构建以少突胶质细胞前体为主与人类早产儿脑室周围白质软化病理相似的动物模型

目的:建立以晚期少突胶质细胞前体为主、与人类早产儿脑室周围白质软化病理相似的可靠动物模型。方法:实验于2005-10/2006-06在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成。2d龄和7d龄SD同窝清洁级新生大鼠各43只,雌雄不拘,以随机数字表法分为4组,即2d龄模型组(n=25)、2d龄假手术组(n=18)、7d龄模型组(n=25)和7d龄假手术组(n=18),脑室周围白质软化动物模型建立:结扎双侧颈总动脉,手术时间短于10～15min,术后将新生大鼠送入缺氧箱缺氧30min,混合气体为体积分数0.08的O2和0.92的N2,输入流量为1～2.5mL/min。假手术组游离双侧颈总动脉,但不予结扎和缺氧。将各组大鼠分别于术后1d测定脑梗死体积,术后2d进行少突胶质细胞系列免疫组织化学染色分析、脑片TTC染色观察脑梗死情况以及光镜下脑病理研究,术后21d进行电镜下病理研究。结果:实验86只新生大鼠,14只制作脑室周围白质软化模型死亡,余72只计入统计。①术后1d各组脑片大体观察:模型组脑内呈现大面积白色梗死区,多为大脑前、中动脉供血区域,2,7d龄模型组梗死体积分别为(53.45±33.90),(68.78±20.22)mm3,梗死百分比分别为(24.98±15.44)%,(11.84±4.14)%;假手术组脑片颜色鲜红,未见白色梗死区。②新生大鼠少突胶质细胞系列标志物免疫组织化学结果:2d龄新生大鼠脑白质内以少突胶质细胞前体为主,7d龄新生大鼠则以成熟少突胶质细胞为主。模型大鼠的相应少突胶质细胞系列阳性标记物的积分吸光度值均显著低于同日龄对照新生大鼠(P<0.05～0.01)。③各组大鼠术后2d光镜下脑病理检查结果:2d龄模型组新生大鼠的脑室周围以及皮层下白质呈现囊性坏死和细胞凋亡,而皮质神经元损伤轻微;而7d龄模型组在白质和皮质部位均呈明显损伤。④术后21d电镜下各组幼鼠脑病理检查结果:2d龄模型组幼鼠的脑白质内未见髓鞘形成,7d龄模型组幼鼠中见少量髓鞘形成,而同日龄假手术对照幼鼠的脑白质内则髓鞘形成正常。结论:通过对2d龄新生大鼠双侧颈总动脉结扎伴缺氧30min缺氧缺血法创建的脑室周围白质软化新生大鼠模型中存在少突胶质细胞前体和少突胶质细胞的明显受损和丢失,成功建立了2d龄新生大鼠以少突胶质细胞前体为主、与人类早产儿脑室周围白质软化病理相似的脑室周围白质软化动物模型。

Erk信号途径在B104 CM诱导神经干细胞向少突胶质细胞前体分化中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(Erk)信号途径及下游转录因子cf-os、cj-un等在神经母细胞瘤B104细胞系来源的条件培养基(B104 CM)诱导神经干细胞(NSCs)向少突胶质细胞前体(OPCs)分化中的作用。方法从形态学上观察Erk1/2特异性抑制剂U0126阻断对B104 CM诱导NSCs向OPCs分化的影响;分别以Western blotting和RT-PCR法检测对照组、B104 CM诱导组和U0126预孵组NSCs中Erk的磷酸化和转录因子cf-os、cj-un、c-myc的表达情况。结果U0126预孵可阻断B104 CM诱导的NSCs向OPCs分化;B104 CM可引起NSCs中Erk1/2迅速磷酸化和cf-os、cj-unmRNA表达上调,该作用可被U0126阻断。结论B104 CM通过活化Erk信号途径及其随后上调转录因子cf-os、cj-un的表达诱导NSCs向OPCs分化。

