5个品系小鼠胚胎干细胞系建立的方法学比较(英文)

以 70 %的大鼠心脏细胞条件培养基 (RH CM)为培养液 ,以小鼠胚胎成纤维细胞 (PMEF)为饲养层 ,采用添加 1%鸡血清的消化液和“连续离散法”作为小鼠ES细胞建系的改进方法 ,比较了 5个品系小鼠ES细胞系建立的特点。与常规方法相比 ,3个近交系小鼠 12 9 ter、C5 7BL 6J、BALB c的ES细胞建系率分别由 11 8%、3 7%和 2 9%提高到 33 3%、13 3%和 19 4 % ,差异十分显著 ;直接采用改进的方法建立KM和ICR小鼠ES细胞系 ,建系率分别达 12 %和 4 2 1%。讨论了ICM增殖的时间 ,即离散时机对ES集落形成及建系率的影响 ,结果显示 :12 9 ter、C5 7BL 6J、BALB c、KM和ICR小鼠品系ICM适宜的离散时机分别为增殖 4～ 6d、3～ 3 5d、4d、4～ 5d和 4～ 5d ;同时 ,讨论了不同ES细胞建系所需最适宜的消化液浓度 ,其中BALB c小鼠的ES细胞对高浓度的消化液十分敏感 ,0 0 5 %Trypsin 0 0 0 8%EDTA是其比较理想的离散浓度。设计了两种离散方法 ,即“一次离散法”和“连续离散法” ,用来离散增殖的ICM和ICM离散后出现的ES集落 ,结果表明 :后者在建系过程中的作用明显优于前者。RH CM与添加LIF的常规ES细胞培养基相比 ,不但具有显著抑制小鼠ES细胞分化、维持其二倍体核型的作用 ,而且明显促进ES细胞的贴壁生长。

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

本实验主要研究脂质体量、质粒量、细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间、细胞传代次数以及细胞种类对转基因效率的影响.首先研究了脂质体量、质粒量和细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间对小鼠胎儿成纤维细胞(MFFC)的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响.结果表明,在本实验条件下,用传至3代的MFFC,24孔培养板中每孔接种4-10×104个细胞,70%-90%贴满程度,当脂质体(LipofectAMINE)4μg、质粒(pEGFP-N1)0.3μg,复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高,为30.7%.用此方案比较不同传代次数的MFFC转染效率结果表明,原代细胞的转染效率为10.0%,3代为28.9%,到15代降到7.2%.说明随着传代次数的增加,转染效率逐渐降低.将MFFC、小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和小鼠颗粒细胞(MGC)分别传至3代,采用上述方案进行转染,转染效率分别是27.8%、13.7%和14.2%.可见不同种类细胞的转染效率不同.细胞周期检测表明,无论是不同代次的细胞还是不同种类的细胞,其转染效率高低与M期所占比例的多少有关.这为如何提高转染效率提供了有利的依据.

一种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法的研究

目的:应用胶原酶Ⅴ酶消化法建立一种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法。方法:小鼠处死后取出肺脏,将其剪碎,应用胶原酶Ⅴ(175 U.ml-1)消化,37℃孵育1 h,随后进行细胞计数、活细胞百分率和流式细胞仪检测。结果:(1)光镜下见胶原酶Ⅴ消化所得小鼠肺细胞多种多样,大小不一,细胞形态完整,分散度好;(2)30 mg小鼠肺组织可提取细胞数量为(1～3)×106个,肺单细胞悬液中活细胞百分率均在95%以上;(3)流式细胞术检测可见大量的肺细胞。结论:应用胶原酶Ⅴ酶消化法制备小鼠肺单细胞悬液高效、简便,为肺细胞生物学及肺部疾病发病机制研究提供了有效的肺单细胞制备方法。

免疫外科法分离克隆BALB/c小鼠胚胎干细胞

目的 使用免疫外科法分离克隆BALB c小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ES细胞 ) ,为进一步建立BALB c小鼠ES细胞系打下基础。方法 用免疫外科法从 4 5枚BALB c小鼠囊胚中分离得到 2 0枚去除滋养层细胞的ICM ,接种在MEF饲养层上 ,使用DMEM(高糖 ) +15 %FBS +0 1mmol Lβ 巯基乙醇 +0 0 1mmol L非必需氨基酸 +10 0 0IU mlLIF +10 0IU mL青霉素 +10 0IU ml链霉素培养液 ,17枚形成典型的ICM集落 (85 0 % ) ,有一枚胚胎传至第 10代。用于全胚培养的BALB c小鼠胚胎共 10 2枚 ,使用与免疫外科相同的培养方法 ,6 6枚形成典型的ICM集落 (6 4 7% ) ,其中一枚胚胎传至第 8代。结果 免疫外科法较全胚培养法有利于小鼠ES细胞的分离与克隆 ;添加LIF(10 0 0IU ml)有利于小鼠ES细胞的分离与传代 (P <0 0 5 ) ;0 0 5 %胰酶 +0 0 0 8%EDTA是较好的ES细胞消化液 ,对细胞综合损伤力小 ,且传代后ES细胞集落形成能力也较高 (P <0 0 5 )。结论 分离得到的ES细胞经形态学观察 ,AKP染色 ,体外分化实验 ,核型分析等证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。

