基于高通量测序技术构建糖尿病肾病小鼠lncRNA相关ceRNA调控网络

目的:筛选糖尿病肾病(DKD)小鼠肾脏组织中差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)、小RNA(miRNA),构建lncRNA相关竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络。方法:选取6只BKS-db/m雄性小鼠为对照组,6只BKS-db/db雄性小鼠为模型组,模型组构建DKD小鼠模型。处死小鼠后取肾脏组织进行高通量测序,利用DESeq软件筛选两组差异表达的lncRNA、miRNA,使用Miranda软件进行差异表达的miRNA靶基因预测。构建lncRNA相关ceRNA调控网络并进行GO功能富集分析以及KEGG信号通路富集分析。结果:共筛选出DKD小鼠差异表达的lncRNA 1495个、差异表达的miRNA 72个。成功构建由MSTRG.7252.3、MSTRG.10465.2、MSTRG.16253.3等23个lncRNA、23个miRNA与2个mRNA组成,与lncRNA相关的ceRNA网络。GO功能富集分析显示,该网络主要涉及生物学过程、细胞组成和分子功能;KEGG信号通路富集显示,主要与PPAR信号通路、造血细胞谱系、细胞黏附分子、TNF信号通路等有关。结论:成功构建DKD小鼠lncRNA相关的ceRNA调控网络。

主观性耳鸣患者外周血非编码RNA高通量测序初析

目的:探寻主观性耳鸣患者的差异表达非编码RNA(ncRNA)及相应调控的信使RNA(mRNA)。方法:对37例主观性耳鸣患者(耳鸣组)和20例健康志愿者(健康对照组)外周血样本进行高通量测序分析,以识别差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)和mRNA,并通过公共数据库匹配ncRNA-miRNA-mRNA的调控路径。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)对另外10例耳鸣组和10例健康对照组外周血样本进行检测,以验证筛选出的ncRNA和mRNA的差异表达是否具有普遍性。结果:在耳鸣组外周血中发现了13个lncRNA、596个circRNA和38个mRNA存在显著差异表达。13个差异表达的lncRNA均未能匹配到相应的miRNA,未行后续的mRNA匹配分析。596个差异表达的circRNA成功匹配到58个miRNA和595个mRNA,其中有1个mRNA(TOMM7)显示出差异表达,其对应的circRNA和miRNA分别为circ_0051120和miR-615。qPCR结果显示,circ_0051120的表达量在两组间存在显著差异(P<0.05),而TOMM7表达无统计学差异(P>0.05)。结论:circ_0051120可能通过调节TOMM7的表达水平,进而影响线粒体自噬过程,并过度激活NF-κB信号通路以及影响神经网络稳定性,从而在主观性耳鸣的发生和维持过程中发挥重要作用。

高通量测序技术与电镜技术在RNA表观修饰研究中的应用

RNA表观遗传学是继DNA表观遗传学和蛋白表观遗传学的发展而兴起的新兴研究领域。已有的研究结果表明,RNA表观遗传修饰对RNA的加工代谢和生物学过程具有调控作用,在生命科学的多个领域已显示出巨大的应用潜力和商业前景。RNA表观遗传修饰的研究有助于进一步阐明生命活动调控的复杂机制。本文将关注于RNA表观遗传修饰研究中各种技术手段的应用,特别聚焦于高通量测序技术和电镜技术在RNA表观修饰研究中的应用情况以及相关局限性,并对这两种技术在未来可能的联合应用提出了展望。

新一代高通量RNA测序数据的处理与分析

随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展,RNA测序(RNA-seq)已成为基因表达和转录组分析新的重要手段.RNA-seq技术产生的海量数据为生物信息学带来了新的机遇和挑战.有效地对测序数据进行针对性的生物信息学处理和分析,成为RNA-seq技术能否在科学探索中发挥重大作用的关键.以新一代Illumina/Solexa测序平台所产生的数据为例,在扼要介绍高通量RNA-seq测序流程的基础上,对RNA-seq数据处理和分析的方法和现有软件做一个较为全面的综述,并对其中有待进一步研究的问题进行展望。

