冬凌草甲素增强对小鼠H22肝癌细胞免疫杀伤作用的实验性研究

为阐明冬凌草甲素(ORI)抗小鼠H22肝癌中的T细胞免疫应答机制,本研究利用C57/BL6小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型,随机分为荷瘤对照组(PBS组)、ORI高、中、低剂量处理组(75、50、25mg·kg^(-1)·d^(-1))、阳性对照组(5-Fu组)和空白组(NC组),连续腹腔注射给药12d后处死。以瘤重、抑瘤率观察ORI对移植瘤生长的影响;用乳酸脱氢酶释放法检测对小鼠H22细胞杀伤活性;流式细胞术检测小鼠脾脏细胞中CD4^+T细胞分泌IL-17、IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子能力,并检测CD8^+T和CD4^+T细胞表面PD-1的表达。结果显示:低、中、高剂量ORI处理组和荷瘤对照组比较均有显著性缩小(P<0.05);ORI能明显提高荷瘤小鼠脾脏细胞对H22细胞的杀伤活性(P<0.05);抑制CD4^+T细胞中细胞因子的分泌,尤其对IL-17和IL-2的抑制最为明显,对TNF-α和IFN-γ抑制在ORI高浓度情况下发挥作用;同时,ORI处理组中CD8^+T细胞的PD-1表达降低,而CD4^+T细胞表面PD-1的表达呈现一定程度的上调。上述结果表明ORI对小鼠H22肿瘤具有明显的体内抑瘤作用,除了直接的杀伤作用外,ORI还可以通过提高CD8^+T的杀伤作用,降低CD4^+T细胞的炎症特性发挥抗肿瘤免疫应答功效,其中的可能机制是影响两种细胞表面PD-1的表达。因此,ORI还可通过协同T细胞抗肿瘤免疫应答机制促进对肿瘤的抑制作用。

沙冬青提取物(JA1)对小鼠肝癌H_(22)细胞体外增殖和皮下移植生长的抑制

采用噻唑蓝(MTT)还原法测定梯度浓度的沙冬青提取物(JA1)对体外培养小鼠肝癌细胞株H22增殖的影响;同时对皮下移植肿瘤H22小鼠灌服不同剂量的JA1以检测抑瘤率,进一步采用流式细胞术、光镜和透射电子显微镜技术,检测和观察JA1对小鼠移植性肿瘤H22的诱导凋亡作用。结果显示,JA1可显著抑制体外培养小鼠肝癌H22细胞的增殖,并且这种抑制存在浓度和时间关系。同时,JA1对小鼠皮下移植性肿瘤H22也有明显的抑制作用。流式细胞分析表明,JA1灌胃试验组瘤组织细胞DNA直方图上见有明显的凋亡峰;在光镜和电镜下,JA1灌胃试验组也见有明显的瘤细胞凋亡,表明JA1对体内、外H22细胞的增殖抑制是以诱导凋亡为基础的。

含硒桥联环糊精诱导体外培养H22小鼠肝癌细胞凋亡的作用

目的:研究含硒桥联环糊精(2-SeCD)对体外培养H22小鼠肝癌细胞凋亡的促进作用,探讨2-SeCD的抗肿瘤活性。方法:体外培养的H22细胞分别加入80、160、320和640μmol.L-12-SeCD作为实验组,并设阴性对照组。倒置相差显微镜观察细胞形态的变化;MTT法检测细胞生长抑制率,计算中效抑制浓度(IC50);流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡。结果:320和640μmol.L-12-SeCD组细胞生长抑制率分别为(25.90±2.13)%和(49.40±3.66)%,与对照组比较差异有显著性(P<0.01),2-SeCD 48 h的IC50为611.29μmol.L-1;320和640μmol.L-12-SeCD组凋亡率分别为5.52%和12.47%,2-SeCD可使细胞阻滞于G0/G1期。结论:2-SeCD可抑制H22细胞增殖并促进其凋亡,2-SeCD对肝癌具有潜在的治疗价值。

应用RAPD技术检测小鼠肝癌H22细胞克隆株的遗传学改变

目的：用RAPD技术检测小鼠肝癌H22细胞克隆株的遗传变异。方法：小鼠肝癌H22细胞的4个克隆株H22-H8D8、H22-H2G4、H22-H2E10、H22-H2C4，用47条随机引物经PCR扩增，对扩增产物进行电泳，凝胶分析系统观察结果并照相。结果：47条引物均能扩增出明显的条带，条带数多为4-10条，片段大小在200-2000bp之间。其中4条引物的扩增条带具有多态性，表现为带的有无、移动和强弱差异。结论：RAPD技术可以用来对小鼠肝癌H22细胞克隆株进行遗传检测。

