TRIB3靶向AKT磷酸化调控高糖条件下小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的机制研究

目的探讨TRIB3介导高糖条件下巨噬细胞促炎性M1型极化的下游机制。方法以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象:1)细胞分为对照(CON)组和高糖(HG)组,Western blot检测TRIB3、p-AKT和AKT蛋白;在各组内分为DMSO组和SC79组/MK2206组,使用AKT激动剂SC79或抑制剂MK2206处理细胞,Western blot检测p-AKT和AKT蛋白。2)细胞随机分为Control vector-DMSO组、TRIB3 overexpress-DMSO组、Control vector-SC79组、TRIB3 overexpress-SC79组、Control vector-MK2206组和TRIB3 overexpress-MK2206组,CCK8检测细胞活性,相差显微镜观察细胞形态并采集图像,Western blot检测TRIB3、pAKT、AKT、iNOS和Arg-1蛋白,ELISA检测细胞培养液中IL-1β和IL-10分泌。结果1)与CON组相比,HG组TRIB3显著增加、p-AKT/AKT显著下降。HG-SC79组p-AKT/AKT显著高于HG-DMSO组且与CON-SC79组无显著差异;HG-MK2206组pAKT/AKT显著低于HG-DMSO组。2)与对应的Control vector组相比,TRIB3 overexpress组TRIB3均显著增加、p-AKT/AKT均显著下降;与对应的DMSO组相比,SC79组p-AKT/AKT均显著增加、MK2206组p-AKT/AKT均显著下降。与Control vector-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-DMSO组出现较多长梭形和不规则形细胞,iNOS和IL-1β显著增加,IL-10显著减少。与TRIB3overexpress-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-SC79组长梭形和不规则形细胞明显减少,iNSO和IL-1β显著下降,IL-10显著增加;TRIB3 overexpress-MK2206组长梭形和不规则形细胞进一步增加,Arg-1和IL-10显著下降,IL-1β显著增加。结论高糖环境下巨噬细胞中激活的TRIB3蛋白通过靶向负调控AKT磷酸化水平发挥诱导巨噬细胞M1型极化、抑制M2型极化的促炎作用。

敲低双特异性磷酸酶5(DUSP5)通过阻断NF-κB信号抑制卡介苗诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的探讨双特异性磷酸酶5(DUSP5)对卡介苗(BCG)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应的调控作用。方法Western blot法检测BCG感染RAW264.7巨噬细胞0.5、1、2、4、6、8、12、24 h,DUSP5表达变化;采用小干扰RNA(siRNA)技术下调RAW264.7巨噬细胞DUSP5水平,并设置siRNA阴性对照(si-NC)组、DUSP5敲低(si-DUSP5)组、si-NC联合BCG感染组、si-DUSP5联合BCG感染组。实时定量PCR检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10的mRNA表达,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量;Western blot法检测细胞核因子κB(NF-κB)与磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)表达变化。结果BCG感染上调RAW264.7巨噬细胞核DUSP5蛋白表达,并在BCG刺激4 h后,DUSP5表达量达到高峰;与si-NC联合BCG感染组相比,敲低DUSP5抑制细胞促炎因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达与分泌,而抑炎因子IL-10表达不受DUSP5的影响;且敲低DUSP5抑制细胞NF-κB磷酸化。结论敲低DUSP5通过阻断NF-κB信号抑制BCG介导的巨噬细胞炎性反应。

ralb34k2-1刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞对蛋白质PTM代谢物修饰及DENV-2易感性的影响