细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用

背景:已有实验证实,脑白质病变如多发性硬化症和脑室周围白质软化等一些神经病变的发病机制,均涉及到局部小胶质细胞的激活。目的:探讨细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用。方法:取2d龄SD大鼠脑内小胶质细胞和少突胶质细胞前体共培养,分为共培养对照组和共培养脂多糖组。对共培养细胞经脂多糖100μg/L诱导48h,分别应用硝酸还原比色法检测一氧化氮含量,还原-比色法检测超氧阴离子含量,免疫细胞染色法检测过氧亚硝酸盐含量,Hochest33342/PI荧光染色法观察细胞死亡的形态学改变,以及流式细胞仪检测细胞成活率。结果与结论:与共培养对照组比较,脂多糖诱导导致共培养细胞内一氧化氮、超氧阴离子、过氧亚硝酸盐含量均明显增加,少突胶质细胞前体的凋亡率亦显著增加。通过体外观察,确认脂多糖诱导少突胶质细胞前体的死亡通路,是由于脂多糖诱导小胶质细胞激活,导致小胶质细胞表达一氧化氮合酶和活化NADPH氧化酶,致使其产物一氧化氮和超氧阴离子大量生成,两者进一步反应生成大量的毒性因子过氧亚硝酸盐,作用于少突胶质细胞前体,从而导致少突胶质细胞前体的死亡。

黄芪多糖抑制脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体毒性作用的影响

目的观察黄芪多糖对细菌脂多糖(LPS)诱导的活性小胶质细胞对少突胶质细胞(OL)前体的毒性作用的保护效果,并探讨其作用机制。方法建立原代大鼠小胶质细胞与OL前体共培养模型,分为共培养对照组、共培养LPS组以及共培养LPS+黄芪多糖组。对共培养细胞经LPS 100 ng/m L诱导后48 h,分别采用流式细胞仪检测OL前体细胞凋亡率,硝酸还原比色法检测一氧化氮(NO)含量,Western blot法检测诱生型一氧化氮合酶(i NOS)和Toll样受体4(TLR4)的蛋白表达。结果与共培养对照组比,共培养LPS组细胞凋亡增加,培养上清中的NO含量明显升高,小胶质细胞内i NOS和TLR4蛋白合成量明显增加。共培养LPS+黄芪多糖组OL前体的细胞凋亡率显著降低,因LPS诱导而增高的NO含量以及i NOS、TLR4蛋白的合成量显著抑制。结论黄芪多糖能抑制LPS诱导活性小胶质细胞对OL前体的毒性作用,其机制可能与抑制TLR4信号通路、减少i NOS和NO生成有关。

小胶质细胞和少突胶质细胞前体的培养和鉴定

目的 探讨新生大鼠脑组织小胶质细胞（MG）和少突胶质细胞（OL）前体的分离和体外培养方法 . 方法 取新生2 d SD大鼠脑组织,体外原代培养混合胶质细胞7 d后,分别采用＂改良振荡伴差速贴壁＂法和＂营养缺失伴振荡＂法纯化培养MG和OL前体,并分别应用免疫荧光染色异凝集素-B4（IB4）和OL前体标记物（O4）进行鉴定.结果 混合胶质细胞培养7 d后呈明显三层增长,其中MG位于上层,星型胶质细胞位于底层,两者之间为2型少突星型（O2A）祖细胞.纯化培养后OL前体胞体呈小圆形,有双极或三极突起,MG则以阿米巴形、圆形居多,或边缘呈毛刺状.免疫荧光染色IB4显示绿色荧光,MG纯度达到90%以上.免疫荧光染色O4显示棕黄色荧光,OL前体纯度达到95%以上. 结论 采用＂改良振荡伴差速贴壁＂法以及＂营养缺失伴振荡＂法分别成功获取大量纯度高、活力好的MG和OL前体.

姜黄素对H2O2诱导少突胶质细胞前体氧化应激损伤的保护作用

目的 观察姜黄素对过氧化氢（H：02）诱导少突胶质细胞（OL）前体细胞损伤作用的保护作用，并探讨其作用机制。方法 （1）体外原代培养OL前体细胞并加入0、100、250、500μmol／LH2O2作用30min，Hoechst33342／PI双染观察细胞凋亡和死亡情况；（2）将细胞分为正常对照组、模型组及5、10、20μmol／L姜黄素组，后3组细胞分别加入5、10、20μmol／L姜黄素孵育1h，后4组细胞均加入100μmol／L H2O2作用30min后，MTT法检测各组细胞存活率；（3）将细胞分为正常对照组、模型组及10μmol／L姜黄素组．进行相应处理后用流式细胞术检测细胞凋亡，分光光度法测定氧化／抗氧化物质含量，Western blotting法检测B细胞淋巴瘤基因-2、Bcl-2相关X蛋白和半胱天冬蛋白酶（caspase）．3、caspase．9蛋白的表达。结果 （1）与正常对照组比较，100、250、500μmol／L H2O2组正常细胞减少，凋亡和坏死细胞均增多，差异有统计学意义（P〈0．05）。100μmol／L H2O2组凋亡细胞多于坏死细胞，250、500μmol／LH2O2组坏死细胞多于凋亡细胞；（2）MTT检测显示5、10和20μmol／L姜黄素组细胞存活率高于模型组．且10和20μmol／L姜黄素组高于5μmol／L姜黄素组，差异均有统计学意义（P〈0．05）；（3）与模型组比较，10μmol/L姜黄素组凋亡和坏死细胞明显减少，且细胞总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶的活性增加，谷胱甘肽含量升高、丙二醛含量降低，Bcl-2表达升高、Bax、caspase-3、9的表达降低，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 姜黄素对氧化应激损伤的0L前体细胞具有保护作用，其机制可能与减轻OL前体的脂质过氧化、调节Bcl-2／Bax的表达以及抑制caspase-3、9的活化有关。