采用高速离心及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体比较及鉴定

比较及鉴定超高速离心法及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体。采用BCA蛋白检测可见ExoQuick-TC法提取的外泌体蛋白含量高于超高速离心法提取的蛋白含量。Exosome Antibodies,Array&ELISA Kits检测可见ExoQuick-TC法提取外泌体的纯度优于超高速离心法提取的纯度。两种方法提取的外泌体电镜下形状无差异,随机选取3个电镜视野进行计数可见ExoQuick-TC法提取外泌体数量多于超高速离心法提取外泌体。ExoQuick-TC法提取的外泌体具有更高的产量及纯度。

改良型混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞

背景:目前采用的A型胶原酶和胰蛋白酶混合酶分离乳腺细胞团的方法操作复杂,实验条件要求高。目的:观察改良型混合酶消化法能否成功进行乳腺上皮细胞的体外培养。方法:采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶(1:1:1)混合消化直接用眼科剪剪碎的小鼠乳腺组织,37℃振荡消化获取乳腺细胞团,并采用差速贴壁法去除成纤维细胞,将细胞团接种于细胞培养瓶进行培养。结果与结论:倒置显微镜下观察显示,改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且培养12h后细胞团绝大多数贴在细胞瓶壁,培养72h后细胞团完全铺开融合成片,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光细胞化学染色结果显示,培养细胞角蛋白18呈阳性反应。说明应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。

小鼠2-细胞胚胎细管法和OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

本试验在室温 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,利用不同浓度的玻璃化溶液 (EFS和EDFS) ,对小鼠 2 细胞胚胎进行细管法和OPS法玻璃化冷冻保存。在 2 0℃室温条件下 ,用EFS4 0平衡 1min细管一步法冷冻 ,解冻后囊胚发育率仅为35 .0 % ,和新鲜 2 细胞体外培养的对照组 (6 5 .0 % )的差异极显著 (P <0 .0 1)。当 2 细胞胚胎在 10 %EG +10 %D溶液中预处理 5min ,再移入EDFS中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后囊胚发育率达 4 7.8%～ 4 8.8% ;当室温升至2 5℃时 ,二步法冷冻保存后 2 细胞的囊胚发育率达到 5 2 .2 % ,与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 )。改用OPS二步法EFS30冷冻组保存后的 2 细胞胚胎的囊胚发育率高达 6 2 .2 % ,为试验中的最佳组。

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法

本研究旨在建立一种方便、快捷、有效体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的方法。在无菌条件下取小鼠股骨、胫骨,分别用全骨髓贴壁法、骨片消化法、骨髓加骨片法分离小鼠MSC,比较MSC集落出现时间、大小及数量;应用流式细胞术检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定。结果表明,骨髓加骨片法出现的集落时间最早,集落数量最多,第4天集落数为20±4个;骨片消化法为11.5±2.5个;全骨髓贴壁法最少,为9.5±1.5个;到第3代时,骨髓加骨片法获得细胞数量最多,是全骨髓贴壁法和骨片消化法的2倍;流式细胞术检测结果显示,获得的细胞高表达干细胞标志之一Sca-1,高表达CD44、CD29,不表达白细胞表面抗原CD45和内皮细胞标志CD31等;所分离的MSC在成骨诱导体系和成脂诱导体系中能分别向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有典型的MSC特性。结论:骨髓加骨片法是一种方便、快捷、有效的小鼠骨髓MSC分离方法。

应用AFLP法检测小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传差异

目的 应用AFLP技术检测小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传改变 ,以期发现与肿瘤转移相关的DNA片段或基因。方法 肿瘤组织基因组DNA经限制性内切酶酶切 ,连接特异性接头 ,采用 2 5对与接头相识别的引物进行扩增 ,扩增产物经含溴化乙锭的 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,紫外透视仪分析、照相 ,回收差异片段 ,克隆测序。结果 2 5对引物均扩增出清晰条带 ,2 1对引物扩增结果显示高低转移性肝癌无差异 ,4对引物扩增结果显示二者之间有差异 ,表现为扩增带的有无 ,4条回收片段中的 1条片段克隆成功并测序。结论 AFLP技术适用于肿瘤易感基因的筛选 ,小鼠肝癌的转移可能与基因组不稳定性有关 ,所得差异片段是否与转移相关有待进一步鉴定。

小鼠胚胎干细胞密度梯度离心去核法

在细胞松弛素B的参与下,通过Ficoll密度梯度离心法可有效制备小鼠无核ES细胞,在适宜条件下,悬液培养中40%的小鼠ES细胞可发生去核作用,经Hoechst染色和形态观察确定:80%的去核ES细胞在30min内可恢复其原有形态,但其生活力不会超过48h,这为研究ES细胞的胞质功能及核质互作效应提供了一种可行的细胞去核方法。