目的探讨白纹伊蚊唾液蛋白34k2-1(ralb34k2-1)刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)胞内蛋白翻译后代谢修饰(PTMs)的变化及对2型登革病毒(DENV-2)易感性的影响。方法利用抗乙酰化、乳酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和丙二酰化的泛特异性抗体,通过免疫印迹法(Western blot)检测ralb34k2-1蛋白刺激后不同时相的RAW264.7细胞蛋白质翻译后代谢物修饰的情况,酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞内外的乳酸含量;用2 mg/L ralb34k2-1预处理RAW264.7细胞24 h后、继续培养2 d、再用DENV-2感染细胞,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)检测感染18 h和36 h后的病毒核酸变化,分析ralb34k2-1预处理后对病毒易感性的影响;检测感染前后胞内白细胞介素1β-(IL-1β)、白细胞介素10-(IL-10)、肿瘤坏死因子β-(TGF-β)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1)mRNA的相对表达情况,分析ralb34k2-1预处理对细胞免疫状态及细胞极化的影响。结果胞内不同的代谢物对蛋白质的修饰程度主要表现为乳酰化修饰>乙酰化修饰>琥珀酰化修饰;在时相上,除琥珀酰修饰外,随时间的延长其余代谢物对蛋白质的修饰有增多的趋势,其中以6 h乳酰化修饰最多;ralb34k2-1刺激对细胞的乳酸产生无明显影响;经ralb34k2-1预处理后胞内DENV-E相对表达量较对照组高5倍以上,IL-10 mRNA的相对表达在感染前后均保持高水平(6~8倍);在感染前iNOS/Arg比值为3.46±1.59,但受ralb34k2蛋白预处理的细胞在感染后表现iNOS表达下调的趋势。结论蚊唾液ralb34k2蛋白可能通过调控PTM代谢物修饰的方式,改变细胞的免疫状态从而增强登革病毒的易感性。

慢性高糖抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞AKT磷酸化并促进其Ml型极化

目的研究慢性高糖对小鼠巨噬细胞的影响及机制.方法以正常生长液和含(40、60)mmol/L葡萄糖的生长液培养小鼠RAW264.7巨噬细胞1、3、5、7 d,相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot法检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)和IL-1O蛋白水平,ELISA检测培养细胞上清液IL-Iβ和IL,-10分泌量;实时定量PCR法检测细胞蛋白激酶B(AKT)mRNA水平,Western blot法检测细胞AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)蛋白水平.结果60 mmol/L葡萄糖处理1 d即出现较多长梭形细胞,可见伸展的伪足,且随时间延长数量增加、体积变大;处理1 d即明显抑制细胞增殖,随时间延长抑制效果有所改善;处理3,5,7d后,IL-1β蛋白水平增加、IL-10蛋白水平降低;处理1 d后IL-1β分泌显著增加,但处理3d后IL-10分泌显著减少且随时间延长进一步减少;处理3,5,7 d后,AKT蛋白磷酸化被抑制,但AKT mRNA水平未见明显变化.40 mmol/L葡萄糖处理在一定程度上发挥作用,但不如60 mmol/L葡萄糖显著和稳定.结论长期高糖刺激诱导巨噬细胞向促炎性M1型转变,诱发巨噬细胞的持续慢性炎症反应,其机制可能与抑制AKT蛋白磷酸化激活有关.

5-氨基酮戊酸光动力疗法对小鼠RAW264.7巨噬细胞株吞噬活性和活性氧自由基的影响

目的探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-aminolevulinicacid photodynamic therapy,5-ALA-PDT)对RAW264.7细胞吞噬活性和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的影响。方法细胞实验研究用灭活痤疮丙酸杆菌诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,产生炎症细胞模型,给予不同浓度的5-ALA孵育RAW264.7细胞,并给予16 J/cm^2红光照射。采用中性红法检测巨噬细胞的吞噬活性,荧光显微镜观察细胞内活性氧离子的荧光强度,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐法(dihydrochloride acetyl acid dichloride,DCFH-DA)检测活性氧自由基水平。结果模型组吞噬活性比空白组高,随着5-ALA浓度升高,吞噬活性降低,呈剂量依赖性。荧光显微镜下5-ALA 0.12 mmol/L组细胞内有大量红色荧光。随着5-ALA浓度升高,ROS水平升高,呈剂量依赖性。结论 5-ALA-PDT可对RAW264.7细胞吞噬活性和活性氧自由基产生影响,可能影响5-ALA-PDT的疗效。