经脑室植入神经干细胞在脑室周围白质软化新生大鼠脑内的迁移分化

背景:对新生动物进行脑内神经干细胞移植,所植入神经干细胞的增殖、迁移、分化、轴突形成以及髓鞘化等能力,均远远高于成年动物。目的:对经脑室植入神经干细胞在脑室周围白质软化新生大鼠脑内的迁移分化功能进行观察,探讨神经干细胞移植对治疗早产儿脑室周围白质软化的可行性。方法:2日龄脑室周围白质软化新生大鼠在建模后72h进行经脑室神经干细胞移植。外源性神经干细胞用PKH26荧光素标记。脑立体定位仪下经脑室穿刺部位:前-后=1.5mm,中线-外侧=-2mm,深度=1.5mm;移植细胞浓度为5×1010L-1;移植总量为2μL;移植速度0.5μL/min。应用激光共聚焦显微镜分别对植入神经干细胞于植入后1,2,3,7,14,21d进行动态观察。并分别进行各分化细胞的免疫荧光分析。结果与结论:应用激光共聚焦显微镜对植入神经干细胞进行动态观察,证实经脑室植入的外源性神经干细胞在脑内具有良好的迁移能力,3d内大部分移行至脑室周围区域,并分布在损伤严重部位。2周左右,神经干细胞在脑室周围区域主要分化为OL前体,部分分化为神经元及星形胶质细胞。提示经脑室神经干细胞移植对早产儿脑室周围白质软化具有很大的治疗潜力。

脂多糖诱导小鼠脑组织小胶质细胞激活的跨膜转导机制

目的探讨脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞(MG)激活导致少突胶质细胞(OL)前体死亡的信号转导通路及LPS诱导MG激活的跨膜转导机制。方法取2日龄Toll样受体4(TLR4)基因缺失小鼠和野型小鼠脑内MG和OL前体共培养,分别分为共培养对照组和共培养LPS组。经LPS100 mg.L-1诱导48 h后,各组共培养细胞,应用硝酸还原酶-比色法检测其一氧化氮(NO)水平、还原-比色法检测其超氧阴离子(O2-)水平,免疫荧光染色法检测其过氧亚硝酸盐(ONOO-)水平,Hochest33342/碘化丙啶荧光染色法观察细胞死亡的形态学改变,流式细胞仪检测其细胞凋亡率。结果 LPS诱导引起野型小鼠共培养细胞内NO和ONOO-水平显著增加,OL前体坏死和凋亡率明显增高。但LPS诱导对TLR4基因缺失小鼠共培养细胞内NO和ONOO-水平以及OL前体坏死及凋亡率均无明显影响。2种小鼠共培养细胞内O2-水平在LPS的诱导下均显著提高。结论 LPS诱导MG激活的跨膜转导机制以及导致OL前体死亡的信号转导通路,必须依赖TLR4的介导。LPS诱导共培养细胞内O2-水平增加可能通过其他非TLR4受体依赖途径。

早产儿脑室周围白质软化的发病机制研究进展

脑室周围白质软化(PVL)是早产儿脑损伤的主要形式,也是早产儿脑性瘫痪和智力障碍的首要原因。患有这些神经系统疾病的低出生体重儿数量不断增加。PVL的启动因素是局部缺血和炎症反应,缺氧缺血和炎症启动兴奋性神经递质和自由基的相互作用,损伤易感的少突神经胶质细胞前体,引起PVL改变,导致脑性瘫痪。因此,预防PVL的发生与发展是降低早产儿脑瘫发病率的关键。而阻断这种机制能够阻止或改善PVL,从而减少或减轻早产儿脑性瘫痪。