牦牛卵巢小RNA高通量测序及生物信息学分析

本研究旨在利用高通量测序技术描绘牦牛卵巢sRNA图谱,为探析牦牛繁殖性能提供基础。以牦牛卵巢组织作为研究对象,构建牦牛sRNA文库,进行高通量测序和生物信息学分析,最后利用RT-qPCR技术验证miRNA在牦牛卵巢组织中的表达。经测序后得到包含12 126 208条clean reads,其中特异序列为212 757条;比对分析显示,只有7 383 536(60.89%)条总序列及80 981(38.06%)条特异序列能与牦牛基因组匹配。与黄牛相比,牦牛sRNA中有56个表达量上调,其中miR-135a表达上调最显著;有33个表达下调,其中miR-2316表达下调最显著。RT-qPCR验证6个miRNA在牦牛卵巢组织中的表达情况,定量结果和测序结果基本一致。与牦牛EST序列信息比对后共预测出5个新miRNA。本研究成功绘制牦牛卵巢sRNA图谱,同时证实RNA-Seq高通量测序技术在完善sRNA信息及挖掘新miRNA方面的优势,对研究sRNA在牦牛遗传育种以及以牦牛为重要高原动物模型来进行高原适应性和抗逆性等相关领域的研究具有重要意义。

利用高通量测序技术发现植物小分子RNA研究进展

小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码RNA分子,其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型基因调控机制。它在植物的生长发育和适应外界各种环境胁迫的过程中起着非常重要的作用。植物中小分子RNA数量巨大、种类繁多,而高通量测序技术的出现大大加快了它们的发现过程。本文在简要介绍目前已知植物小分子RNA的类型及特点的基础上,综合阐述近年来利用高通量测序技术克隆和分析植物小分子RNA的研究成果,以期反映当前植物小分子RNA的基因组分布规律、功能和进化等方面的最新研究进展。

利用siRNA高通量测序技术检测烟草病毒

植物可以利用小干扰RNA(siRNA)机制干扰体内RNA病毒的增殖,从而获得对该病毒的免疫能力。为了快速检测田间烟草病毒病种类和发现烟草新病毒,本文通过第二代测序技术对烟草的小RNA进行高通量测序,利用软件velvet version 1.1.06对测得的短序列进行组装,再通过生物信息学方法将得到的重叠群进行数据库比对寻找其中的病毒序列。研究结果得出我国安徽皖南烟区烟草存在PVY、CMV、TMV和TVBMV等RNA病毒。检测到3个重叠群与Potato leafroll virus部分同源,同源性低于90%,疑似一种烟草新病毒。至此建立了检测烟草病毒和发现新病毒的一种新方法,可用于大田烟草病毒的本底调查。

高通量测序分析胆囊结石患者microRNA表达谱差异

目的探讨胆囊结石和非结石患者胆囊黏膜中mi RNA表达谱的差异。方法选取30例胆结石患者(结石组)和30例胆囊息肉患者(非结石组)的胆囊黏膜组织,采用Illumina Hi Seq 2500高通量测序技术进行深度测序,比较2组的micro RNA表达差异。对差异表达的mi RNAs进行筛选与靶基因预测,并进行GO和KEGG功能显著性富集分析。荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)对差异表达mi RNAs进行验证。结果结石组和非结石组分别获得2 215 832和1 424 770条序列,平均长度22 nt。2组间显著差异表达的mi RNA共计17个,其中9个表达上调,8个表达下调。GO分析结果示靶基因富集于离子的结合和转运、载脂蛋白结合、钙离子通道激活、蛋白激酶活性等分子功能以及大分子的合成和代谢、类固醇激素生物合成和代谢等生物进程。KEGG通路富集分析示靶基因多集中于癌症相关通路,包括WNT、Hippo等信号通路。q RT-PCR结果示差异性mi RNA的表达趋势与测序结果相一致。结论差异表达的mi RNA可能在胆囊结石的形成中具有重要作用。

利用siRNA高通量测序技术检测平菇病毒

为了检测采集于聊城市郑家镇的球形平菇(Pleurotus ostreatus)样品是否感染病毒,提取样品总RNA,构建小RNA文库并对其进行高通量测序,然后利用生物信息学方法寻找其中的病毒序列。结果证明球形平菇样品中未携带病毒,说明这种球形症状的产生不是由于病毒侵染所导致的。

