山慈菇提取液对小鼠4T1乳腺癌细胞抑制作用机制的研究

探索山慈菇提取液对小鼠4T1细胞抑制作用机制。采用水煎法制备山慈菇提取液,MTT比色法检测小鼠4T1细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡。结果表明,山慈菇提取液对4T1细胞有明显的增殖抑制作用(P<0.05),并呈剂量依赖关系。山慈菇提取液诱导小鼠4T1细胞凋亡效果明显,并有剂量依赖性。山慈菇提取液对小鼠乳腺癌细胞有明显的增殖抑制和诱导其细胞凋亡的作用。

二甲双胍联合compound C对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖和细胞周期蛋白D1表达的影响

目的 探讨二甲双胍及单磷酸腺苷活化蛋白激酶抑制剂（compound C）对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖及细胞周期蛋白D1（cyclin D1）表达的影响。方法 选取小鼠乳腺癌4T1细胞体外培养,分别以完全培养基为空白组,4T1细胞为对照组,在细胞培养中分别加入浓度为2.5、5、10、20、40 mmol/L的二甲双胍为实验组1-5,以10 mmol/L的二甲双胍联合20μmol/Lcompound C的为实验组6,20μmol/L compound C的为实验组7。检测各组细胞株增殖情况及细胞内cyclin D1的表达。结果 二甲双胍作用24、48 h时,实验组1与对照组存活率无显著差异（P〉0.05）,实验组2-5细胞存活率显著低于对照组（P〈0.05）;72 h时,实验组1-5存活率均显著低于对照组（P〈0.05）;实验组3、4、5在24、48、72 h时,各组cyclin D1的相对表达量均显著低于对照组（P〈0.05）;各组48 h时cyclin D1的相对表达量显著低于24 h时（P〈0.05）;72 h时cyclin D1的相对表达量显著低于各组48 h时（P〈0.05）;实验组3 cyclin D1的相对表达量显著低于对照组（P〈0.05）,实验组6、7在各时间点与对照组比较无显著差异（P〉0.05）。结论 二甲双胍能抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖,而compound C对其有拮抗作用;二甲双胍对小鼠乳腺癌4T1细胞cyclin D1蛋白表达有下调作用。

水疱性口炎病毒对小鼠乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠抗肿瘤免疫、移植瘤生长与肺转移的影响

目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响。方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,qPCR检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达。于雌性BALB/c小鼠脂肪垫接种1×10^(6)个/mL的4T1细胞0.1 mL,构建4T1细胞荷瘤小鼠模型,待小鼠肿瘤体积达200 mm3,分别向移植瘤内注射PBS、紫杉醇(TAX)(15 mg/kg)、VSV-IN(1×10^(6)pfu/只),每周1次。给药4次后,处死小鼠、剥离完整移植瘤组织,测量肿瘤体积及质量,肺组织病理切片经H-E染色后观察肿瘤肺部转移结节,流式细胞术检测脾组织中T细胞亚群比例,ELISA法检测小鼠血清IL-6及TNF-α水平,利用GEPIA在线分析乳腺肿中迁移相关蛋白mRNA的表达,免疫组化法检测肿瘤中MMP-2、MMP-9与E-cadherin的表达,利用蛋白-蛋白对接技术预测VSV-IN的G蛋白、M蛋白与ERK2、E-cadherin的亲和力。结果:经MOI=10、100的VSV-IN处理48 h后,4T1细胞死亡率显著高于对照组(均P<0.01);与对照组相比,VSV-IN组(MOI=10)细胞迁移率明显降低(P<0.01),MMP-9 mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05);与对照组小鼠相比,VSV-IN组移植瘤生长较对照组减缓且终点体积显著减小(P<0.05),VSV-IN组小鼠肺转移结节数量显著减少[(12.86±1.86)vs(24±3.67)个,P<0.01],脾内CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例显著升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6含量显著升高(均P<0.01);GEPIA分析发现在乳腺癌中E-cadherin、MMP-9表达水平均高于癌旁组织(P<0.05);VSV-IN组小鼠肿瘤细胞内MMP-9表达明显低于对照组(P<0.05);VSV-IN的G、M蛋白与ERK2的结合自由能分别为–11.7 kcal/mol、–6.4 kcal/mol。结论:野生型VSV-IN可抑制4T1细胞荷瘤小鼠的移植瘤生长及转移,这可能与其促进抗肿瘤免疫及调控迁移相关蛋白表达有关。