低强度超声对小鼠肝癌H_(22)细胞抑制效应的初步研究

目的:观察低强度超声对小鼠肝癌H22细胞体外生长的影响。方法:以低强度超声辐照小鼠肝癌H22细胞,采用倒置显微镜观察和MTT法检测观察超声对小鼠肝癌H22细胞的抑制作用。结果:低强度超声波能够显著抑制小鼠肝癌H22细胞的增殖,并且跟辐照时间呈剂量依赖关系。辐照后24h其MTT光吸收值随着超声作用时间的延长而显著降低。结论:低频超声辐照对小鼠肝癌H22细胞体外生长具有明显的抑制作用。

胸腺素原体内抑制小鼠肝癌细胞H22的研究

根据Parkin等报道,2000年全球新发癌症病例为1 010万例,死亡620万。在Ferlay等报道中最常见的癌症中致死率排列第三是肝癌。在我国肝癌的死亡率占全部恶性肿瘤死亡的18.8%,仅次于胃癌。因此，寻找和筛选有效的抗肝癌药物是目前医学界研究的热点。

化积益肝煎对小鼠肝癌H22细胞β-catenin和cyclin D1表达的影响

目的:观察化积益肝煎对小鼠肝癌H22细胞抑制作用,并探讨其对肝癌WNT信号传导通路上β-catenin和cyclin D1表达的影响。方法:将接种肝癌H22细胞的小鼠随机分为对照组、化积益肝煎(中药组)、环磷酰胺(西药组)、化积益肝煎+环磷酰胺(中西药组),连续给药15d后处死,剥离瘤组织称重;用免疫组化方法检测β-catenin和cyclin D1表达。结果:中药、西药、中西药合用可明显抑制小鼠肝癌的生长,抑瘤率分别为38.35%、55.48%、70.93%,具有统计学差异(P<0.05);中西药组抑瘤率(70.93%)高于西药组抑瘤率(55.48%),具有统计学差异(P<0.05);各用药组β-catenin和cyclin D1表达与对照组相比下降(P<0.05)。结论:化积益肝煎对小鼠肝癌有抑制作用,并对化疗药物有一定的协同增效作用;化积益肝煎可通过影响小鼠肝癌细胞WNT传导通路信号的传导,从而抑制小鼠肝癌细胞的增殖。

半枝莲多糖SBP-2A对小鼠肝癌H22细胞增殖的抑制作用

目的探讨半枝莲多糖SBP-2A对小鼠肝癌H22细胞增殖及凋亡的影响。方法体外培养小鼠肝癌H22细胞分为阴性对照组(不加任何药物)、阳性对照组(黄芪多糖200μg/mL)、低剂量治疗组(半枝莲多糖SBP-2A 50μg/mL)、中剂量治疗组(半枝莲多糖SBP-2A 100μg/mL)、高剂量治疗组(半枝莲多糖SBP-2A 200μg/mL)。MTT比色法检测各组细胞增殖的抑制活性。HE染色观察各组细胞形态学变化。流式细胞术Annexin V/PI双染法检测各组细胞凋亡水平。蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测各组细胞B细胞淋巴瘤2基因(B cell lymphoma 2 gene,Bcl-2)、BCL2关联X蛋白(BCL2-associated X protein,Bax)的蛋白表达水平。结果低、中、高剂量治疗组细胞增殖抑制率明显增加。低、中、高剂量治疗组均较阴性对照组出现一定程度的凋亡形态特征,且高剂量治疗组最为明显。高剂量治疗组细胞凋亡率显著高于阴性对照组及低、中剂量治疗组(P<0.05)。低、中、高剂量治疗组Bax蛋白表达水平均显著高于阴性对照组(P<0.05);中、高剂量治疗组Bcl-2蛋白表达水平均显著低于阴性对照组(P<0.05)。结论半枝莲多糖SBP-2A可显著抑制小鼠肝癌H22细胞增殖,其作用机制可能与调控Bax、Bcl-2蛋白表达水平从而促进细胞凋亡有关。