基于高通量测序发掘番木瓜果实成熟相关miRNA

【目的】番木瓜是典型的呼吸跃变型果实,外源乙烯处理使番木瓜呼吸跃变提前,促进果实成熟。分离番木瓜果实成熟相关miRNA,为深入了解呼吸跃变型果实的成熟分子机制奠定基础。【方法】利用高通量测序技术对乙烯(ETH)、1-MCP和清水对照(CG)处理的番木瓜果实进行miRNA和转录组高通量测序,然后对测序获得数据进行生物信息学分析,进行miRNA鉴定和靶基因预测,并与转录组测序结果进行关联分析。【结果】乙烯、1-MCP和对照处理分别获得10734196、16486803和16067290条纯净序列,共鉴定出523个miRNA。其中,已知miRNA个数为1-MCP(303)、CG(214)和ETH(239),新miRNA个数为1-MCP(184)、CG(188)和ETH(114)。与对照相比,在乙烯处理中上调和下调表达的miRNA分别是123和72条。靶基因预测共获得5053个靶基因,KEGG功能富集分析显示它们参与了戊糖、葡萄糖醛酸转换、淀粉和蔗糖代谢、卟啉和叶绿素代谢、类胡萝卜素合成等代谢途径。筛选出的番木瓜果实成熟衰老相关候选miRNA,包含4个果实软化调控相关miRNA(miR167-y、miR4993-x、miR3946-x和miR5059-x)、3个果实颜色调控相关miRNA(miR4993-x、miR815-y和miR7810-x)、3个激素调控相关miRNA(miR4993-x、miR8004-x和miR9722-x)和4个转录因子调控相关miRNA(miR5641-y、miR9722-x、miR838-y和miR319-y)。【结论】筛选的番木瓜果实成熟衰老相关miRNA为今后果实成熟衰老调控网络研究提供了可能的线索。

传统中草药高通量测序技术RNA-seq及lncRNA挖掘的应用策略

中草药作为中国传统中医特有药物已有上千年的历史,然而对中草药资源关键生物学过程中的功能基因挖掘却刚刚起步。lncRNA功能研究越来越引起人们的重视,结合RNA-seq技术研究中草药转录组中lncRNA功能,有望揭示中草药的生长、发育、代谢等生物学过程中的分子机制。综述了RNA-seq高通量测序及在中草药转录组测序中的应用策略,简述了lncRNA主要生物学功能及分析方法,并对RNA-seq技术和lncRNA生物信息学分析方法中存在的问题进行了简要讨论。

高通量测序分析冠心病患者外周血LncRNA表达差异

目的:发现外周血中与冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)相关的未知长链非编码RNA(LncRNA)。方法:选取临床冠心病组及对照组各3例外周血血浆样本进行LncRNA高通量测序表达谱分析,使用cuffdiff软件获得LncRNA表达谱,计算两组样本间的倍数变化和P-value值,筛选差异表达LncRNA。Q-PCR法验证36对冠心病和正常组外周血浆及外周血单核细胞中的基因表达水平。结果:测序结果分析发现差异表达明显的45个上调表达及29个下调表达的LncRNA。Q-PCR法筛选出3个在冠心病患者外周血单核细胞中上调表达明显的LncRNA:uc003pxg.1,ENST00000565257,ENST00000568324。ROC曲线下面积分别为0.812 5,0.742 4,0.742 4。以上基因在冠心病患者中上调表达均差异显著,与测序结果一致。结论:初步从冠心病患者外周血样本中筛选出上调表达的LncRNA,这为后续深入研究奠定基础,为LncRNA用于冠心病临床早期筛查提供理论依据。

基于高通量测序技术的细菌非编码RNA研究方法进展

细菌非编码RNA指细菌中不编码蛋白质,而以RNA的分子形式起调控作用的一类核酸分子。高通量测序技术的应用极大地推进了多种细菌中非编码RNA的发现工作,但由于现阶段对细菌非编码RNA特征的认识尚不够深入,该领域测序数据的生物信息学分析还存在许多不足。介绍了应用高通量测序技术研究细菌非编码RNA的两种主要技术——RNA-seq技术和d RNA-seq技术,对现行的筛选非编码RNA的生物信息学分析方法进行综述,并对该领域生物信息学分析策略的改进提出设想。

利用siRNA高通量测序技术筛查蚊子体内携带的RNA病毒

昆虫可以利用小干扰RNA(siRNA)机制干扰体内RNA病毒的增殖,从而获得对该病毒的免疫能力。通过第二代测序技术对蚊子的小RNA进行高通量测序,再通过生物信息学方法寻找其中的RNA病毒序列,发现在我国云南地区的白纹伊蚊和致倦库蚊体内存在Marayo,Omsk hemorrhagic fever和Ilheus等RNA病毒的基因片段。至此建立了发现媒介昆虫体内携带病毒的一种新方法,可用于媒介昆虫携带RNA病毒的本底调查。

利用小RNA高通量测序筛查媒介昆虫携带的病原体

高通量测序方法筛查媒介昆虫携带病原体是一种新的重要方法。研究表明小RNA高通量测序可用于昆虫携带病毒的检测。本工作尝试用小RNA高通量测序法筛查昆虫携带的病毒，发现该方法不仅可用于媒介昆虫携带病毒的检测，也可以用于原核和真核病原体的筛查。用该方法对野外采集的3种蚊虫和3种蜱进行分析，用blast程序对NCBI核酸序列库（nt）进行比对搜索，从测序结果中查找到多种病毒、原核及真核的病原体。上述结果表明，小RNA高通量测序可以用于各种病原体的发现，有望发展成为一种通用的病原体筛查技术。