白藜芦醇通过下调LRP5/6表达抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖

目的通过体外实验研究白藜芦醇(RES)抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖的作用机制。方法将处于对数生长期小鼠乳腺癌4T1细胞消化后接种于3.5 cm细胞皿中,分别加入0、2.5、5、10、20μmol/L的RES干预72 h,使用倒置显微镜拍照观察法和台盼蓝计数法检测RES干预后细胞密度和活细胞浓度;Western blot检测低密度脂蛋白相关受体结合蛋白5(LRP5)、低密度脂蛋白相关受体结合蛋白6(LRP6)蛋白表达量。再将细胞分为对照组、RES组,分别加入0μmol/L和前述所筛选的最佳干预浓度的RES干预72 h,Western blot检测β-连环蛋白(β-catenin)核蛋白表达量。接着将细胞分为siCtr组、siLRP5组、siLRP6组、siβ-catenin组,siCtr组给予正常培养,siLRP5组加入LRP5小干扰RNA(siRNA)沉默LRP5基因,siLRP6组加入LRP6 siRNA沉默LRP6基因,siβ-catenin组加入β-catenin siRNA沉默β-catenin基因,使用倒置显微镜拍照和台盼蓝计数检测上述4组细胞密度和活细胞浓度;Western blot检测LRP5、LRP6和β-catenin蛋白表达量。最后将细胞分为Vector组、Vector+RES组、LRP5组、LRP5+RES组、LRP6组、LRP6+RES组、N端缺失的β-catenin突变体组(β-cateninΔN组)、β-cateninΔN+RES组,Vector组给予正常培养,Vector+RES组加入前述所筛选的最佳干预浓度的RES干预,LRP5组加入过表达LRP5质粒,LRP5+RES组加入过表达LRP5质粒联合RES最佳干预浓度,LRP6组加入过表达LRP6质粒,LRP6+RES组加入过表达LRP6质粒联合RES最佳干预浓度干预,β-cateninΔN组加入过表达β-cateninΔN质粒,β-cateninΔN+RES组加入过表达β-cateninΔN质粒联合10μmol/L的RES干预。使用倒置显微镜拍照和台盼蓝计数检测上述8组细胞密度和活细胞浓度;Western blot检测LRP5、LRP6和β-catenin蛋白表达量。结果与0μmol/L RES组比较,10、20μmol/L RES组细胞密度和活细胞浓度均降低(P<0.05),对LRP5、LRP6蛋白表达下调显著(P<0.05),故后续选用10μmol/L浓度的RES进行干预。与对照组比较,RES组β-catenin核蛋白表达量下调(P<0.05);与siCtr组比较,siLRP5组、siLRP6组和siβ-catenin组细胞密度和活细胞浓度降低(P<0.05);与Vector组比较,Vector+RES组细胞密度和活细胞浓度降低(P<0.05);与Vector+RES组比较,LRP5+RES组、LRP6+RES组和β-cateninΔN+RES组细胞密度和活细胞浓度升高(P<0.05)。结论白藜芦醇可阻止小鼠乳腺癌4T1细胞增殖,其机制与通过下调LRP5、LRP6表达抑制Wnt/β-catenin信号通路激活有关。

柴朴汤对哮喘小鼠支气管上皮细胞炎症因子及HMGB1/TLR4/NF-κB的影响

目的探讨柴朴汤对哮喘小鼠支气管上皮细胞高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)及下游炎症介质单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)的影响。方法将小鼠支气管上皮细胞分为对照组(Con组,空白血清培养)、Model组(哮喘小鼠血清培养)和Chaipu组(柴朴汤药血清培养)。采用qRT-PCR和Western blotting检测小鼠支气管上皮细胞中HMGB1、TLR4、NF-κB、MCP-1、IL-6的mRNA及蛋白表达情况,ELISA法测定细胞培养液中MCP-1和IL-6的水平。结果与Con组相比,Model组小鼠支气管上皮细胞HMGB1、TLR4、NF-κB、MCP-1、IL-6表达均明显升高(P<0.05);Model组细胞培养液中MCP-1、IL-6也显著升高(P<0.05)。与Model组相比,Chaipu组小鼠支气管上皮细胞HMGB1、TLR4、MCP-1、IL-6 mRNA和蛋白表达降低,NF-κB m RNA表达亦降低(P<0.05);Chaipu组细胞培养液中MCP-1、IL-6也显著降低(P<0.05)。结论柴朴汤可下调哮喘血清诱导的炎症因子的表达,可能与其抑制HMGB1/TLR4/NF-κB炎症通路有关。