小鼠4-细胞胚胎OPS法冷冻保存技术

在25℃室温和37℃恒温台条件下，利用玻璃化冷冻溶液EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40，对小鼠4-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存．以解冻后培养72h的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标，同时对解冻后培养1～3h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。开放式拉长塑料细管（OPS）二步法冷冻保存，即胚胎首先移入预处理液（10％EG或10％EG＋10％DMSO）中平衡30s，再移入玻璃化溶液中洗涤后吸入OPS管中，分别经35、30或25s后直接投入液氮中冷冻保存。一步法冷冻保存则无需预处理液处理。结果表明，小鼠胚胎4-细胞一步法和二步法冷冻后囊胚最高发育率分别为87．7％和88.6％，与对照组（93.0％）差异不显著（P〉0．05）。利用最佳冷冻组获得的143枚胚胎移植于12只假妊娠50～60h的受体母鼠，结果有4只妊娠产仔17只，妊娠产仔率为42．5％（17／40），与对照组59．4％（19／32）差并不显著（P〉0.05）。

OPS两步法玻璃化冷冻小鼠8-细胞胚胎生存发育率的研究

目的为实验动物、家畜和人类胚胎的冷冻保存探索简易、高效的玻璃化冷冻程序。方法以小鼠8-细胞胚胎为材料,在25℃室温和37℃恒温台条件下,利用玻璃化冷冻溶液EDFS30, 对小鼠8-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存,解冻后培养60 h后的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标,同时对解冻后培养1-3 h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。OPS(Open-pulled straw)两步法冷冻保存,即胚胎首先移入预处理液(10％EG+10％DMSO)中平衡30 s,再移入玻璃化溶液中吸入OPS平衡15、25、35、45和60 s连同胚胎直接投入液氮中冷冻保存。结果小鼠胚胎8-细胞冷冻后囊胚发育率最佳组高达95．6％,与对照组(96．8％)差异无统计学意义(P> 0．05)。利用最佳冷冻组获得的165枚胚胎移植于11只假孕63-67 h的受体母鼠,结果有4只妊娠,产仔23只,妊娠产仔率为38．3％(23/60),与对照组37．9％(22/58)差异无统计学意义(P>0．05)。结论 EDFS33为玻璃化冷冻液,OPS两步法能有效地冷冻保存小鼠8-细胞胚胎。

神经肌肉电刺激通过调控白细胞介素6/信号转导子及转录激活子3信号通路促进脊髓损伤后小鼠运动功能恢复

目的观察神经肌肉电刺激(NMES)对脊髓损伤后小鼠白细胞介素6(IL-6)/STAT3信号通路的影响,探讨其对运动功能恢复的机制。方法选取SPF级小鼠72只随机分成假手术(sham)组、脊髓损伤组(SCI)和NMES组。利用BMS评分、斜坡实验与电生理(EMG)评估小鼠脊髓损伤后肢体运动恢复情况。Western blotting和Real-time PCR检测各组小鼠脊髓组织中相关炎症因子、IL-6/STAT3信号通路与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。HE染色观察各组小鼠脊髓形态结构。结果NMES组BMS评分和小鼠斜坡实验均高于SCI组(P<0.05);NMES组小鼠运动诱发电位(MEP)最大振幅高于SCI组(P<0.05);NMES组脊髓组织TNF-α、IL-12A与GFAP表达量均低于SCI组(P<0.05),TGF-β、IL-10与BDNF表达量均高于SCI组(P<0.05);与SCI组相比,NMES组小鼠脊髓空洞较少,脊髓形态修复较好;与SCI组相比,NMES组IL-6/STAT3信号通路蛋白表达均低于SCI组(P<0.05)。结论神经肌肉电刺激通过抑制IL-6/STAT3信号通路发挥抗炎作用,从而促进脊髓损伤后小鼠后肢运动功能的恢复。

MTT法检测博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度和时间的博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞（NIH3T3细胞）增殖的影响。方法：取对数生长期的NIH3T3细胞,用10%胎牛血清培养制成的细胞悬液加入96孔培养板中培养。以NIH3T3细胞为观察对象,分别给予不同浓度（0.1~10 000 mU/mL）博莱霉素处理,于给药后12 h、36 h、48 h后采用4-甲偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖。结果：与空白对照组比较,1~10 mU/mL浓度的博莱霉素,可促进NIH3T3细胞增殖（P〈0.05）。其余浓度博莱霉素对细胞增殖无影响。结论：1~10mU/mL浓度的博莱霉素能够促进NIH3T3细胞的增殖。

MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖性反应探讨

通过小鼠胸腺、脾脏淋巴细胞对ＣｏｎＡ 增殖反应的实验条件探讨，作者建立了其增殖反应的ＭＴＴ 测定法。同时与传统同位素法进行了比较，ＭＴＴ 法准确、安全、可靠，可以替代同位素法。实验结果还表明小鼠品种间淋巴转化增殖反应存在极大差异性。