小鼠Agouti基因和毛色表型相关问题及其遗传变异探究

目的对小鼠Agouti基因和毛色表型相关问题及其遗传变异情况进行分析探讨。方法抽取存在毛色差异的8个染色体工程小鼠作为研究对象,经电脑测色配色仪对品系、C3H/He小鼠毛色进行检测,并对检测结果进行统计分析。结果所抽取的8个品系K/S值分别处在C3H/He小鼠的K/S值两侧,按照C3H/He小鼠的K/S值划分界限,将抽取的8个品系小鼠划分成浅灰色、深灰色两个类型,DNA芯片分析发现,有一个鼠灰色相关基因Agouti,将Agouti基因作为候选基因,经Sanger法对候选基因c DNA序列进行检测。结果发现,Agouti基因开放读码框长396bp,编码131个氨基酸的Agouti信号蛋白。结论在候选基因Agouti编码区检测到突变(R96G)为重要错义突变,对α-MSH结合受体MC1R等能力进行了抑制,导致Agouti小鼠毛色偏向于黑色。

小鼠Agouti基因变异及生物信息学分析

目的分析候选基因Agouti的多态性,揭示染色体工程小鼠毛色差异的分子机制。方法首先,用测色仪检测小鼠的毛色差异。其次,利用DNA芯片进行全基因组扫描确定候选基因Agouti。最后,运用生物信息学软件分析Agouti基因cDNA序列和氨基酸序列的多态性,预测突变对蛋白结构和功能产生的影响。结果发现Agouti基因cDNA序列上存在5个SNPs,使Agouti信号蛋白产生了3个错义突变。生物信息学分析发现,其中一个错义突变使该蛋白丢失了一个β折叠,并且其三级结构发生改变,最终导致与受体结合的能力相较于野生型有所下降。结论在毛色基因Agouti的编码区发现了一个新的错义突变,该突变使Agouti信号蛋白与受体结合能力下降,最终导致小鼠的毛色由浅灰色变为深灰色。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

绿原酸通过基因编码基质相互作用分子/钙释放激活钙调节蛋白通路改善糖尿病小鼠动脉粥样硬化的机制

目的探讨绿原酸(CGA)通过基因编码基质相互作用分子1(Stim1)/钙释放激活钙调节蛋白1(Orai1)通路改善糖尿病小鼠动脉粥样硬化(AS)的机制。方法将30只C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、模型组、CGA组,每组各10只。采用高脂饲料饲养加腹腔注射50 mg/kg的链脲佐霉素(STZ)建立糖尿病AS小鼠模型,对照组采用普通饲料+等量生理盐水,CGA组建立模型后给予CGA干预,模型组给予等量生理盐水。HE染色、油红O染色观察动脉斑块情况;CCK-8检测主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖活力;qPCR检测Stim1、Orai1表达水平。结果CGA组、模型组的斑块沉积面积大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而CGA组的斑块沉积面积小于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、CGA组的VSMCs增殖率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而CGA组的VSMCs增殖率低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、CGA组的Stim1、Orai1水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而CGA组的Stim1、Orai1水平低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CGA能够改善糖尿病AS及VSMCs增殖,其机制可能与调节Stim1/Orai1通路有关。

肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠模型的构建

目的运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3^(Δhep))小鼠,为研究肝细胞Sirt3基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型。方法将loxP标记的Sirt3 ^(flox/flox)小鼠与Alb-Cre纯合子(Alb-Cre^(+/+))小鼠进行交配,F1代Sirt3^(flox/-)/Alb-Cre^(+/-)小鼠再与Sirt3^(flox/flox)小鼠进行交配并鉴定,F2代基因型为Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(+/-)的小鼠即为本实验所构建的Sirt3^(Δhep)小鼠,Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(-/-)小鼠即为对照小鼠Sirt3 ^(flox/flox)小鼠。提取鼠尾DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;免疫荧光双染观察Sirt3在小鼠肝细胞中的表达;提取Sirt3^(Δhep)小鼠原代肝细胞及心脏、脾脏、肾脏、肺组织蛋白,Western blot法验证Sirt3在小鼠肝细胞及其他组织中的表达水平;HE染色观察小鼠肝脏及心脏、脾脏、肺等组织结构。结果成功鉴定出Sirt3^(Δhep)小鼠;免疫荧光及Western blot结果显示,小鼠肝细胞中Sirt3蛋白表达水平低于对照组小鼠(P<0.01),而Sirt3^(Δhep)小鼠的心脏、脾脏、肾脏和肺组织中Sirt3表达与对照组相比无明显变化(P>0.05);HE染色结果显示Sirt3^(Δhep)小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺、肾脏的组织学特征与对照组小鼠相比无明显变化。结论成功构建肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠,为进一步研究肝细胞Sirt3基因在相关疾病中的调控作用机制奠定了基础。