(1-3)-β-D葡聚糖联合降钙素原、CD4^(+)T淋巴细胞多指标在艾滋病患者马尔尼菲篮状菌感染早期诊断临床研究

目的探讨(1-3)-β-D葡聚糖联合降钙素原(procalcitonin,PCT)、CD4^(+)T淋巴细胞多指标在艾滋病患者马尔尼菲篮状菌感染早期诊断临床研究。方法回顾性选取我院2020年1月—2022年6月住院的120例艾滋病患者为研究对象。依据实验室结果,将其分为马尔尼菲篮状菌感染确诊组(血或组织液培育养出马尔尼菲篮状菌),简称A组(62例),及马尔尼菲篮状菌感染临床诊断组[根据临床症状、体征、血常规及(1-3)-β-D葡聚糖、PCT、CD4^(+)T淋巴细胞多指标诊断],简称B组(58例)。检测患者(1-3)-β-D葡聚糖、PCT、CD4^(+)T淋巴细胞的表达水平,采用受试者工作特征(receiver-operating characteristic,ROC)曲线下面积(area under the curve,AUC)评估上述指标联合检测对艾滋病患者感染马尔尼菲篮状菌的诊断效能。结果A组的(1-3)-β-D葡聚糖和PCT水平均高于B组,CD4^(+)T淋巴细胞个数低于B组(P<0.05);(1-3)-β-D葡聚糖、PCT、CD4^(+)T淋巴细胞联合检测的AUC为0.933,(1-3)-β-D葡聚糖单独检测的AUC是0.812,PCT单独检测的AUC为0.883,CD4^(+)T淋巴细胞单独检测的AUC是0.810,(1-3)-β-D葡聚糖、PCT和CD4^(+)T淋巴细胞联合检测的AUC皆优于三项单独检测,表明(1-3)-β-D葡聚糖、PCT和CD4^(+)T淋巴细胞联合检测的诊断价值皆优于单一指标诊断,且联合检测的特异度、约登指数分别为92.43%和0.580,均高于三项单独检测。结论(1-3)-β-D葡聚糖联合PCT和CD4^(+)T淋巴细胞多指标对艾滋病马尔尼菲篮状菌感染具有非常高的临床诊断价值,能够帮助医生分析出高危风险患者,及时制定治疗方案,同时也承担预后效果的判断依据,对治疗艾滋病马尔尼菲篮状菌感染具有非常重要的研究价值。

基于Wnt/β-连环蛋白通路探究金天格对肿瘤坏死因子-α诱导的小鼠MC3T3E1细胞生物学功能的影响实验研究

目的:探讨金天格通过调节Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的小鼠成骨细胞(MC3T3E1)细胞生物学功能的影响。方法:体外培养MC3T3E1细胞,分为对照组、TNF-α组(50 ng/ml TNF-α)、L-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10^(-6) g/L金天格)、M-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10-5 g/L金天格)、H-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10^(-4) g/L金天格)、Dickkopf-1(DKK-1)组(50 ng/ml TNF-α+10 ng/ml Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK-1)、H-金天格+LiCl组(50 ng/ml TNF-α+10^(-4) g/L金天格+20μmol/L Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl)。用CCK-8试剂盒对细胞活性进行检测,用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测,用酶联免疫吸附试验对细胞白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平进行检测,用Western blot对细胞凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达情况进行检测。结果:与对照组比较,TNF-α组细胞活性、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、细胞程序性死亡配体-1(PD-L1)蛋白表达降低,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及B细胞淋巴瘤(Bax)、β-catenin、转录因子7样2(TCF7L2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白表达升高(均P<0.05)。与TNF-α组比较,L-金天格组、M-金天格组、H-金天格组、DKK-1组细胞活性及Bcl-2、PD-L1蛋白表达升高,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及Bax、β-catenin、TCF7L2、Cyclin D1蛋白表达降低(均P<0.05)。与H-金天格组比较,H-金天格+LiCl组细胞活性及Bcl-2、PD-L1蛋白表达降低,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及Bax、β-catenin、TCF7L2、Cyclin D1蛋白表达升高(均P<0.05)。结论:金天格可能通过抑制Wnt/β-catenin通路减轻TNF-α诱导的MC3T3E1细胞损伤。