连接蛋白43在吡啡尼酮促进小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化中的作用

目的探讨连接蛋白43(connexin 43,Cx43)是否能够调节吡啡尼酮(pirfenidone,PFD)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化。方法将体外培养的对数生长期小鼠RAW264.7巨噬细胞分为对照组(Control组)、PFD组、PFD+Cx43特异性阻断剂Gap19组(PFD+Gap19组)、吡啡尼酮+阴性慢病毒对照组(PFD+NC组)、吡啡尼酮+Cx43过表达慢病毒组(PFD+OE组)。采用慢病毒转染技术,加入含有过表达慢病毒的培养基,使Cx43在巨噬细胞中过表达。采用Western blot技术检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Cx43和M2型极化标记物CD206、Arg-1的蛋白表达水平,采用倒置荧光显微镜观察小鼠RAW264.7巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase1,Arg-1)和CD206的蛋白表达和定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测Cx43,Arg-1和CD206的RNA表达水平。结果PFD组中的Cx43蛋白表达与Control组相比降低;PFD组中的M2型极化标志物CD206和Arg-1与Control组相比大幅升高;与PFD组相比,在PFD+Gap19组中Arg-1和CD206的表达均显著升高;与PFD组相比,在PFD+NC组中Arg-1和CD206的表达无明显改变。与PFD+NC组相比,PFD+OE组中Arg-1和CD206的表达均显著降低。结论PFD可以通过下调Cx43促进小鼠RAW264.7巨噬细胞向M2型极化。通过Gap19和过表达慢病毒调节Cx43的表达,也可调节巨噬细胞M2型极化。

阻断连接子蛋白43(Cx43)抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M1型极化

目的研讨连接子蛋白43(Cx43)在脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M1型极化中的作用。方法将体外培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS联合Cx43阻断剂模拟肽19(Gap19)或模拟肽26(Gap26)预处理组(LPS联合Gap19组、LPS联合Gap26组)。Western blot法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Cx43和M1型极化标志物CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白水平,免疫荧光细胞化学染色观察CD86在RAW264.7巨噬细胞的表达和定位,流式细胞术检测小鼠RAW264.7巨噬细胞M1型极化标志物CD86的表达频数。结果与对照组相比,LPS组中CD86、iNOS和Cx43的蛋白表达明显升高,CD86的表达频数明显升高;与LPS组相比,在LPS联合Gap19组和LPS联合Gap26组中CD86和iNOS的蛋白表达均显著降低,CD86的表达频数均显著降低。因此,LPS可以诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞向M1型极化,而Gap19和Gap26能够降低M1型极化标志物的表达。结论通过阻断Cx43可以抑制巨噬细胞M1型极化。

AcSDKP体外抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞促炎功能研究

目的探讨N-乙酰-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对小鼠RAW264.7巨噬细胞促炎功能的影响。方法取小鼠RAW264.7巨噬细胞体外培养,分为对照组、脂多糖(LPS)组和LPS加不同浓度的AcSDKP(1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L)处理组。采用荧光定量PCR法检测细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞素(IL)-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA相对水平;使用Transwell小室检测RAW264.7细胞的趋化能力;采用Western blot法检测细胞iNOS、磷酸化的蛋白激酶复合体抑制物(p-IKK)、磷酸化的κ B抑制蛋白(p-Iκ B)和磷酸化的P65(p-P65)蛋白表达水平。结果 LPS处理组TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著高于对照组【分别高出(41±2.1)倍、(1073±80.8)倍和(1726±110.2)倍,P<0.01】;AcSDKP(10 nmol/L和100 nmol/L)处理组TNF-α水平显著低于LPS处理组【分别降低19.0%和39.3%,P<0.01】;AcSDKP(1 nmol/L、10 nmol/L和100nmol/L)处理组IL-1β水平显著低于LPS处理组【分别降低22.08%、35.8%和38.2%,P<0.01】;AcSDKP(1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L)处理组IL-6水平显著低于LPS处理组【分别降低15.8%、35.7%和43.3%,P<0.01】;LPS处理组穿过小室的细胞数为(136±5.3)个/HP,显著高于对照组【(64±5.3)个/HP,P<0.01】,而AcSDKP处理组穿过小室的细胞数【分别为(105±4.8)、(85.3±5.0)和(73.7±5.6)个/HP】,显著低于LPS组【(136±5.3)个/HP,P<0.05】;LPS处理组iNOS mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组【分别为(21±2.5)倍和(5.9±0.4)倍,P<0.01】,而AcSDKP处理组iNOS mRNA显著低于LPS处理组【分别降低37.8%、23.3%和33.1%,P<0.05】;在10 nmol/L和100 nmol/L浓度AcSDKP处理组,两种蛋白水平显著低于LPS处理组【分别降低27.0%和40.2%,P<0.05】;LPS处理组p-IKK、p-Iκ B和p-P65表达量均显著高于对照组【分别为(25.9±4.8)倍、(9.5±0.6)倍和(2.1±0.2)倍,P<0.01】,而AcSDKP(10 nmol/L)处理组三者水平较LPS处理组显著下降【分别为42.5%、17.8%和29.7%,P<0.05】。结论 AcSDKP可抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,这一效应可能与阻断IKK/Iκ B/NF-κ B通路有关。