聚碳酸酯、聚乙烯微塑料对小鼠小肠结构与屏障基因的影响

目的探究食源性微塑料聚碳酸酯(polycarbonate,PC)、聚乙烯(polythylene,PE)对小鼠小肠结构、肠道屏障基因表达的影响。方法4周龄的小鼠分为正常饮食组(对照组),高浓度PE(30 g/kg鼠粮)添加组(HPE组),高浓度PC(30 g/kg鼠粮)添加组(HPC组),低浓度PE(3 g/kg鼠粮)添加组(LPE组),低浓度PC(3 g/kg鼠粮)添加组(LPC组),饲喂4周。剖检,采集小鼠十二指肠、空肠、回肠制作石蜡切片,观察微塑料对小肠显微结构的影响。定量聚合酶链反应法测定小鼠各肠段屏障基因相对表达量。结果相比于对照组,实验组的小鼠普遍绒毛高度降低、表面积减小,隐窝深度增加,绒毛高度与隐窝深度的比值变小,结果呈剂量依赖的关系。与PC组相比,PE组对小肠的显微结构影响更显著。PC、PE会使小鼠十二指肠、回肠屏障基因Claudin-1、Claudin-2、Claudin-7的表达量大部分下调,而小鼠空肠屏障基因Claudin-1、Claudin-2、Claudin-7、Claudin-15、Zone occludens 1(ZO-1)的表达量大部分上调。PC、PE微塑料使十二指肠、空肠、回肠屏障基因Occludin表达量大部分都上调。结论PC、PE损伤了小鼠小肠显微结构,改变了肠道屏障基因的表达,调节肠道屏障功能。

基于基因共表达网络分析氧诱导小鼠视网膜新生血管模型免疫相关靶基因

目的:通过生物信息学方法探究氧诱导小鼠视网膜新生血管(OIR)模型中与免疫相关的关键基因以及免疫细胞浸润水平。方法:从GEO数据库获取基因芯片数据集,采用R语言环境中“limma”包获得差异表达基因(DEGs),并进行GO功能富集和KEGG通路分析,基于CIBERSORT算法进行数据集免疫细胞浸润分析,通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选与免疫相关基因模块中的DEGs,利用STRING在线数据库及Cytoscape软件构建蛋白质互作(PPI)网络,利用cytoHubba模块筛选出最终的靶基因。结果:筛选出467个表达具有显著差异性的基因,其中270个基因表达上调,197个基因表达下调。免疫浸润分析结果显示仅辅助型T细胞2(Th2 cells)高表达,且差异具有显著性(P<0.05)。WGCNA分析后,与免疫最相关模块中差异基因为66个,构建PPI网络后利用插件筛选出5个关键基因,即血管性血友病因子(vWF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、Serping1、凋亡诱导因子1(AIF1)以及信号传导蛋白和转录激活物(STAT3)。结论:采用生物信息学的方式进行OIR模型的免疫细胞浸润分析及筛选出与免疫相关的关键基因,可为视网膜新生血管性疾病的进一步研究与诊疗提供依据。