梅毒血清固定患者中NOD样受体蛋白3和Toll样受体4表达与Th1/Th2相关细胞因子的相关性研究

目的探究梅毒血清固定患者中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、Toll样受体4(TLR4)表达与辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(Th1/Th2)相关细胞因子的相关性。方法选取2021年2月至2022年4月川北医学院附属三台医院收治的197例梅毒患者作为研究对象。将进行驱梅治疗后血清转阴者纳入转阴组(n=88),未进行驱梅治疗者纳入梅毒组(n=45),接受驱梅治疗后血清固定者纳入固定组(n=64)。另选取同期进行体检的健康人作为对照组(n=53)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血单个核细胞(PBMCs)中NLRP3、TLR4 mRNA相对表达水平;采用酶联免疫吸附试验法检测Th1/Th2相关细胞因子的表达水平;采用Pearson法分析TLR4、NLRP3 mRNA与Th1/Th2相关细胞因子的相关性。结果各组PBMCs中TLR4、NLRP3 mRNA表达水平比较,梅毒组>转阴组>对照组>固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);各组白介素(IL)-2、γ干扰素(IFN-γ)水平比较,对照组>转阴组>梅毒组>固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);各组IL-1β、IL-4、IL-10及IL-18水平比较,对照组<转阴组<梅毒组<固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);梅毒血清固定患者TLR4、NLRP3 mRNA表达与IFN-γ、IL-2呈正相关,与IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18呈负相关(P<0.05)。结论梅毒血清固定患者NLRP3、TLR4 mRNA表达水平显著降低,且与Th1/Th2相关细胞因子密切相关。

COPD急性加重期患者外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA及血清cTnT、尿酸水平变化分析

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重期患者外周血单个核细胞中细胞因子信号抑制蛋白-1(SOCS-1)、Toll样受体4(TLR4)mRNA水平及血清心肌肌钙蛋白T(cTnT)、尿酸水平变化。方法收集COPD急性加重期(组)患者70例,COPD稳定期(组)患者40例,对照组健康志愿者40名。检测外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸浓度;行肺功能检查并记录相关指标(FEV1、FEV1%、FEV1/FVC%)。对COPD急性加重期患者进行1 a随访,分为预后不良组和预后良好组。对外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平、血清cTnT、尿酸浓度行Pearson相关性分析,并对COPD急性加重期患者预后评估价值进行ROC曲线分析。结果COPD急性加重期组SOCS-1 mRNA表达水平明显低于COPD稳定期组、对照组,TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸浓度明显高于COPD稳定期组和对照组(均P<0.01)。COPD急性加重期组FEV1、FEV1%、FEV1/FVC%明显低于COPD稳定期组和对照组(P<0.05)。COPD急性加重期患者FEV1/FVC%与外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA表达水平呈正相关关系(P<0.01),与外周血单个核细胞TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸浓度呈负相关关系(P<0.01)。预后不良组SOCS-1 mRNA水平明显低于预后良好组,TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸浓度明显高于预后良好组(P<0.05)。外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸联合检测对COPD急性加重期患者预后具有较高的评估价值。结论COPD急性加重期患者SOCS-1低表达,TLR4、cTnT、尿酸高表达,且与肺功能水平密切相关,联合检测对患者预后具有较高的评估价值。