壬基酚异构体NP_(42)对小鼠RAW264.7巨噬细胞的损伤作用

目的:研究壬基酚异构体NP_(42)对小鼠巨噬细胞RAW264.7的损伤作用并探究其分子机制。方法:以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,将不同浓度NP_(42)(0.1~100μmol/L)作用于细胞24 h,采用噻唑蓝法检测细胞存活率,酶联免疫分析检测环磷酸鸟苷(cGMP)和环磷酸腺苷(cAMP)含量,RT-PCR法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表达水平,Western blot法检测蛋白激酶C(PKC)的表达情况以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化水平。结果:0.1~10μmol/L NP对细胞存活率无显著影响,100μmol/L NP_(42)能显著降低RAW264.7细胞的存活率(P <0.01)。与对照组相比,NP_(42)处理24 h能显著抑制细胞TNF-α mRNA和iNOS mRNA的表达,抑制细胞PKC蛋白的表达和降低细胞内cAMP的含量,同时增强细胞内c GMP的含量。NP_(42)处理能显著下调p38的磷酸化水平。结论:壬基酚异构体NP_(42)通过PKC-cAMP信号通路以及p38-MAPK信号通路对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生损伤作用,这可能是壬基酚发挥免疫损伤的主要分子机制。

硝苯地平对ApoE^(-/-)小鼠RAW264.7巨噬细胞源性胆固醇逆向转运的影响

目的探讨硝苯地平对ApoE-/-小鼠RAW264.7巨噬细胞源性胆固醇逆向转运的影响。方法 8周龄左右ApoE-/-小鼠16只,用高脂饲料喂养作为模型,按完全随机分组法分为对照组(n=8)和硝苯地平组(n=8)。将[3H]-胆固醇标记的荷脂RAW264.7小鼠巨噬细胞注入小鼠腹腔,24、48 h时取血液标本,酶法检测血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的浓度。处死后取小鼠肝脏和小肠,实时定量PCR检测肝脏及小肠ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ、LXRα基因的mRNA表达,Western blot检测其蛋白表达。同时,收集48 h小鼠粪便,进行闪烁液计数,分别比较2组[3H]的含量。结果与对照组相比,经硝苯地平处理组血浆血脂蛋白水平均无明显变化(P>0.05);血浆24、48 h闪烁值较对照组分别增加37.02%、22.72%(P<0.05),粪便[3H]闪烁值较对照组增加43.18%(P<0.05);硝苯地平组ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ、LXRα基因的mRNA和蛋白的表达均有明显升高。结论硝苯地平通过增加LXRα及其下游基因ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ的表达,从而增强ApoE-/-小鼠巨噬细胞源性胆固醇逆向转运的效果。