不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。

降钙素基因相关肽在胃溃疡模型小鼠穴位敏化中的作用研究

目的从分子生物学的角度,探讨降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在慢性胃溃疡模型小鼠穴位敏化过程中的作用。方法将C57BL/6小鼠随机分为对照组和模型组,每组15只,将冰乙酸溶液于胃小弯近幽门处注射到胃壁肌层近黏膜下层构建慢性胃溃疡模型,随后在小鼠尾静脉上注射伊文思蓝,观察穴位敏化点的体表分布规律;HE染色法观察胃部组织在造模前后的病理形态变化;通过体表痛敏行为学实验,观察小鼠痛觉阈值的改变;蛋白质印迹法、免疫荧光染色法检测穴位敏化后脊髓、背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)和皮肤中的CGRP表达。结果通过向小鼠胃部注射冰乙酸可诱导其形成符合胃溃疡典型病理特征的动物模型;对照组EB渗出点较少,模型组EB渗出点分散于脊髓T_(1)~T_(13)节段支配区域,其中以T_(9)~_(T11)区域最为集中,且其伊文思蓝渗出点压痛阈较造模前显著降低(P<0.01)。穴位敏化后模型组的脊髓、DRG和皮肤中的CGRP蛋白和荧光蛋白阳性表达显著高于对照组(P<0.01)。结论冰乙酸诱导小鼠形成胃溃疡后,其胃部组织病变所对应的体表敏化区、相应的脊髓T9~T11节段和DRG神经元中CGRP表达增高,可能是引起外周和中枢痛觉敏化,使体表局部出现神经源性炎性反应,介导穴位敏化的原因。

AKR7A5基因敲除对雄性小鼠生殖的影响

通过分析野生型和AKR7A5基因敲除型雄性小鼠的睾丸、附睾系数及其组织形态、精子活力和生育力,探讨AKR7A5基因对雄性生殖系统的影响。结果发现:AKR7A5基因敲除型与野生型小鼠睾丸、附睾系数及其组织形态无明显差异;AKR7A5基因敲除型小鼠与野生型小鼠相比,其精子浓度、直线前游总数、直线运动精子、前向运动精子、平均路径运动速度和平均曲线运动速度显著降低,不运动精子显著增加(P<0.01);总产仔数显著降低(P<0.01)。综上,AKR7A5基因敲除影响小鼠成熟精子的数量和活力,降低总产仔数。

核定位人源α-突触核蛋白转基因小鼠的建立

目的 建立一种核定位人源α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)转基因小鼠,并探究人源α-syn核输入对小鼠行为的影响。方法 构建hSNCA-NLS和EGFP的慢病毒载体,利用显微注射法建立转基因小鼠模型,通过PCR和Western Blot方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型和蛋白表达情况。采用免疫荧光鉴定人源α-syn在小鼠脑组织中的共定位情况,同时采用旷场、转棒、O迷宫实验评价转基因小鼠的行为改变情况。结果 hSNCA-NLS基因成功插入小鼠基因组中,人源α-syn成功表达,并且有明显的核定位现象。进一步研究发现,核定位人源α-syn转基因小鼠在2月龄时开始表现出了运动功能障碍,发生了星形胶质细胞增生和炎症反应,于9月龄时表现出了明显的焦虑样症状,γ-氨基丁酸(GABA)基因表达减少,这些表现一直持续到小鼠12月龄。结论 成功构建了核定位人源α-syn转基因小鼠,小鼠表现出明显的运动功能障碍和焦虑样症状。该模型的成功建立可以为研究α-syn核定位现象在帕金森病中的作用提供一定的研究基础。

