基于AutoDock Vina筛选徐长卿抑制尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶有效组分的研究

目的基于分子对接方法筛选徐长卿抑制尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶的有效组分。方法使用AutoDock Vina软件对徐长卿[Cynanchum paniculatum(Bunge)Kitag]中化合物与尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)蛇毒金属蛋白酶进行分子对接,采用ADMET对较高结合能组分进行毒性分析,筛选有效抑制组分。结果与阳性对照穿心莲内酯的对接结合能比较,从徐长卿中筛选出17种具有较高结合能的化合物。通过SwissADME预测毒性,确定10种潜在的无毒性化合物,分别为Cinatratoside B、Paniculatumoside D、Glacoside A、Cynapanoside A、Paeonolide、Paniculatumoside A、Cynatratoside A、Paniculatumoside B、GreenOil、1,6-Dimethylnaphthalene。结论基于AutoDock Vina虚拟筛选,从徐长卿中筛选出10种具有潜在抑制尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶活性的化合物。

小叶三点金醇提物对尖吻蝮蛇毒的抑制作用

研究小叶三点金Desmodium microphyllum醇提物对尖吻蝮蛇Deinagkistrodon acutus蛇毒的抑制作用。将尖吻蝮蛇毒与不同比例小叶三点金醇提物在37℃下孵育30 min,检测对蛇毒中主要酶活力以及体内毒性的抑制作用。小叶三点金醇提物对尖吻蝮蛇毒中蛋白水解酶、磷脂酶A2、透明质酸酶以及纤维蛋白原水解酶均具有明显的抑制作用,对尖吻蝮蛇毒引起的小鼠出血、水肿、组织坏死以及致死毒性具有显著的中和作用,且呈剂量效应关系。首次证实了小叶三点金具有抑制尖吻蝮蛇毒的功效,为小叶三点金在蛇伤治疗中的应用提供了理论依据。

新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究

目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin0.5～2 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子Ⅱ和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成.

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素Ⅲ的荧光光谱

皖南尖吻蝮蛇蛇毒经分离和纯化得到出血毒素Ⅲ（ＡａＨⅢ），质谱测定分子量为２３，２８４．４±０．１。实验表明，Ｔｒｐ残基较大程度位于ＡａＨⅢ分子的疏水区。十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）和盐酸胍的加入使ＡａＨⅢ的分子构象发生变化，导致分子内色氨酸（Ｔｒｐ）残基的荧光淬灭。盐酸胍的加入使Ｔｒｐ残基的荧光发射峰位明显红移，表明位于ＡａＨⅢ分子较疏水环境的Ｔｒｐ残基相对外露。我们还就酸度、ＥＤＴＡ和金属离子对ＡａＨⅢ分子内Ｔｒｐ残基荧光光谱的影响进行了研究和讨论。

用尖吻蝮蛇毒、蝗蛇毒及抗蛇毒血清处理小鼠S_(180)、EAC腹水癌的初步观察

本文报道了尖吻蝮蛇毒、蝮蛇毒及抗蛇毒血清能使接种S_(180)、EAC腹水癌的小鼠明显延长存活时间、降低接种率,但不能完全阻止痛细胞生长。体外具有较明显的导致,菡细胞肿胀、膜破裂,核纤维化,坏死等。从腹水酶活力测定及抗血清初步研究结果表明,癌细胞病变中产生的某些抗原物质可能与蛇毒中的酶和毒蛋白相近。因此注射蛇毒后可在体内产生相关抗体,中和癌细胞产生的毒素以达到治疗目的。

尖吻蝮蛇蛇毒抗凝、纤溶组分的分离及对凝血系统的影响

目的:研究同一尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的类凝血酶和纤溶酶对凝血系统的影响。方法:采用DEAE-SepharoseCL-6B和Sephadex G-75层析法从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化获得类凝血酶和纤溶酶,通过体内实验,观察两者对凝血系统指标的影响。结果:从尖吻蝮蛇蛇毒中分别分离获得单一组分的类凝血酶和纤溶酶,它们的相对分子质量分别为39300和26600,体内实验证明,尖吻蝮蛇毒类凝血酶和纤溶酶都能明显延长全血凝固时间、活化的部分凝血酶原时间、凝血酶时间和凝血酶原时间,降低纤维蛋白原含量,但类凝血酶的作用更强,而纤溶酶在较大剂量时才显现抗凝作用,两者合用优于各自单用。结论:尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶和纤溶酶对动物体内的凝血系统有影响,两者合用具有明显的抗凝作用。

尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列抗原位点分析及免疫保护效果观察

目的采用生物信息学方法分析尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列的关键抗原位点,并观察根据这些位点设计合成的新型免疫原的免疫保护效果。方法扩增尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列,采用Jameson-Wolf方法和ClustalX软件结合的生物信息学方法分析其抗原位点,人工合成筛选的抗原位点序列,并连接到pIRESneo表达载体,3次(0、2、4周)对BALB/c小鼠进行核酸免疫,ELISA法测定免疫后机体抗体水平,出血中和实验和攻毒实验初步观察其免疫保护效果。结果生物信息学方法分析得到6个关键抗原位点(MPA-1～MPA-6);ELISA法检测抗血清结果表明,抗原位点序列诱导小鼠产生的抗血清相对未免疫的小鼠血清稀释100倍后仍能表现出阳性结果;出血中和实验和攻毒实验表明,将抗原位点序列免疫小鼠可以诱导机体产生免疫反应,使体内产生抗体,能有效中和蛇毒,从而对尖吻蝮蛇蛇毒引起的出血有防护作用。结论用生物信息学方法成功获得尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列的6个关键抗原位点,针对这些位点设计合成的新型免疫原展示出初步免疫保护效果。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒 (Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶 (Non- hem onrrhagicfibrinolytic enzym e,NHFL E)并对其理化性质进行研究。方法 :应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFL E,用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力 ,用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)测定其相对分子质量 ,用皮内出血实验测定其出血活性。结果 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶 ,它的相对分子质量为 2 5 0 0 0 ,没有出血活性 ,在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白 ,相对活性为粗毒的 3.2倍。结论 :从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为 2 5 0 0 0的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性 。

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。

中国福建尖吻蝮蛇蛇毒类凝酶止血作用的实验研究

目的 :研究中国福建尖吻蝮蛇蛇毒类凝酶止血作用及其作用机制。方法 :用断尾法测小鼠出血时间 ,观察止血剂量对家兔全血凝固时间及纤维蛋白原含量的影响。结果 :蛇毒类凝酶在 0 .0 0 0 1～ 0 .0 10 0 k U/ kg可使小鼠出血时间明显缩短 ,而当剂量增大到 3 .0 0 0 0 k U / kg时 ,则显著延长小鼠出血时间。其 0 .0 0 0 4～ 0 .0 0 3 6k U / kg剂量能使家兔全血凝固时间明显缩短 ,降低纤维蛋白原的含量。结论 :中国福建尖吻蝮蛇蛇毒类凝酶在小剂量时可作为止血药 ,它可能通过适度降低纤维蛋白原的含量 。

尖吻蝮蛇蛇毒中纤溶组分与铽的相互作用

利用平衡透析、原子吸收、荧光滴定和荧光寿命测定等方法确定了皖南尖吻蝮蛇蛇毒纤溶组分（FP）中Ca（2+）含量，并利用荧光光谱研究了Tb（3+）与FP中色氨酸（Trp）残基之间能量转移和FP中的微区结构。结果表明，每个FP分子中只含有一个Ca(2+)；Tb(3+)可完全取代FP中的Ca(2+)，FP中的Trp残基可将能量转移到结合在FP中的Tb(3+)上；研究还测得Tb(3+)与FP中Trp残基之间的距离约为0．375nm。

尖吻蝮蛇蛇毒中一种新型酸性磷酯酶的纯化和表征

从尖吻蝮蛇蛇毒中,通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、Blue胶和POROS HQ20离子交换色谱,分离纯化得到纯组分AA-PLA2-I,并证明其为新型酸性磷酸酯酶A2.经鉴定,该酶为分子量14.4 kD的单体蛋白,等电点5.66,不含中性糖基,N端序列为SLIQFETLIMKVVKK,其磷酸酯酶A2活性的最适温度和pH条件分别为50℃和pH10.此外,该酶蛋白酶活性较弱,无出血毒性,但具有抗凝血活性,且其抗凝血活性耐热至70℃.

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16kDa)的序列为:DCSSGWSSYEEHQYY,小亚基(15kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV。结论测序结果经NCBI数据库检索发现,Agacutin为新的蛇毒类凝血酶。

尖吻蝮蛇蛇毒对刚地弓形虫侵入宿主细胞的作用研究

目的 观察细胞培养系统中宿主细胞在不同剂量源自皖南地区的尖吻蝮蛇 (Agkistrodonacutus)蛇毒的作用下感染刚地弓形虫速殖子百分率的差异 ;探讨运用蝮蛇蛇毒作为辅助因子提高细胞培养用于弓形虫病病原学诊断的敏感性。方法 以尖吻蝮蛇蛇毒加入分孔培养的Hela细胞和THP - 1细胞中 ,分别用IFA和流式细胞仪进行检测 ,观察尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的影响。结果 在相同的时间内 ,在尖吻蝮蛇蛇毒的作用下 ,Hela细胞和THP - 1细胞感染弓形虫速殖子的百分率在不同的时段均明显的提高。结论 尖吻蝮蛇蛇毒可以促进弓形虫速殖子侵入宿主细胞 ,在实际应中 ,可以作为一种辅助因子在检测标本时提高速殖子检出率 。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤溶酶对大鼠的长期毒性试验

目的:研究无出血活性纤溶酶(Non-hemorrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)对大鼠的长期毒性,评价其安全性。方法:健康Wistar大鼠随机分为低、中、高剂量(2.25,4.5,9.0 mg·kg^(-1)·d^(-1))组及生理氯化钠注射液对照组,每组24只。尾静脉注射给药,每周给药7 d,连续给药4周,给药容积为10 mL·kg^(-1)。停药后24 h每组处死12只动物,余下动物继续观察2周后活杀检查。观察动物一般性状、体重、饮食等,检测血液学、凝血、血液生化、脏器系数及组织病理学改变。结果:NHFLE高剂量组大鼠在4周给药期出现多动、烦躁不安、轻微腹泻以及体重增长缓慢,以上改变在停药后恢复正常,其余动物各项检查未见异常。结论:NHFLE毒性较低。