甘丙肽体外抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞促炎功能研究

目的探讨甘丙肽对小鼠RAW264.7巨噬细胞功能的影响。方法取小鼠RAW264.7巨噬细胞体外培养,分为对照组、脂多糖(LPS)处理组和LPS联合甘丙肽处理组。给予后两组细胞LPS(1μg/ml)刺激2h,使细胞激活,其中一组再加入甘丙肽1000nmol/L继续处理24h,镜下观察各组细胞形态变化;采用荧光定量PCR法检测培养上清TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA水平;采用Western blot法检测细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg1)蛋白表达水平。结果 LPS处理组IL-6、IL-1β和TNF-αm RNA分别较对照组升高(7083±432.5)倍、(3106±104.3)倍和(108.0±47.58)倍,而甘丙肽处理组三者水平较LPS处理组下降(1.2±0.2)倍、(0.3±0.08)倍和(19±1.3)倍,差异均有统计学意义(P<0.05);LPS组iNOS蛋白较对照组升高(19.5±1.964)倍,Arg1蛋白水平较对照组降低(1.6±0.3)倍,而给予甘丙肽混合处理后,iNOS蛋白水平较LPS处理组降低(1.7±0.32)倍,而Arg1蛋白升高(2.31±0.12)倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论甘丙肽可抑制LPS诱导的小鼠Raw264.7巨噬细胞的促炎反应。

miRNA-144抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达

目的构建miR-144真核表达载体,检测miR-144是否调控小鼠RAW264.7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达。方法结合文献,通过预测软件分析,选取评分较高、可作用于ABCA1 mRNA 3'非编码区(ABCA1 mRNA3'UTR)的miR-144。通过分子克隆技术,利用PCR扩增miR-144和ABCA1 mRNA 3'UTR的DNA序列,酶切胶回收后,分别连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体和pcDNA3.1(+)-luciferase载体上。测序后,运用双荧光素酶报告基因系统检测萤火虫荧光素酶的活性,观察miR-144是否对ABCA1 mRNA 3'UTR具有直接靶向作用。运用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7巨噬细胞。通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染后miR-144的表达含量。通过qRT-PCR和Western blot法检测过表达miR-144后ABCA1在mRNA和蛋白水平的变化。结果 miR-144 PCR产物连接至pcDNA3.1(+)载体上,ABCA1 mRNA 3'UTR连接至pcDNA3.1(+)-luciferase载体上,测序正确。运用双荧光素酶报告基因系统检测发现,和对照组[pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者相比,实验组[pcDNA3.1(+)-miR144、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者可以显著降低萤火虫荧光素酶的活性(P<0.05),证明miR-144对ABCA1 mRNA3'UTR具有直接靶向作用。将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7细胞中,qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体组miR-144表达无明显变化(P>0.05);转染pcDNA3.1(+)-miR-144组中miR-144表达量显著增高(P<0.01).qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)-miR-144对ABCA1 mRNA表达水平无明显影响(P>0.05),Western blot结果显示转染pcDNA3.1(+)-miR-144可以显著降低ABCA1蛋白水平的表达(P<0.01)。结论 miR-144可以在转录后水平降低ABCA1蛋白的表达。

模拟失重对小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学功能的影响

目的通过2D回转器回转细胞模拟失重生物学效应,探讨模拟失重对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)多种生物学功能的影响特点,为深化空间失重免疫抑制机制研究提供理论依据和数据支撑。方法将RAW264.7细胞分为对照组(NG组)、模拟失重组(SMG组),利用2D回转器模拟失重72 h后,采用CCK-8法和EdU法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞的增殖能力变化;细胞划痕实验和Transwell小室法检测巨噬细胞迁移功能的变化;探针DCFH-DA标记,倒置荧光显微镜观察和拍照检测巨噬细胞分泌活性氧(ROS)的变化。结果RAW264.7巨噬细胞模拟失重72 h后增殖受到抑制,CCK-8实验结果显示,NG组的细胞增殖速率显著高于SMG组(P<0.05);EdU染色结果显示,SMG组EdU掺入RAW264.7细胞核的量较NG组减少(P<0.01)。细胞划痕、Transwell实验检测表明72 h模拟失重对巨噬细胞的迁移能力有明显影响,与NG组相比,模拟失重后RAW264.7细胞迁移能力增强(P<0.05);探针DCFH-DA标记检测提示模拟失重对巨噬细胞分泌ROS有明显抑制作用(P<0.01)。结论回转模拟失重对RAW264.7细胞的生物学功能具有影响,表现为RAW264.7迁移运动能力增强,细胞增殖与ROS分泌能力受到抑制。