HSV1-TK自杀基因系统对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制效应

目的:构建表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组逆转录病毒,建立HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对小鼠肝癌细胞H22移植瘤的抑制效应.方法:构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pLXSN-tk,用PolyFectTransfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将该重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞H22,以G418筛选的抗性克隆(命名为H22/tk);将H22/tk细胞与未经基因修饰的H22细胞按1:4混合接种小鼠皮下,联合应用GCV,观察其抑瘤作用(n=19).结果:经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN逆转录病毒载体中;重组病毒DNA转染包装细胞PT67,获取病毒滴度为4×107cfu/L的重组逆转录病毒培养液;感染小鼠肝癌细胞H22后再筛选出G418抗性克隆株H22/tk.H22/tk细胞与H22细胞混合所致荷瘤鼠在GCV治疗前,各组间肿瘤体积无显著性差异;GCV治疗后,与对照组相比,GCV治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,到第8,10,12,14d,致瘤模型对照组的肿瘤体积分别为356±205,635±382,963±580,1509±1105mm3,而GCV治疗组分别为231±155(VS对照组,t=-2.25,P=0.03),413±252(vs对照组,t=-2.14,P=0.04),592±420(vs对照组,t=-2.38,P=0.02),939±847mm3(vs对照组,t=-1.92,P=0.06),GCV治疗组的肿瘤生长抑制率分别为35.0%,35.0%,38.5%,37.8%.结论:成功获取表达HSV1-tk基因的逆转录病毒,已建立显示出体内抑瘤活性的自杀基因治疗系统,为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础.

苦参碱对TIM2转基因小鼠肝癌细胞的作用研究

目的:观察苦参碱对TIM2转基因修饰小鼠H22肝癌细胞瘤苗的体内作用。方法:构建小鼠TIM2基因真核表达载体并用以转染H22细胞,经体外稳定筛选后获得TIM2转基因H22肝癌细胞全细胞瘤苗(H22-TIM2),用以建立小鼠肝癌移植瘤模型,观察该瘤苗在小鼠体内的成瘤性和免疫原性;加用药物苦参碱(matrine,M)治疗后,观察苦参碱对其体内抗癌活性的影响。结果:筛选得到的TIM2转基因H22肝癌细胞瘤苗有TIM2 mR-NA及EGFP的稳定表达,此瘤苗接种后,在小鼠体内的成瘤率为41%,远低于H22对照组和H22-EGFP空载体组(H22-EGFP)(后两者成瘤率在92%以上),对小鼠肿瘤的抑制率为69.2%,明显高于苦参碱治疗组(67.5%)和其他各组。同时苦参碱可进一步增强H22-TIM2瘤苗的肿瘤抑制率。H22-TIM2组小鼠的脾指数,CD4+T细胞亚群和CD4/CD8较其他实验组明显增高。结论:TIM2基因修饰H22细胞瘤苗可显著降低H22肝癌细胞在小鼠体内的致瘤性,在体内具有一定的免疫原性,苦参碱可明显改善其体内抗癌活性,为进一步研究TIM2基因在肿瘤免疫中的作用及苦参碱的抗癌机制奠定了基础。

重组纤粘连蛋白多肽CH50对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗作用

目的探讨尾静脉转染CH50多肽真核表达载体pCH510对肿瘤的治疗作用及其可能的分子机制。方法尾静脉注射CH50多肽真核表达载体pCH510，RT-PCR检测该质粒在BALB／c小鼠肌肉和肝脏中的表达，以H22肝癌细胞接种于小鼠右后腿肌肉内，建立小鼠肝癌移植瘤模型，将小鼠分成3组，经尾静脉分别注射pCH510（C组）、pcDNA3．1（P组）和生理盐水（S组），肿瘤接种后第2天开始，每隔2天对小鼠进行治疗。HE染色观察治疗后肿瘤生长、侵袭和血管形成的改变。RT-PCR比较经CH50多肽处理的肿瘤细胞中口αv、β83和cdc2的mRNA表达。结果小鼠肌肉和肝脏内均可检测到CH50多肽的表达，持续表达48-72h。治疗后C组的小鼠移植肿瘤湿重为（0．80±0．18）g，小于P组的（1．75±0．23）g，也小于S组的（2．02±0．38）g，均有显著性差异（P〈0．05），P、S组间无显著性差异。CH50多肽治疗可抑制肿瘤细胞侵袭生长和肿瘤血管生成。CH50多肽可下调H22细胞的αv、β3、cdc2基因的表达水平。结论非定向转染表达CH50多肽有较好的肿瘤治疗作用，这可能与CH50多肽干扰了αvβ3的功能有关。