Apc⁃Kras⁃Cre肠腺瘤转基因小鼠模型构建

目的探讨构建Apc⁃Kras⁃Cre肠腺瘤小鼠模型最佳他莫昔芬诱导方式,建立小鼠模型。方法以C57BL/6J野生型小鼠为健康的对照组。以不同浓度、剂量、给药时长他莫昔芬腹腔注射于转基因小鼠,即组1以低剂量他莫昔芬(5 mg/kg)给药1 d,组2以低剂量他莫昔芬(5 mg/kg)给药3 d,组3以高剂量他莫昔芬(50 mg/kg)给药1 d,组4以高剂量他莫昔芬(50 mg/kg)给药3 d,给药4周后观察各组小鼠生存率、体重变化,药物诱导4周后观察各组小鼠肠道长度变化、肠内腺瘤生长数量以及大小,再通过苏木精伊红染色、显微镜下观察肠道组织、腺瘤的生理情况。结果第一部分实验发现雌鼠生存率低于雄鼠(P<0.001),死亡率高于雄鼠(P<0.05),各组不同浓度与剂量之间比较生存率差异具有统计学意义(P<0.01)。各组小鼠体重变化与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.001),组1与组2,组2与组3,组1与组4之间差异各具统计学意义(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。各组小鼠大肠长度与对照组相比未具统计学意义(P>0.05),组1与组3差异具有统计学意义(P<0.05)。各组小鼠大肠内都长有腺瘤,多数于结肠远端,组3与组4腺瘤较多也较大。给药组小鼠大肠病理情况与健康对照组相比出现腺瘤生长,腺体组织排列紊乱、上皮细胞排列不齐,肠道黏膜屏障松散,隐窝分歧不规则,组3、组4也有炎症发生,组4部分区域发现细胞坏死。结论他莫昔芬诱导Apc⁃Kras⁃Cre肠腺瘤转基因小鼠造模成功,并且由此判断,他莫昔芬浓度10 mg/mL、5 mg/kg的剂量诱导1 d的诱导方式最为合适。

超声应变技术评估PCSK9基因敲除对肥胖小鼠心肌功能的影响

目的应用超声应变技术评估PCSK9基因敲除对肥胖小鼠心肌功能的影响,并探讨其机制。材料与方法选取6周龄野生型C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为正常组和肥胖组,各10只;选取6周龄PCSK9^(-/-)C57BL/6雄性小鼠10只为PCSK9^(-/-)组。肥胖组和PCSK9^(-/-)组给予高脂饲料造模,正常组给予普通饲料,12周后从肥胖组和PCSK9^(-/-)组中选取造模成功小鼠,3组小鼠行心脏超声、透射电镜及免疫荧光染色进行观察。结果肥胖组、正常组和PCSK9^(-/-)组小鼠室间隔舒张末期厚度分别为(0.98±0.13)mm、(0.77±0.07)mm、(0.78±0.13)mm,差异有统计学意义(F=5.10,P=0.02),肥胖组较正常组增厚(t=2.73,P<0.05),PCSK9^(-/-)组较肥胖组变薄(t=-2.92,P<0.05)。3组左心室整体纵向应变及整体圆周应变差异有统计学意义(F=7.44、15.40,P<0.05),其中肥胖组较正常组整体纵向应变和整体圆周应变减低(t=3.79、5.50,P<0.05),PCSK9^(-/-)组较肥胖组整体纵向应变和整体圆周应变升高(t=-2.53、-3.37,P<0.05)。电镜及免疫荧光结果显示,肥胖组心肌超微结构受损,NLRP3及Caspase-1表达较正常组增多(t=12.53、-4.73,P<0.05),PCSK9^(-/-)组心肌超微结构受损明显改善,NLRP3及Caspase-1表达较肥胖组减少(t=-6.23、2.05,P<0.05)。结论超声应变技术较常规心脏超声参数能更敏感地发现PCSK9基因敲除肥胖小鼠心肌功能的改变;PCSK9基因敲除后可能通过抑制NLRP3及Caspase-1表达改善肥胖小鼠心肌功能。

基于转录组学与加权基因共表达网络分析探讨降脂轻身胶囊介导NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号轴改善高脂血症小鼠的作用及机制