皖南尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅳ的纯化与初步鉴定

从皖南尖吻蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎａｃｕｔｕｓ）毒液中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００两步凝胶柱层析首次纯化出一种中分子量出血毒素（简称ＡａＨⅣ）．经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和等电聚焦凝胶电泳测定其分子量为４４ｋＤ，等电点为ｐＨ５．０．从５００ｍｇ粗毒中可获得２０ｍｇＡａＨⅣ纯品．ＡａＨⅣ有较强的出血活性，最小出血剂量（ＭＨＤ）为０．４μｇ．

尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅱ的稀土离子荧光探针研究

尖吻蝮蛇毒抗凝血因子 ( ACF )分子中有两个钙离子结合位点 ,钙离子对 ACF 的内源荧光有增强作用 ,稀土离子 ( Nd3 +,Sm3 +,Eu3 +,Gd3 +和 Tb3 +)能取代 ACF 分子中的钙离子 ,并对 ACF 的内源荧光有不同程度的猝灭作用 ,其中 Tb3 +接受 ACF 分子中 Trp残基传递的能量后 ,特征荧光增强 .稀土离子与 ACF 荧光滴定表明 ,ACF 分子中有两个稀土离子结合位点 ,稀土离子和钙离子在 ACF 分子中两个结合部位是共同的竞争结合部位 .ACF 与不同稀土离子之间有相近的表观结合常数 K1 或 K2 .Tb3 +与 RE3 +( RE=Nd,Sm,Eu或 Gd)间线性自由能关系表明 ,稀土离子与 ACF 结合时 ,没有明显的空间效应 .ACF 分子中的两个结合位点在结构上都有较大的柔性 ,这种结构柔性为钙离子在 ACF 与活化凝血因子

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素的纯化与部分性质

目的 被尖吻蝮蛇 （ Ｄｉｅｎａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ） 咬伤会引起严重的出血， 对蛇毒出血毒素的研究有利于治疗蛇伤出血药物筛选。 方法 采用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５， Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０， Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００ 和两次 Ｐ Ｂ Ｅ 聚焦层析纯化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和等电聚焦电泳测定纯化样品的纯度和等电点。氨基酸组成用自动氨基酸分析仪测定。以小鼠背部皮下注射部位出血斑的面积来确定最小出血剂量和常规的方法测定酶活性。结果 从尖吻蝮蛇毒中纯化到一个相对分子量为５６ ０００ 的出血毒素 （ Ｄａ Ｈ Ｔ３）， 经氨基酸组成测定计算，它由 ４８７ 个氨基酸残基组成。此成分在 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ上显示出一条均一的蛋白染色带， 其ｐ Ｉ为５５０。该出血成分的最小出血剂量是 ２６μｇ， 具有蛋白水解酶活力， 其活力为 ３６８， 但没有精氨酯酶和磷脂酶 Ａ２ 活力。当加入 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 螯合剂去除金属离子后， 它们的出血活力和蛋白水解酶活力均丧失。 结论 这是从大陆尖吻蝮蛇毒中获得的一个新的出血金属蛋白酶 （ Ｄａ Ｈ Ｔ３）。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤溶酶的急性毒性实验

目的研究无出血活性纤溶酶(Non-hemorrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)的急性毒性,评价其安全性。方法尾静脉注射给药,观察记录给予NHFLE后昆明种小鼠的急性毒性反应。结果NHFLE的半数致死量(LD50)为28.84 mg/kg。结论急性毒性实验证实该药毒性低,临床应用安全性好。

抗尖吻蝮蛇蛇毒金属酶类共同基序IgY抗体的制备与研究

[目的]制备针对尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶类共同基序的Ig Y抗体,并对其中和蛇毒活性的作用进行研究。[方法]通过分析尖吻蝮蛇蛇毒各类金属蛋白酶类共有序列,设计合成与其酶活性密切相关且高度保守的抗原肽PT1和PT2;偶联复合物KLH-PT1、KLH-PT2免疫母鸡获得Ig Y抗体。采用ELISA和Western blot等方法对Ig Y效价及与尖吻蝮蛇蛇毒和短尾蝮蛇蛇毒的交叉反应特性进行初步研究;最后通过抗小鼠皮下出血实验对Ig Y中和活性进行评价。[结果]ELISA、Western blot结果表明,抗KLH-PT1、抗尖吻蝮蛇蛇毒Ig Y均可与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒发生交叉反应且后者显著强于前者;抗KLH-PT2 Ig Y在体外与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒无明显交叉反应,在体内抗出血实验中却表现出很强的中和毒性作用,并且显著优于前两者。[结论]通过设计金属蛋白酶共有序列抗原肽,制备了能与多种血循型蛇毒交叉反应的Ig Y抗体,这为制备特异、高效、低毒性且广谱的抗出血型蛇毒抗体奠定了基础。