依达拉奉对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的 探讨依达拉奉(EDA)对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用。方法 以脂多糖诱导RAW264.7细胞,复制炎性细胞模型。采用CCK-8法检测EDA的细胞毒性作用。实验分为空白组(等体积培养基)、模型组(等体积培养基)、给药组(40μg/mL EDA)。采用Griess法检测细胞中一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞中前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法测定细胞中IL-1β和IL-18 mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞中JAK2/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路相关蛋白JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,IL-1β,IL-18的蛋白表达水平。结果 与0μg/mL比较,20,40,80,160μg/mL EDA处理下细胞存活率无显著变化(P <0.05)。与模型组比较,给药组细胞中NO,PGE2,IL-1β,IL-18,TNF-α,ROS水平均显著降低(P <0.05);IL-1β与IL-18 mRNA及蛋白表达水平和p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3均显著降低(P <0.05)。结论 EDA可能通过抑制JAK2/STAT3通路的激活而抑制RAW264.7细胞的炎性反应。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养及其在诱导破骨细胞中的应用

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。RAW264.7细胞在医学研究中应用十分普遍:它是许多白血病相关研究模型的常用细胞株;在微生物学、免疫学等研究中也十分常用;同时也是小鼠源性破骨前体细胞,可通过特定细胞因子的诱导在体外获得成熟破骨细胞,因此也成为许多骨骼疾病研究的体外模型。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难。科研工作者在RAW264.7细胞的培养方法、细胞的形态及分化状态等方面始终观点不一,对于用RAW264.7细胞在体外诱导获得破骨细胞的方法也有许多差别。本文结合文献资料及实践,探索了RAW264.7细胞的培养条件,冻存、复苏、传代方法,以及用核因子κB受体活化因子配基(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导其成为成熟破骨细胞的技术关键;旨在总结RAW264.7细胞的培养及诱导其分化为破骨细胞的经验教训,探讨RAW264.7细胞的培养和在体外用RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法、技巧,供广大科研工作者借鉴。

激活素A对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的促进作用

目的探讨激活素A对巨噬细胞吞噬活性的促进作用及其机制。方法分别通过中性红试验、鸡红细胞法和流式细胞术,检测激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞的吞饮活性、吞噬活性以及对MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD68表达的影响。结果激活素A可明显促进RAW264.7细胞的吞饮及吞噬活性,对MHCI、II类分子表达没有影响,但可明显上调巨噬细胞表面分子CD68的表达。结论激活素A可促进巨噬细胞系RAW264.7细胞吞噬活性,这与其促进巨噬细胞成熟有关。

木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶对小鼠巨噬细胞RAW264.7的抗炎作用研究

目的:研究木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶的抗炎作用及机制。方法:以正常小鼠巨噬细胞RAW264.7为对照,以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞为炎症模型,采用MTT法检测不同浓度(10、20、40、80μmol/L)的木犀草素、4,4′-联吡啶和木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶作用细胞2 h后的细胞活性;荧光定量聚合酶链式反应法测定40μmol/L浓度时细胞中诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达,酶联免疫吸附法测定40μmol/L浓度时细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)蛋白表达,Western blot法测定40μmol/L浓度时细胞中核转录因子p65(NF-κB p65)蛋白表达。结果:与正常细胞比较,LPS诱导后RAW264.7细胞活性明显降低(P<0.01),i NOS和COX-2 m RNA表达水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。木犀草素和木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶均能增强LPS诱导后RAW264.7细胞活性(P<0.05或P<0.01),且呈浓度依赖性;4,4′-联吡啶对LPS诱导后RAW264.7细胞活性无明显影响;40μmol/L浓度下,木犀草素和木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶可使LPS诱导后细胞中i NOS和COX-2 m RNA表达水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),其中木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶降低效果强于木犀草素(P<0.05或P<0.01)。结论:木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶可能通过下调NF-κB信号来抑制炎症相关因子产生,其抗炎作用优于木犀草素。