目的基于转录组学与加权基因共表达网络分析(WGCNA)探讨降脂轻身胶囊介导NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号轴改善高脂血症的作用机制。方法将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、瑞舒伐他汀组(1.3 mg·kg^(-1))及降脂轻身胶囊低、高剂量组(0.6、2.4 g·kg^(-1)),每组8只。除对照组给予普通饲料外,其余各组给予高脂饲料维喂养,以复制高脂血症模型。各给药组小鼠每日按上述剂量灌胃给药,每日1次,连续干预10周。称取小鼠肝脏质量并计算肝脏指数、Lee’s指数、肝脏胫骨比值;采用HE染色、油红O染色法观察肝脏组织病理学变化;ELISA法检测血清生化指标:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白细胞介素(IL)-18、IL-1β;采用博奥晶典小鼠真核转录组芯片V4对肝脏组织进行转录组测序,并进行芯片表达信息与血脂水平性状信息的加权基因共表达网络分析;分析得到降脂轻身胶囊干预高脂血症的核心基因群(潜在作用靶点),并进行蛋白质互作(PPI)网络分析及GO功能、KEGG通路富集分析;采用RT-qPCR法检测肝脏组织NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1βmRNA表达水平;免疫荧光法检测肝组织中NF-κB、NLRP3、Caspase-1蛋白表达。结果与模型组比较,降脂轻身胶囊能明显降低高脂血症小鼠的体质量、肝湿质量、肝指数、Lee’s指数、肝脏胫骨比值(P<0.05);有效减轻高脂血症小鼠肝组织炎性浸润及脂肪变性,明显减少脂质沉积面积(P<0.05);明显降低血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST、IL-18、IL-1β水平(P<0.05);明显下调肝组织中NF-κB、NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表达(P<0.05),降低肝组织中IL-18、IL-1βmRNA表达水平(P<0.05)。转录组学与加权基因共表达网络分析显示,降脂轻身胶囊对血脂的调控作用与炎症通路密切相关。结论降脂轻身胶囊能够调节NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号轴抑制高脂血症小鼠肝组织炎症反应,进而改善高脂血症小鼠的血脂水平。

胚胎期Wnt3a基因特异性敲降对小鼠大脑神经发生的影响

目的 研究胚胎期第13天(E13)特异性敲降Wnt3a基因对小鼠大脑神经发生的影响。方法 利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证Wnt3a在脑皮质神经干细胞中的敲降率。通过子宫内电穿孔实验在E13时将Wnt3a-shRNA质粒电转到胎鼠大脑皮质中,从而下调Wnt3a在脑皮质神经干细胞中的表达。在E16时收取小鼠脑组织,进行免疫荧光染色检测,观察下调Wnt3a后小鼠脑组织中神经元发育进程的改变。结果 RT-qPCR结果显示,神经干细胞中Wnt3a敲降后其mRNA表达水平降低54%,与对照组相比差异具有统计学意义(t=11.260,P<0.001)。免疫荧光染色结果显示,Wnt3a下调导致大脑皮质的皮质板(CP)中的绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞比例降低,大脑中间带(IZ)的GFP阳性细胞比例上升,差异均具有统计学意义(t=4.400、4.482,P<0.01)。结论 E13时特异性下调小鼠脑中Wnt3a基因导致GFP荧光分布异常,神经发生过程受到干扰。