咪康唑对大鼠缺氧缺血性早产儿脑白质损伤的保护作用

目的探讨咪康唑对早产儿脑白质损伤(WMD)大鼠髓鞘的保护作用。方法新生3日龄SD大鼠随机分为假手术组、WMD模型组、10 mg/(kg·d))和40 mg/(kg·d)咪康唑组,每组15只;采用结扎右侧颈总动脉,缺氧80 min的方法制作早产儿WMD模型。咪康唑组于建模后第1~5天腹腔注射10 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)咪康唑,WMD模型组注射等浓度二甲基亚砜(DMSO)。采用髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色及Western blot检测脑白质特异性MBP表达量,超微结构电镜观察髓鞘超微结构变化,并比较各组幼鼠体质量变化。结果 WMD大鼠经咪康唑治疗后,胼胝体MBP表达量较WMD模型组高,差异有统计学意义(P<0.05)。咪康唑治疗组MBP的表达量较模型对照组增高。模型对照组胼胝体髓鞘疏松,髓鞘内小空泡形成,呈筛网状改变,髓鞘厚度明显降低,结构紊乱。经咪康唑治疗后可明显改善缺氧缺血所致的脱髓鞘改变。WMD模型组幼鼠体质量增长速度较假手术组明显减慢,咪康唑治疗后大鼠的体质量生长速度增快。结论咪康唑可通过促进髓鞘形成保护新生大鼠脑缺氧缺血诱导的白质损伤,并改善大鼠的生长发育情况。

重组人红细胞生成素对脑白质损伤新生大鼠的神经保护作用

早产儿脑白质损伤是早产儿脑损伤的主要形式，常导致早产儿发生脑性瘫痪、认知以及视听障碍等严重后遗症，目前尚无有效防治方法。缺血缺氧时，脑血管自动调节能力受损，晚期少突胶质细胞前体对缺血缺氧具有易感性，

褪黑素对缺氧缺血所致的未成熟脑白质损伤大鼠的干预作用

目的 探讨褪黑素对缺氧缺血损伤后的未成熟脑白质的干预作用及其可能机制.方法 48只3日龄SD大鼠随机数字表法分为假手术组（SHAM组）、缺氧缺血组（HI组）和褪黑素干预组（MT组）.参照Rice模型制作脑室周围白质损伤（PWMD）动物模型,MT组分别于术前、术后、术后1h及术后24 h按10 mg/kg腹腔注射褪黑素溶液,SHAM组、HI组则在相同时间点腹腔注射等体积溶剂.分别于术后2d、14 d处死大鼠,断头取脑,应用HE染色、免疫组织化学法染色观察鼠脑脑室周围白质.结果 术后2d3组大鼠脑室周围白质组织学结构区别明显,O4阳性细胞数目在SHAM组[（75.548±7.333）/hpf]、MT组[（59.971±3.635）/hpf]、HI组[（40.511±2.848）/hpf]依次减少,差异有统计学意义（P＜0.05）;Caspase-3的表达在SHAM组（107.724±10.266）、MT组（132.289±8.537）、HI组（202.168±14.367）依次增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;术后14 d大鼠手术侧脑室指数在SHAM组（0.928±0.063）、MT组（1.813 ±0.110）、HI组（2.752±0.201）依次增大,髓鞘碱性蛋白（MBP）吸光度值则依次减少,分别为39.504±1.673,21.729±1.614,11.344±1.118.结论 MT可能通过抑制少突胶质细胞前体的凋亡对未成熟大鼠脑PWMD发挥保护作用.

早产儿脑室周围-脑室内出血与脑室周围白质软化的诊断建议

早产儿常见脑损伤主要为脑室周围．脑室内出血（PVH-IVH）和脑室周围白质软化（PVL），与早产儿中枢神经系统的解剖生理学和神经生物学发育不成熟密切相关。前者为出血性病变，常导致脑室内出血后脑积水和脑室周围出血性髓静脉梗死等严重并发症。后者为缺血性病变，也与官内感染有关。其中局部PVL的病理特征是白质少突胶质细胞前体的急性坏死，在后期可形成多发小囊腔。弥漫性PVL又称为弥漫性白质损伤，其病理特征是白质少突胶质细胞前体的凋亡性死亡，少见出现囊腔改变。局部和弥漫性PVL最终均导致脑白质容量减小和髓鞘化受损。PVH-IVH和PVL是引起早产儿早期死亡、脑瘫、视、听和认知障碍的主要原因。