳米复合颗粒(mesoporous silica nanoparticle,MSN)包覆葡萄糖,再经碳化制备得到CSN。利用红外光谱、能量色散X射线谱、透射电子显微镜和扫描电子显微镜对CSN进行表征;CCK-8实验检测CSN对小鼠BMDM的细胞活性的影响;将小鼠BMDM铺于6孔板,设置M0、M1、M2和M2+CSN组,用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测M1巨噬细胞中CD86、白介素6(interleukin-6,IL-6)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)及M2型巨噬细胞中CD206、精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的mRNA表达水平;Western blot检测iNOS和Arg1的蛋白表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞分子标志物CD80和CD206的表达情况。结果CSN由碳、氧和硅元素组成,元素比例分别为36.6%、35.5%和27.9%,呈均匀分散的球形纳米结构,直径分布为80~90nm。CSN在0、3.125、6.25、12.5、25、50μg/ml浓度下对小鼠BMDM的细胞活性影响无明显差异(P>0.05),与M0组比较,M1组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.01),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);M2组CD206和Arg1 mRNA表达水平均升高(P<0.001,P<0.01),Arg1蛋白表达升高(P<0.01),CD206表达升高(P<0.001)。与M2组比较,M2+CSN组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.001),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);CD206和Arg1 mRNA表达水平均降低(P<0.05,P<0.001),Arg1蛋白表达降低(P<0.05),CD206表达降低(P<0.05)。结论CSN能促进M2型巨噬细胞向M1型转化,调节肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)中M1/M2比例。

胱天蛋白酶1(caspase-1)抑制剂AC-YVAD-CMK抑制鲍曼不动杆菌诱导骨髓来源巨噬细胞IL-1β的分泌

目的探讨胱天蛋白酶1(caspase-1)特异性抑制剂AC-YVAD-CMK对鲍曼不动杆菌(A.baumannii)刺激骨髓来源巨噬细胞(BMDM)分泌白细胞介素1β(IL-1β)的影响。方法从C57BL/6小鼠分离培养BMDM,使用(1×103、1×105、1×107)菌落形成单位(CFU)/mL的A.baumannii刺激BMDM,ELISA检测培养上清中IL-1β的水平;分别利用实时定量PCR检测IL-1β前体(pro-IL-1β)的mRNA水平,Western blot法检测pro-IL-1β蛋白水平;使用AC-YVAD-CMK阻断caspase-1活性并检测培养上清中IL-1β的水平;使用A.baumannii接种预先给予环磷酰胺处理的小鼠,制备A.baumannii感染模型,给予AC-YVADCMK处理,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β的水平;HE染色观察A.baumannii感染小鼠肺组织损伤情况。结果A.baumannii刺激BMDM后,培养上清中IL-1β的水平增加,pro-IL-1βmRNA和蛋白表达无明显变化;使用AC-YVAD-CMK阻断caspase-1活性后,BMDM分泌IL-1β减少,A.baumannii接种的小鼠腹腔给予AC-YVAD-CMK处理,BALF中IL-1β的水平下降,其肺组织损伤程度减轻。结论 AC-YVAD-CMK通过减少A.baumannii感染BMDM分泌IL-1β减轻肺的病理损伤。

小鼠骨髓巨噬细胞分离培养及吞噬能力检测综合实验的设计

目的 细胞培养是现代生物技术中最核心、最基础的技术。目前细胞生物学实验课程对原代细胞分离培养技术培训不足。因此文章设计了实验以进一步提高医学生细胞培养技能。方法 分离4~6周龄雄性ICR小鼠骨髓细胞,在体外使用含有巨噬细胞集落刺激因子的RPMI 1640培养液培养七天,于第三天更换培养液一次,第七天通过乳胶珠吞噬实验检测细胞吞噬能力。结果 小鼠原代骨髓单核细胞经巨噬细胞集落刺激因子诱导一周后,分化为巨噬细胞,同时该细胞具有吞噬能力。结论通过实验,学生掌握了相关实验技能;加深对相关理论课程的理解;科研能力及综合素质得到有效提升。