两种肌少症小鼠模型的功能表型、肌肉质量及力量特点比较

背景:地塞米松和后肢悬吊是常用的动物肌少症造模方法,具有造模时间短、操作简便、成本低等特点。目的:比较地塞米松和后肢悬吊诱导小鼠肌少症模型在肌肉质量、力量及功能表型以及分子机制表型方面的差异。方法:采用随机抽样法将30只C57BL/6小鼠随机分成3组,每组10只:正常对照组不进行任何干预;地塞米松组小鼠腹腔注射地塞米松磷酸钠溶液1 mg/(kg•d),连续注射6周,建立肌少症模型;后肢悬吊组采用鼠尾套悬吊小鼠后肢16 h,1次/d,连续悬吊6周,建立肌少症模型。造模6周内,监测小鼠体质量变化;造模6周后,检测小鼠四肢抓力、活动能力(游泳实验)、骨骼肌湿质量、骨骼肌病理形态,采用RT-PCR与Western blot检测骨骼肌蛋白质合成与分解代谢指标、AMPK/FoXO3α信号通路的表达。结果与结论:①从造模后第2周开始,地塞米松组、后肢悬吊组小鼠体质量均低于正常对照组(P<0.05)。②造模6周后,与正常对照组相比,造模两组小鼠四肢抓力均下降(P<0.05),腓肠肌湿质量、趾长伸肌湿质量、腓肠肌与比目鱼肌横截面积均下降(P<0.05);地塞米松组小鼠腓肠肌横截面积明显小于后肢悬吊组(P<0.05),比目鱼肌横截面积大于后肢悬吊组(P<0.05);与正常对照组、后肢悬吊组相比,地塞米松组小鼠活动能力降低(P<0.05)。③与正常对照组相比,造模两组PI3K、mTOR、AMPK、PGC-1αmRNA表达与p-AMPK/AMPK蛋白均降低(P<0.05),FoXO3αmRNA表达与PGC-1α、FoXO3蛋白表达均升高(P<0.05);地塞米松组Akt1 mRNA表达降低(P<0.05),Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表达升高(P<0.05);后肢悬吊组Akt1 mRNA表达升高(P<0.05)。④与地塞米松组相比,后肢悬吊组mTOR、Akt1、FoXO3αmRNA表达升高(P<0.05),Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表达降低(P<0.05)。⑤结果表明,两种造模方法均会导致骨骼肌线粒体能量代谢水平下降,地塞米松组通过泛素蛋白酶体和能量代谢途径的双重作用介导骨骼肌发生萎缩,后肢悬吊组通过AMPK/FoXO3α信号通路介导能量代谢途径引起骨骼肌发生萎缩,从而引起骨骼肌的质量、力量及功能下降。

靶向小鼠Star基因的CRISPR/Cas9系统构建与打靶效力评价

目的利用CRISPR/Cas9系统对小鼠Star基因进行精确编辑,构建模拟人类STAR基因突变的细胞模型。方法选择中国先天性类脂质性肾上腺皮质增生症(CLAH)患者的热点突变区域,并设计相应的单导向RNA(sgRNA)。构建表达sgRNA的重组质粒,将其与慢病毒包装质粒共同转染至HEK-293T细胞并制备慢病毒颗粒以感染小鼠TCMK细胞。采用嘌呤霉素进行病毒感染后阳性细胞的筛选,提取阳性细胞的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目标位点的基因组DNA片段,并利用TA克隆和Sanger测序技术,对编辑位点与效率进行统计分析。结果成功设计了有效的sgRNA序列,并利用CRISPR/Cas9系统成功构建了编辑小鼠Star基因的细胞模型。结论本研究通过精确编辑小鼠Star基因,成功构建了模拟人类STAR基因突变的CRISPR/Cas9系统,为深入研究CLAH的致病机制及探索潜在治疗方法提供有力工具,具有重要的科学意义和应用价值。

Sirtuins基因家族及其剪接体在小鼠性腺的时空表达谱研究

为了研究Sirtuins基因家族候选剪接体在1~8周龄雄性和雌性小鼠性腺的时空表达模式,试验采用半定量PCR方法评估了不同周龄雄性和雌性小鼠性腺Sirt1、Sirt2、Sirt5、Sirt6和Sirt7基因候选剪接体的表达水平。结果表明:性腺Sirt1、Sirt2、Sirt6基因的不同剪接体呈现不同的时空表达谱。卵巢和睾丸Sirt1.1、Sirt1.2基因在6周龄相对表达量极显著低于4周龄(P<0.01),卵巢Sirt1.2基因和睾丸Sirt1.1、Sirt1.2基因在8周龄显著高于6周龄(P<0.05)。卵巢和睾丸Sirt2.1基因相对表达量在4周龄显著或者极显著低于2,6,8周龄(P<0.05或P<0.01)。卵巢Sirt2.2基因相对表达量在4周龄显著高于2周龄且显著低于6周龄(P<0.05),8周龄显著高于6周龄(P<0.05);睾丸Sirt2.2基因相对表达量在8周龄时极显著高于2周龄(P<0.01),显著高于4,6周龄(P<0.05)。睾丸Sirt2.3基因相对表达量在4周龄时显著低于2,6,8周龄(P<0.05)。卵巢Sirt2.4基因相对表达量在4周龄显著高于2周龄(P<0.05),显著低于6,8周龄(P<0.05);睾丸Sirt2.4基因相对表达量在4周龄极显著低于2,6,8周龄(P<0.01),而6周龄极显著高于8周龄(P<0.01)。卵巢Sirt5基因相对表达量6,8周龄显著高于2,4周龄(P<0.05),睾丸Sirt5基因相对表达量在各周龄间差异不显著(P>0.05)。卵巢Sirt6.1基因相对表达量在2周龄极显著高于4,6,8周龄(P<0.01);卵巢Sirt6.2基因相对表达量在2周龄极显著高于4,6周龄(P<0.01),显著高于8周龄(P<0.05),8周龄极显著高于4,6周龄(P<0.01)。睾丸Sirt6.1、Sirt6.2基因相对表达量的趋势相近,均是在2,4,6周龄逐渐下降,8周龄极显著升高(P<0.01)。卵巢Sirt7.1基因相对表达量随周龄增长而降低,睾丸Sirt7.1基因相对表达量在2,4周龄显著高于6,8周龄(P<0.05)。说明Sirt1、Sirt2、Sirt6及其剪接体在小鼠性腺存在不同的时空表达谱,这些不同剪接体在雌雄小鼠性腺发育各阶段可能发挥不同的功能。