熊果酸对H22荷瘤小鼠抗肿瘤及免疫调节作用

目的探讨熊果酸(UA)对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用及免疫功能的影响。方法皮下移植建立H22荷瘤小鼠模型,腹腔注射不同剂量UA,检测抑瘤率和免疫器官指数,MTT法检测脾脏T、B淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞亚群含量及比例,ELISA法检测血清细胞因子IL-2、IL-4和TNF-α的表达量。结果 UA对小鼠皮下移植性肿瘤H22有显著的抑制作用,可降低免疫器官中异常增大的脾指数,增强脾脏中T、B淋巴细胞增殖能力,提高淋巴细胞亚群CD4+T细胞表达及CD4+/CD8+T细胞亚群比例,促进血清IL-2、TNF-α表达,降低IL-4表达。结论 UA可抑制小鼠肝癌H22肿瘤生长,体内可以提高荷瘤小鼠的免疫能力,其抗肿瘤作用可能与机体的免疫调节作用相关。

猫人参注射液对两种肝癌细胞及正常肝细胞的体外作用观察

目的:观察猫人参注射液体外对两种肝癌细胞株及正常肝细胞增殖的影响。方法:将人肝癌BEL-7402细胞株、小鼠肝癌H22细胞株和人正常肝细胞L-02细胞株进行体外培养,采用MTT法测定不同浓度、不同时间猫人参注射液的体外抑制作用。结果:猫人参注射液对人肝癌BEL-7402细胞和小鼠肝癌H22细胞具有较强抑制作用,对L-02细胞在较低浓度下抑制作用不明显。结论:猫人参注射液在体外对人肝癌BEL-7402细胞和小鼠肝癌H22细胞具有较强的抑制作用,而在较低浓度下对于L-02细胞则无明显抑制作用。

As_2O_3联合H_(22)源exosome的抗肿瘤作用研究

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)联合小鼠肝癌(H22)源exosome对小鼠皮下种植性肝癌(H22)模型的抗瘤作用。方法:超速离心及密度梯度离心法提取exosome,Bradford法蛋白定量;建立BALB/c小鼠皮下荷瘤模型,实验分4组:空白成瘤对照组、As2O3组、As2O3联合exosome组和exosome组。观察As2O3、exosome、及其联合应用的体内抗瘤效应;监测在体肿瘤的生长情况;计算抑瘤率、生存率:免疫组织化学法检测肿瘤组织中浸润的CD4+、CD8+T淋巴细胞。结果:与空白成瘤对照组比较,As2O3组、及其与exosome联合组的肿瘤生长明显放缓(P<0.05)。其抑瘤率分别为44.58%、66.27%。As2O3组及As2O3联合exosome组肿瘤组织中浸润的CD4+、CD8+T淋巴细胞明显增加(P<0.05)。结论:As2O3与exosome联合应用对小鼠皮下种植性实体性肝癌(H22)有协同治疗效应。

氨氯地平对小鼠肝癌H_(22)细胞的抑制作用及其机制

目的探讨氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞的抑制作用及其机制。方法采用MTT法检测氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞增殖的影响。建立肝癌H22荷瘤小鼠模型,观察氨氯地平对荷瘤小鼠肿瘤的抑瘤率;HE染色观察肿瘤组织的病理改变;免疫组织化学方法检测肿瘤组织中bcl-2和bax蛋白的表达水平。结果氨氯地平作用48h可显著抑制小鼠肝癌H22细胞增殖,且呈剂量依赖性,其半数抑制浓度为5.6×10-3mg/ml。体内试验显示,氨氯地平(3和10mg/kg·d)灌胃给药10d能显著抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长;HE染色可见,氨氯地平给药组小鼠肿瘤细胞核染色变浅,细胞排列紧密;免疫组化显示,氨氯地平给药组小鼠肿瘤组织内bcl-2蛋白表达下调,而bax蛋白表达上调。结论氨氯地平具有明显的抑瘤作用,其抑瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡相关。

小鼠TIM2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,并在小鼠肝癌细胞系H22中进行表达。方法:用RT-PCR法扩增得到TIM2基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,并进行BamHI及BglⅡ双酶切鉴定和测序。通过脂质体法转染H22细胞,用RT-PCR法检测H22细胞中TIM2mRNA的表达。结果:构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,用脂质体法转染H22细胞后,用荧光显微镜观察和RT-PCR法检测,可见细胞内有EGFP及TIM2mRNA的表达。结论:成功地构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,并在小鼠H22细胞中表达,为进一步研究TIM2在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。