TLR4信号通路在高糖诱导骨髓来源巨噬细胞激活中的作用

目的通过研究高糖对骨髓来源巨噬细胞(BMDM)Toll受体4(TLR4)表达及其下游信号通路的影响,初步探讨高糖通过TLR4信号通路促进巨噬细胞分泌炎症因子的机制。方法分离获取C57BL/6J及B10Sc NNju(TLR4基因敲除小鼠)BMDM,流式细胞仪检测其纯度;选取不同浓度的高糖及甘露醇,在不同时间点刺激BMDM;后将BMDM分为4组:正常糖浓度(LG)组、高糖刺激(HG)组、TLR4基因敲除(TLR4-/-)组、TLR4基因敲除BMDM高糖刺激(TLR4-/-+HG)组。采用流式细胞术观察BMDM M1表型,细胞免疫荧光法观察BMDM TLR4与诱生型一氧化氮合酶(i NOS)共表达,实时定量PCR法检测各组细胞中促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、白细胞介素1β(IL-1β)及iNOS的mRNA表达,Western blot法检测各组总蛋白中TLR4、髓样分化因子88(My D88)、TIR结构域衔接蛋白(Trif)、磷酸化白介素受体相关激酶-1(p-IRAK-1)、干扰素调节因子3(IRF3)、磷酸化(p)-IRF3、核因子κB(NF-κB)p65、NF-κB p-p65、i NOS蛋白的表达,ELISA法测定细胞上清液中促炎因子TNF-α、MCP-1、IL-1β的表达。结果与LG组比较,高糖可使M1型巨噬细胞百分比增加;TNF-α、MCP-1、IL-1β及i NOS的mRNA水平上调;TLR4、My D88、Trif、p-IRAK-1、p-IRF3、IRF3、NF-κB p65、NF-κB p-p65、iNOS蛋白表达水平升高;细胞培养基中分泌的TNF-α、MCP-1、IL-1β水平升高。TLR4基因敲除可消除高糖导致的巨噬细胞激活效应。结论高糖可诱导BMDM向M1型极化;TLR4基因敲除可抑制高糖诱导的巨噬细胞向M1活化及炎症因子的产生。

芹菜素通过NF-κB和MAPK抑制脂多糖诱导的骨髓来源巨噬细胞的炎性

目的研究芹菜素在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的骨髓来源巨噬细胞(bone-marrow-derived macrophages,BMDMs)炎性的作用。方法用MTT方法筛选出芹菜素起作用的浓度范围。选择适当的芹菜素浓度处理BMDMs,用实时定量PCR方法检测炎性基因的表达,用Western-blot方法检测炎性信号通路蛋白的表达,以及荧光免疫检验法考察NF-κB P65蛋白的核转位。结果芹菜素的有效作用浓度范围为0~30μmol/L,选用10、30μmol/L浓度的芹菜素培养BMDMs后,炎性因子的m RNA水平明显降低,巨噬细胞从促炎性M1型向抗炎性M2型转化,并且呈现剂量依赖的趋势。NF-κB和MAPK信号通路的激活也受到了明显的抑制。结论芹菜素能通过抑制NF-κB和MAPK信号通路降低LPS诱导的BMDMs的炎性。