不同接种量荧光素酶标记小鼠乳腺癌细胞4T1在小鼠体内生长及肺转移的比较

目的采用活体成像技术比较四种剂量荧光素酶标记肿瘤细胞在小鼠体内生长及肺转移情况,为光学标记肿瘤模型的药物筛选或机制研究提供参考资料。方法以荧光素酶作为报告基因导入小鼠乳腺癌细胞4T1中,经G418筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆并扩大培养。标记细胞稀释成1×107细胞/mL,2×107细胞/mL,5×107细胞/mL和1×108细胞/mL四种剂量,取0.1 mL接种于BALB/c小鼠右侧第二对乳腺脂肪垫内,制作小鼠原位乳腺癌模型,比较肿瘤细胞在小鼠体内生长及肺转移情况。结果获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆,在致瘤性方面和亲代细胞无明显差别,四种剂量细胞接种BALB/c小鼠后,均有肿瘤生长,接种第28天时,四种剂量接种的原位移植瘤大小没有明显差别,但接种两个高剂量肿瘤细胞的小鼠组各有2只小鼠死亡;接种后31 d,发现四种剂量接种的原位移植瘤均发生不同程度的转移,随着观察天数的增加,转移程度逐渐严重,接种后42 d,小鼠陆续发生死亡。结论根据转移和死亡情况,确定接种1×106个细胞/只不仅肺转移明显,而且存活时间一般超过45 d,比高剂量接种存活时间长,为最佳肺转移剂量。

白藜芦醇抑制Notch1信号通路对抗小鼠急性T淋巴细胞白血病

目的:观察白藜芦醇(Res)对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)小鼠的影响,并进一步探讨其对Notch1信号通路的作用机制。方法:将25只6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、T-ALL组和Res组,其中Res组又进一步分为low-Res(L-Res)、middle-Res(M-Res)和high-Res(H-Res)3个浓度给药组。应用流式细胞术和瑞氏-吉姆萨染色法检测外周血及脾细胞悬液中白血病细胞百分比,HE染色法观察脾脏和骨髓组织病理形态,RT-q PCR法检测脾脏组织中Notch1、Hes-1、c-Myc、mi R-19b和PTEN m RNA表达水平,Western blot法检测Notch1、Hes-1、c-Myc、p-PTEN和PTEN蛋白表达水平。结果:与对照组相比,T-ALL组小鼠外周血中白血病细胞明显增多,脾脏及骨髓组织中白血病细胞弥漫性浸润,脾脏中Notch1、Hes-1、c-Myc、mi R-19b m RNA表达水平和Notch1、Hes-1、c-Myc蛋白表达水平均明显增高(P<0.01),PTEN m RNA及其蛋白水平显著降低(P<0.01),经白藜芦醇处理后,H-Res组以上各项指标较T-ALL组均获得逆转。结论:白藜芦醇具有抗小鼠T-ALL的作用,其机制可能通过抑制Notch1信号通路发挥作用。

BALB/c小鼠乳腺癌4T1细胞株移植模型的建立

目的:应用来源于BALB/c小鼠的4T1乳腺癌细胞株建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,选择最佳的模型制作方法。方法:90只BALB/c小鼠随机分为3组,每组30只,分别接种1×106ml-1、1×107ml-1、1×108ml-14T1乳腺癌细胞株细胞悬液。每组小鼠再随机分两组分别接种于胸壁和侧腹壁。比较各组的成瘤时间、成瘤率和8周存活率,并用C-erbB-2免疫组化法检查肿瘤病理状态。结果:细胞浓度为1×107ml-1时,肿瘤成瘤率高,生长稳定;4T1细胞不同部位接种不影响成瘤率及生长;C-erbB-2免疫组织化学检查均为阳性。结论:应用1×107ml-1浓度的4T1细胞进行接种是最佳的模型制作方法。