毛竹小RNA高通量测序及病毒分析

以毛竹叶片为材料,采用小RNA高通量测序结合生物信息学对小RNA数据库进行组装,进一步分析了毛竹中存在的病毒和类病毒,并采用RT-PCR和RACE进行验证。结果表明:在竹子样品中存在水稻东格鲁病毒(RTBV),覆盖率达到91.0%。在毛竹样品中扩增得到1 992 bp RTBV病毒类似序列,占其基因组的24.9%。RTBV病毒在多个毛竹样品中存在且不存在多态性。RTBV病毒可能是一个古老的植物病毒,在进化过程中禾本科植物将其序列整合到基因组中来防御RTBV病毒的浸染。

适合于高通量测序的槟榔总RNA的提取方法

为了获得能满足高通量测序要求的槟榔叶片总RNA,采用通用植物总RNA提取试剂盒和异硫氰酸胍-苯酚法提取槟榔叶片的总RNA。结果表明:异硫氰酸胍-苯酚法提取的总RNA完整性好、纯度高,通用植物总RNA提取试剂盒不能从槟榔叶片中提取完整的总RNA;70℃,10 min的热处理会导致槟榔总RNA的降解,苯酚/氯仿抽提能得到高纯度、完整性好的总RNA;总RNA质量浓度达到979 mg·L-1,OD260/OD280=1.98,OD260/OD230=2.31,能满足转录组高通量测序的要求。

高通量测序技术筛选口腔扁平苔藓患者组织中microRNAs的差异表达谱及分析

目的:通过高通量测序筛选口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)患者和正常人口腔黏膜组织中差异表达的微小RNA(miRNAs),探讨miRNAs在OLP发病机制中的作用。方法:收集3例就诊于河北医科大学第四医院口腔科的OLP患者病变组织(P组)和3例正常口腔黏膜组织(N组),进行illumina高通量测序,筛选差异表达的miRNAs,利用生物信息学分析对差异最显著的6个miRNA进行靶基因预测和功能富集分析。结果:应用DESeq软件,筛选出两组间差异表达的miRNAs共61个(|log2FoldChange|>1,P<0.05),其中表达上调的23个,下调的38个。选择上调(miR-449c-5p、miR-663b和miR-196a-5p)和下调(miR-133b、miR-1-3p和miR-133a-3p)最显著的miRNA各3个进行靶基因预测,GO分析显示这些靶基因主要富集在细胞膜区域,可能参与了细胞迁移、分化、代谢和分泌调节等生物过程,KEGG分析显示这些靶基因显著富集在MAPK、Rap1、NF-κB、Ras等信号通路上。结论:OLP和正常口腔黏膜之间存在差异表达的miRNA,这些miRNA可通过SEMA3F、HECW1、POLDIP等靶基因作用于MAPK、NF-κB、Rap1等通路,参与OLP的发生发展。

基于高通量测序的逆境下植物miRNA的研究现状

microRNA(miRNA)是一类包含20～30个核苷酸的非编码RNA分子,在植物的生长发育和适应外界各种环境胁迫的过程中起着非常重要的作用。植物中miRNA的数量和种类都很多,而高通量测序技术的出现大大加快了miRNA的发现过程。本文综述了近年来利用高通量测序技术进行的逆境下植物体内miRNA的研究状况,以反映当前植物miRNA的发现、功能和进化等方面的最新研究进展。

高通量测序技术检测非典型子宫内膜增生疾病微小RNA的差异表达

目的通过高通量测序技术探讨非典型子宫内膜增生(AEH)患者和正常女性子宫内膜组织中微小RNA(miRNA)的差异表达及意义。方法收集2016年1月~2017年1月在首都医科大学附属北京妇产医院就诊的3例AEH患者(实验组)及3名正常女性(对照组)的子宫内膜组织标本,采用二代高通量测序技术筛选差异表达的miRNAs,通过数据库预测其靶基因及生物功能,了解联系密切的miRNAs及其共同调控的靶基因。结果两组中,差异表达的miRNA共18个,其中上调17个,下调1个。差异miRNA的靶基因大部分富集在与癌症或机体代谢相关的信号传导通路上,其中miR-4286、miR-577、miR-182-5p之间有着密切关系,共同调节CACNA1C、MECP2、FOXK1、LPP、SH3TC2、Smad、MDM4等靶基因。结论AEH与正常子宫内膜组织中miRNAs表达存在显著差异,这些差异miRNAs可能通过调节不同靶基因来调控相关信号通路参与AEH的发生和发展。