不同剂量异鼠李素对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响及其机制探讨

目的观察异鼠李素(ISO)对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264. 7增殖能力的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期RAW264. 7细胞,将细胞分为5组,低、中、高剂量组分别加入已经配好含10 ng/m L脂多糖(LPS)及低、中、高剂量ISO(50、100、200μg/m L)的溶液,模型组加入含10μg/m L LPS的1640培养基(含10%FBS),对照组加入含10%溶剂对照的1640完全培养基。测算各组细胞增殖指数,检测各组一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)。结果与对照组比较,模型组细胞12、24、36、48 h细胞增殖指数增加(P均<0. 05);与模型组比较,低剂量组24、36 h及中剂量组和高剂量组12、24、36、48 h细胞增殖指数减少(P均<0. 05);与低剂量组比较,中剂量组24 h及高剂量组24、48 h细胞增殖指数减少(P均<0. 05)。与对照组比较,模型组NO、TNF-α水平升高(P均<0. 05);与模型组比较,低剂量组NO水平及中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均<0. 05);与低剂量组比较,中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均<0. 05)。结论 ISO可抑制RAW 264. 7细胞增殖能力,且呈剂量依赖性,高剂量作用最大;机制可能与抑制NO、TNF-α有关。

鞣花酸通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB途径抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

目的基于Toll样受体4(TLR4)-酪氨酸激酶(SRC)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)通路探讨鞣花酸的抗炎机制。方法采用不同浓度(0、0.5、5、25、50、75、100μmol·L^(-1))鞣花酸对RAW264.7巨噬细胞[或脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞]干预24 h,噻唑蓝(MTT)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适给药浓度。实验分为空白对照组,模型组(0.5 mg·L^(-1)LPS),阳性对照地塞米松组(10μmol·L^(-1)),鞣花酸(5、25、50μmol·L^(-1))给药组。Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;采用ELISA法检测细胞上清液中前列腺素-2(PGE2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平;采用Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白以及TLR4-SRC/MAPK/NF-κB通路相关蛋白的表达水平。结果MTT结果筛选出鞣花酸的干预浓度为5~50μmol·L^(-1)。与空白对照组比较,模型组PGE_(2)、NO和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高(P<0.01);炎症标志物iNOS、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),说明炎症模型建立成功。与模型组比较,鞣花酸能显著抑制LPS诱导NO、PGE_(2)的产生和降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.05,P<0.01),降低i NOS、COX-2蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性;显著抑制TLR4蛋白的表达水平以及SRC、P38、JNK、p65、IκBα蛋白的磷酸化水平,并呈浓度依赖性。但对ERK1/2蛋白磷酸化没有显示出明显的抑制作用。结论鞣花酸可能通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB信号通路的调控抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,具体的调控机制有待进一步研究。

文冠果叶黄酮对巨噬细胞RAW264.7细胞因子及TLR2受体的影响

通过四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法分析文冠果叶黄酮(XLF)对巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响,酶联免疫吸附测定法检测巨噬细胞RAW 264.7分泌的细胞因子含量;通过XLF处理Toll样受体2(TLR2)抗体作用的巨噬细胞,研究TLR2受体对该细胞因子的介导作用。结果表明:当XLF质量浓度为320μg/mL时,巨噬细胞RAW 264.7分泌的NO、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)细胞因子最多,且与空白对照差异极显著,但都小于脂多糖(LPS);且与未加入TLR2抗体相比,加入了TLR2抗体的巨噬细胞减少了各细胞因子的分泌,且差异均极显著。XLF可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖及细胞因子的分泌,并且可能通过TLR2受体介导。