5-FU对小鼠乳腺癌4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞的富集作用

目的:探讨以氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)处理并通过荷瘤小鼠模型体内传代的方法富集乳腺癌干细胞样细胞的可行性,为靶向肿瘤干细胞治疗奠定基础。方法:以乳腺癌细胞株4T1皮下接种小鼠制备荷瘤模型,以一定剂量5-FU腹腔注射4周;处死小鼠后取肿瘤组织制成细胞悬液,并接种小鼠制备下一代小鼠荷瘤模型,5-FU处理及再次传代方法同上,共传4代。对照组小鼠给予生理盐水注射,其余处理同模型组。流式细胞术检测各代肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例,Hoe-chast 33342染色法检测侧群(side population,SP)细胞的比例,免疫组化法检测CD55和ALDH1蛋白的表达,倒置显微镜观察乳腺癌细胞微球体的形成,小鼠致瘤实验检测不同肿瘤细胞的致瘤能力。结果:各代对照组小鼠模型肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例为(11.5±0.9)%,SP细胞比例为(9.7±1.3)%,ALDH1表达阴性,CD55强阳性表达细胞数为(0.6±0.3)%,乳腺癌细胞微球体比例为(0.5±0.2)%;5-FU处理组4代小鼠模型肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例分别为(49.8±1.2)%、(56.8%±1.7)%、(66.4±1.5)%、(69.0±1.6)%,SP细胞比例分别为(25.0±1.2)%、(42.6±2.8)%、(58.4±2.1)%、(61.3±2.6)%,ALDH1阳性表达细胞比例为(3.8±0.7)%、(14.1±2.4)%、(25.2±3.1)%、(27.5±2.7)%,CD55强阳性细胞比例为(7.8±1.6)%、(10.1±2.0)%、(15.6±1.4)%、(17.3±1.9)%,乳腺癌细胞微球体形成比例为(5.9±0.4)%;两组各相应指标之间差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。5-FU作用后富集了肿瘤干细胞的第3代肿瘤细胞的致瘤作用显著强于对照组细胞(P<0.05)。结论:5-FU作用并通过荷瘤小鼠体内传代能够富集小鼠乳腺癌4T1细胞株中的肿瘤干细胞样细胞。

小鼠乳腺癌4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的富集和鉴定

目的：无血清培养基（serum-free medium,SFM）悬浮培养小鼠乳腺癌细胞株4T1,富集并鉴定4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞。方法：通过含EGF、bFGF和B27等细胞因子的SFM培养富集4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞,将其接种于含血清培养基（serum-supplemented medium,SSM）,观察4T1肿瘤干细胞样细胞分化情况。应用细胞表面标志CD44^＋CD24^-/low和Hoechst33342染色法检测4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的比例,小鼠致瘤实验验证不同培养条件下4T1肿瘤干细胞样细胞的致瘤能力。结果：4T1细胞在SFM中能够存活、增殖,并形成细胞球,细胞球可连续传代,若重新接种于SSM中可贴壁分化。4T1细胞球中CD44^＋CD24^-/low细胞比例为6.4%68.9%,侧群（side population,SP）细胞比例为7.3%61.2%,均显著高于SSM中培养的4T1细胞（P〈0.05）;随着SFM中细胞球传代次数增加,CD44^＋CD24^-/low细胞和SP细胞的比例逐渐升高。小鼠致瘤实验结果显示,富集了肿瘤干细胞的细胞球比常规培养4T1细胞的致瘤性更强。结论：乳腺癌4T1细胞可在含多种生长因子的SFM中悬浮生长并形成细胞球,4T1细胞中含有的乳腺癌干细胞样细胞可通过SFM培养法富集。

苦豆子总生物碱对小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用的研究

目的研究苦豆子总生物碱对小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用。方法苦豆子总生物碱提取并纯化,处理成澄清的药物溶液后用于细胞给药。CCK-8法测定不同浓度的苦豆子总生物碱作用24h后4T1细胞存活率。流式细胞术检测给药24h后4T1细胞凋亡率。结果与对照组比较,实验组药物浓度为5.00mg/mL时,4T1细胞存活率为63.05%;药物浓度为10.00mg/mL时,4T1细胞存活率为20.30%,随着给药浓度的增加,细胞存活率呈明显下降趋势。实验组药物浓度为6.25mg/mL时,细胞凋亡率为11.4%;药物浓度为10.00mg/mL时,细胞凋亡率为41.7%,随着给药浓度的增加,细胞凋亡率明显增加。结论苦豆子总生物碱能诱导细胞凋亡,对小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖有明显抑制作用。

二甲双胍单用或联合compoundC对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖和细胞周期蛋白D1表达的影响