黑蒜提取液联合放疗抑制荷H22小鼠移植瘤生长的分子机制

目的:研究黑蒜提取液联合放疗对荷H22小鼠移植瘤生长的影响,并初步探讨其分子机制。方法:建立荷H22小鼠皮下移植瘤模型,对4组移植瘤模型分别给予0.9%氯化钠溶液、γ射线照射、黑蒜提取液及黑蒜提取液联合γ射线照射的处理,2周后摘取眼球取血后脱臼处死小鼠。剥离瘤体,计算肿瘤生长抑制率;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测肿瘤组织细胞凋亡情况;免疫组织化学法检测肿瘤组织中Bax及Bcl-2蛋白的表达情况;紫外分光光度计法检测各组小鼠血清中SOD及CAT的活力变化。结果:黑蒜提取液联合放疗可显著抑制荷H22小鼠移植瘤的生长,肿瘤生长抑制率高达66.93%;并能够明显诱导H22细胞凋亡,凋亡率可达(53.49±1.98)%,且上调移植瘤组织中Bax及下调Bcl-2蛋白的表达;黑蒜提取液联合放疗可显著提高小鼠血清中SOD和CAT的活力(P<0.05),增强小鼠抗氧化能力。结论:黑蒜提取液联合放疗可明显抑制荷H22小鼠移植瘤的生长,其作用机制可能与其下调抗凋亡Bcl-2蛋白及上调促凋亡Bax蛋白的表达和提高机体抗氧化能力有关。

羧甲基化裂褶多糖抗肝癌作用的实验研究

目的:从细胞水平和整体水平探讨羧甲基化裂褶多糖的抗肝癌作用。方法:将两种不同取代度羧甲基化裂褶多糖加入H22小鼠肝癌细胞液中分别培养24、48、72h,用台盼蓝拒染法测试作用后的细胞死亡率;建立小鼠H22肝癌移植性实体瘤模型,将其分为空白对照组、阳性对照组和3种不同取代度羧甲基化裂褶多糖给药组,腹腔注射给药,各组小鼠均连续给药10d后处死并称瘤重,计算抑瘤率。结果:不同取代度、不同时间羧甲基化裂褶多糖作用于H22肝癌细胞的细胞死亡率差异无统计学意义。取代度为0.67和0.93的羧甲基化裂褶多糖,对荷H22肝癌肿瘤小鼠的抑瘤率分别为41.3%和37.9%;取代度为1.14的羧甲基化裂褶多糖则未表现出抑瘤作用。结论:羧甲基化裂褶多糖在细胞水平上对H22小鼠肝癌细胞株无抑制作用;取代度为0.67和0.93的羧甲基化裂褶多糖对小鼠H22肝癌具有一定的抗癌作用,其机制并不是直接抑制癌细胞,而是通过机体因素后间接抑制肿瘤的生长,是一种具有开发潜力的新的候选抗癌药物。

TIM2基因修饰对H22细胞的抑制作用及苦参碱的增强作用

目的观察苦参碱对TIM2基因修饰小鼠H22肝癌细胞瘤苗的体内作用。方法以携带小鼠TIM2基因的真核表达载体脂质体法转染H22细胞，经体外稳定筛选获得TIM2转基因H22细胞瘤苗。建立小鼠肝癌移植瘤模型，接种TIM2转基因H22细胞瘤苗（H22-TIM2组），观察成瘤情况，并设空载体转染的H22细胞稳定表达株和H22细胞作为对照（H22-EGFP组和H22组）；同时，分别加用药物苦参碱治疗，观察苦参碱对不同处理组小鼠肿瘤生长情况的影响。结果成功得到TIM2转基因修饰H22细胞，鉴定有TIM2基因mRNA及EGFP的稳定表达。免疫接种小鼠后，在小鼠体内的成瘤率为41．6％，明显低于H22组和H22-EGFP组（后两者成瘤率在91．6％以上）（P〈0．01），小鼠肿瘤的生长速率也较其他各组明显缓慢，实验结束时H22-TIM2组小鼠肿瘤平均体积为（31．344-9．21）mm^3，明显小于H22-EGFP组和H22组[（98．25±25．23）mm^3和（114．08±36．45）mm^3；P〈0．01]。接种H22-TIM2细胞对小鼠肿瘤的抑制率为69．2％，加用苦参碱后，抑瘤率达90．6％，明显高于单用苦参碱组（67．5％）及H22-EGFP和苦参碱联用组（70．8％）。结论TIM2基因修饰H22细胞可显著降低H22肝癌细胞在小鼠体内的致瘤性，抑制小鼠体内H22移植瘤的发生和发展，而苦参碱可明显改善其体内抗癌活性。