小鼠囊胚在孵化期间关键基因表达动态变化

为探索囊胚孵化发育中关键基因的表达规律、进一步解析妊娠识别机制,以小鼠囊胚为模型,对孵化进程中不同时期的囊胚进行转录组分析,并对关键基因表达量进行qPCR检测,对关键蛋白表达模式进行免疫荧光染色。转录组分析发现小鼠囊胚从扩张、孵化到完成孵化的孵化过程,差异基因表达呈2种调控模式,对调控模式中的基因集进行GO分析、KEGG分析,发现涉及免疫与炎症、细胞分化、凋亡过程等生物过程。qPCR结果显示Ptgs1、Lyz2、Il-1α、Cfb、Ccl9表达上调,Cd36表达下调,结果与转录组分析一致。免疫荧光染色分析发现Plac1、Cdx2、C3在小鼠囊胚孵化过程中表达下调,Lyz2、Il-1β则表达上调。以上研究结果表明小鼠囊胚在孵化进程中,基因表达呈特定的分化动态,异常基因表达将导致孵化停滞。

ABI3BP基因敲除小鼠模拟低出生体重模型的初步探讨

目的利用ABI3BP基因敲除小鼠模型观察出生后其体重及糖代谢变化特点,为低出生体重小鼠模型提供新的选择。方法利用杂合子交配得到ABI3BP基因敲除的纯合子(ABI3BP^(-/-))、杂合子(ABI3BP^(+/-))和野生型(WT)3组小鼠,观察出生后不同时间点体重及成年后重要脏器体重比,检测成年小鼠空腹血糖、糖耐量及胰岛素耐量等糖代谢指标。结果ABI3BP^(-/-)小鼠PCR产物基因测序结果显示敲除区域产生移码突变,RT-qPCR检测显示,ABI3BP^(-/-)小鼠ABI3BP在mRNA水平上表达显著低于WT小鼠。体重测量显示,ABI3BP^(-/-)小鼠出生时体重(1.25±0.08 g)显著低于WT小鼠(1.34±0.12 g)(P<0.05),但成年(120 d)ABI3BP^(-/-)小鼠体重(27.70±1.93 g)反而显著高于WT小鼠(23.64±1.34 g)(P<0.01),但重要脏器与体重的比值,各组小鼠之间无显著性差异(P>0.05)。空腹血糖及胰岛素耐量实验显示各组小鼠之间无显著性差异,但糖耐量实验表明ABI3BP^(-/-)小鼠在腹腔注射葡萄糖后15 min时血糖(15.68±7.04 mmol/L)低于WT小鼠(23.01±5.75 mmol/L)。结论ABI3BP基因敲除小鼠呈现低出生体重、生长追赶及成年后糖耐量异常等临床低出生体重新生儿的生长特点,可作为低出生体重小鼠模型的选择之一。