目的研究二甲双胍及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂(compound C)对体外培养的小鼠乳腺癌4T1细胞株增殖抑制及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的影响,进一步探索AMPK通路在二甲双胍抗肿瘤的可能作用。方法体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞株至对数生长期,分别以2.5、5、10、20、40 mmol/L二甲双胍及20μmol/L compound C对其进行单一或10 mmol/L二甲双胍联合20μmol/L compound C干预24、48、72 h。应用CCK-8方法检测不同浓度的二甲双胍、20μmol/L compound C、20μmol/L compound C+10 mmol/L二甲双胍对该细胞株增殖的抑制情况;Western blot法检测各组细胞内cyclin D1的表达情况。多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验,治疗前后用重复测量数据资料的方差分析。结果 CCK-8法结果显示在体外细胞培养实验中2.5 mmol/L二甲双胍组作用于该细胞株24、48 h后分别和正常对照组比较,细胞存活率差异无统计学意义(24 h:F=2.87,P=0.129;48 h:F=1.63,P=0.290),作用72 h后,差异有统计学意义(F=6.40,P=0.000)。5、10、20、40 mmol/L二甲双胍组作用于该细胞株24、48、72 h后,该细胞株的增殖被显著抑制(均P=0.000),且抑制程度随着药物浓度的增大(F=332.89、363.54、352.11,P均=0.000)及作用时间的延长而逐渐增强,compound C单独处理组及10 mmol/L二甲双胍联合20μmol/L compound C处理细胞24、48、72 h后,细胞存活率与正常对照组相比较,差异无统计学意义(F=1.08,P=2.283;F=1.92,P=0.050)。Western blot结果显示随着二甲双胍浓度的增加,各组细胞cyclin D1表达水平逐渐降低(F=54.41、61.69、75.84,P均=0.000),10 mmol/L二甲双胍联合20μmol/L compound C作用时,与正常对照组比较,cyclin D1表达水平无明显变化(F=1.87,P=0.190)。结论二甲双胍可以抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖;compound C可以拮抗二甲双胍的抑制作用;二甲双胍通过激活小鼠乳腺癌4T1细胞内AMPK,下调cyclin D1蛋白表达。

阻断DKK1通过促进CD4^(+)T细胞Th1型极化改善抗肿瘤免疫应答

目的:探讨恶性肿瘤中Dickkopf-1(DKK1)表达对CD4^(+)T细胞极化的影响及其作为肿瘤免疫治疗靶点的潜在价值。方法:利用生物信息学方法分析DKK1在多种类型肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平,分析DKK1表达与肿瘤患者预后及肿瘤微环境免疫浸润间的相关性。利用流式细胞术检测DKK1蛋白对CD4^(+)T细胞表型变化的影响。构建黑色素瘤B16F10细胞小鼠皮下移植瘤模型,观察阻断DKK1对小鼠移植瘤生长和移植瘤组织中免疫细胞浸润与表型的影响。结果:DKK1 mRNA表达水平在多种肿瘤组织中显著高于癌旁组织,DKK1高表达与多数肿瘤患者的不良预后相关且在多数肿瘤中DKK1对CD4^(+)T细胞抗肿瘤免疫应答功能有重要负性调节作用(P<0.05或P<0.01)。流式细胞术检测结果显示,DKK1蛋白刺激可显著降低CD4^(+)T细胞中T-bet、IFN-γ及CD107a表达水平(均P<0.01)。在小鼠皮下黑色素瘤模型中发现,阻断DKK1可以显著抑制小鼠移植瘤的生长(P<0.01),有效改善抗肿瘤免疫应答,表现为Th1细胞(T-bet+CD4^(+))占比显著升高(P<0.001),效应性CD8^(+)T细胞(CD44+CD62L-)占比显著升高(P<0.01),Th2细胞(GATA3^(+)CD4^(+))与Treg细胞占比显著下降(均P<0.01)。结论:阻断DKK1可有效促进CD4^(+)T细胞向Th1型极化,DKK1具有作为肿瘤免疫治疗靶点的潜在价值。