小鼠骨髓源性巨噬细胞极化的体外诱导方法探究

目的:探究小鼠骨髓前体细胞体外诱导成为不同极化状态(M1和M2)巨噬细胞的优化方法。方法:健康C57BL/6小鼠麻醉处死,收集其股骨和胫骨腔内容物,经筛网过滤、红细胞裂解后,在RPMI-1640完全培养基中培养16h,收集未贴壁的骨髓前体细胞重新接种于6孔板。根据培养基中所加刺激剂的种类、剂量不同进行实验分组,于不同时点收集细胞,光镜下观察各组细胞形态学变化,流式细胞术及RT-qPCR检测不同极化状态巨噬细胞的相应标志物。结果:(1)小鼠骨髓前体细胞经50μg/L巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激72 h后,CD11b阳染率达到90%以上;刺激96 h后,F4/80的阳染率达到95%以上。40μg/L的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激96 h后,CD11b阳染率也达到了90%以上,F4/80阳染率至144 h达到峰值(58.2%);(2)在M-CSF刺激所得单核-巨噬细胞的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂(25μg/L LPS和10μg/L IFN-γ)刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;给予M2型巨噬细胞诱导剂(20μg/L IL-4和IL-13)刺激后CD206的阳染率始终处于较低水平(10%左右);(3)在GM-CSF刺激的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;而当细胞接受M2型巨噬细胞诱导剂刺激96 h,CD206的阳染率达68.98%;(4)RT-qPCR结果显示在给予相应极化诱导剂刺激后,M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12,以及M2型巨噬细胞标志物:几丁质酶3样蛋白3(Chi3l3/Ym1)、甘露糖受体(MR)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。结论:(1)C57BL/6小鼠骨髓前体细胞受到M-CSF或GM-CSF诱导后90%以上细胞均可向单核细胞分化,M-CSF可诱导90%以上的细胞为成熟巨噬细胞,GM-CSF可诱导58%的细胞为成熟巨噬细胞;(2)在M-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,但联合IL-4和IL-13难以获得M2型巨噬细胞;(3)在GM-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,联合IL-4和IL-13也可将大部分细胞诱导成为M2型巨噬细胞。

人参茎叶皂苷对体外条件下小鼠骨髓间充质干细胞和粒-巨噬系祖细胞增殖的影响

目的:探讨人参茎叶皂苷(GSL)在体外培养条件下对小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)和粒-巨噬系祖细胞(CFU-GM)生长的影响。方法:在小鼠骨髓细胞液体培养体系和半固体培养体系中加入不同浓度的GSL,应用体外集落形成法检测GSL对小鼠MSC和CFU-GM增殖的影响。结果:在培养体系中GSL浓度为25μg/ml时,MSC和CFU-GM集落产率与对照组无明显差异(P>0.05);50～200μg/ml的范围内,MSC和CFU-GM集落产率显著高于对照组(P<0.05),其中浓度为100μg/ml时效应最明显;但在400μg/ml时,MSC和CFU-GM集落产率却低于对照组(P<0.05)。结论:GSL在一定浓度范围内对体外培养条件下的小鼠骨髓MSC具有生长促进作用,而在高浓度时表现出生长抑制作用。

马鹿角粉浸提液对骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响

背景:异物反应会导致材料植入失败,近些年来对于免疫学的研究逐渐成为热点,选择具有良好免疫性能的支架材料,对于骨缺损修复具有重要意义。目的:探讨去抗原处理的煅烧马鹿角松质骨及未去抗原处理的马鹿角对骨髓来源M1型巨噬细胞生物行为的影响。方法:经过物理及化学方法制备煅烧马鹿角松质骨,通过X射线光电子能谱、傅里叶变换红外光谱检测材料理化性质,制备2种材料浸提液并检测浸提液中Ca、P、Mg的元素水平。体外诱导培养骨髓来源巨噬细胞并在脂多糖和干扰素γ刺激下极化为M1型巨噬细胞,然后与各组浸提液共培养,对照组用单纯IMDM完全培养基共培养,CCK-8检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞M1型标志物表达率、qPCR检测巨噬细胞相关基因表达水平。结果与结论:①去抗原马鹿角组Ca、P、Mg元素水平高于马鹿角组;②去抗原马鹿角组和马鹿角组主要官能团为OH^(-)、PO_(4)^(3-)、CO_(3)^(2-);③共培养1,3,7 d各组M1型巨噬细胞存活率差异无显著性意义;④共培养1 d时,去抗原马鹿角组细胞表面标志物CD16/32表达率低于对照组;⑤共培养1,3 d时,去抗原马鹿角组促炎因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达明显低于对照组;共培养3 d时,去抗原马鹿角组M2型巨噬细胞主要标记物CD206的表达量明显高于对照组;而在共培养1,3 d时马鹿角组的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达或与对照组无差异或明显高于对照组,在CD206因子表达方面均与对照组无差异;⑥结果表明,去抗原马鹿角松质骨粉末浸提液可降低M1型巨噬细胞相关促炎因子的表达并促进其向M2型巨噬细胞极化。