消化性溃疡患者HMGB1、PINP和CD_(4)^(+)T细胞变化及与Hp感染的关系

目的探讨消化性溃疡患者高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、I型原胶原N端前肽(PINP)和CD_(4)^(+)T细胞变化及与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系。方法选择2019年9月—2021年9月我院收治的消化性溃疡患者97例作为研究对象,根据是否Hp感染分为Hp阳性组(n=63)与Hp阴性组(n=34);另选择同期我院健康体检者60例作为对照组。采用酶联免疫吸附法测定HMGB1和PINP水平;采用流式细胞仪测定CD_(4)^(+)T细胞水平。比较消化性溃疡组与对照组HMGB1、PINP和CD_(4)^(+)T细胞水平;不同Hp感染HMGB1、PINP和CD_(4)^(+)T细胞水平;采用Pearson分析Hp感染与HMGB1、PINP和CD_(4)^(+)T细胞相关性;采用多因素Logistic回归分析HMGB1、PINP和CD_(4)^(+)T细胞与Hp感染的关系。结果消化性溃疡组HMGB1水平高于对照组,PINP和CD_(4)^(+)T细胞水平低于对照组(P<0.05)。Hp阳性组HMGB1水平高于Hp阴性组,PINP和CD_(4)^(+)T细胞水平低于Hp阴性组(P<0.05)。经Pearson分析,HMGB1与Hp感染呈线性正相关,PINP和CD_(4)^(+)T细胞与Hp感染呈线性负相关(P<0.05)。经多因素Logistic回归分析HMGB1、PINP和CD_(4)^(+)T细胞为影响Hp感染危险因素。结论消化性溃疡患者HMGB1水平升高,PINP和CD_(4)^(+)T细胞水平下降,且与Hp感染密切相关,为影响Hp感染的危险因素。

肾透明细胞癌来源的IL4I1介导PD1^(+)CD8^(+)T淋巴细胞募集的相关研究

目的:探讨肾透明细胞癌(ccRCC)来源的白细胞介素4诱导蛋白1(IL4I1)对表达PD1的CD8^(+)肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的诱导与募集作用。方法:利用公共数据库分析ccRCC组织中IL4I1的表达与CD8^(+)T淋巴细胞浸润及免疫功能相关分子表达的关系,通过免疫组织化学法进行验证;构建过表达IL4I1蛋白的769P细胞系并验证;荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测过表达IL4I1 ccRCC细胞表达趋化因子的变化。结果:高表达IL4I1的ccRCC组织中有更多的CD8^(+)T淋巴细胞浸润(P=6.843×10^(-7)),其浸润水平与IL4I1的表达水平呈正相关(r^(2)=0.5764,P<0.001);且浸润的CD8^(+)T细胞多表达抑制型分子PD1。过表达IL4I1的ccRCC 769P细胞所表达的趋化因子配体(CCL2、CCL4、CCL5、CCL17)在mRNA水平显著下调(t=95.16、116.1、21.28、68.47,均P<0.05)。同时,细胞培养上清中CCL4、CCL5浓度明显升高(t=6.760、6.846,均P<0.05)。结论:ccRCC组织中IL4I1与PD1+CD8^(+)T淋巴细胞浸润密切相关,可能通过调控趋化因子的表达,参与免疫抑制型CD8^(+)T淋巴细胞在肿瘤局部的募集。

黄芪甲苷Ⅳ通过抑制TIM-1信号通路增加Th1/Th2细胞比率减轻IgA肾病小鼠肾损伤

目的探讨黄芪甲苷Ⅳ(AS-Ⅳ)对IgA肾病(IgAN)小鼠1型辅助T(Th1)细胞/Th2细胞平衡的影响及其可能作用机制。方法建立BALB/c小鼠IgAN模型,造模成功小鼠随机分为模型组、AS-Ⅳ低、中和高剂量组各10只,另设对照组10只。AS-Ⅳ低、中和高剂量组小鼠灌胃(12.5、25、50)mg/kg AS-Ⅳ混悬液(生理盐水配制),对照组及模型组给予等量生理盐水。测定各组小鼠24 h尿蛋白(24 hUPr)含量和尿红细胞计数;测定小鼠血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)和白蛋白(ALB)水平;ELISA检测各组小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和IL-10水平;流式细胞术检测小鼠外周血Th1/Th2细胞比率;HE染色观察小鼠肾组织病理学变化;反转录PCR和Western blot法分别检测小鼠肾组织中T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域1(TIM-1)、Toll样受体4(TLR4)的mRNA和蛋白表达。结果与模型组比较,AS-Ⅳ低、中和高剂量组小鼠第12周和第15周尿红细胞计数、24 h UPr、BUN、Scr、IL-4、IL-10水平、Th2细胞比例、TIM-1与TLR4 mRNA和蛋白表达水平均明显降低,ALB、IFN-γ水平、Th1细胞比例和Th1/Th2细胞比率升高,且以AS-Ⅳ高剂量组效果最佳。结论AS-Ⅳ通过抑制TIM-1信号通路,增加Th1/Th2细胞比率,抑制炎症反应,减轻IgAN小鼠肾损伤。