紫杉醇对尤文肉瘤细胞系诱导凋亡及生长抑制的研究

目的 研究抗微管药紫杉醇在体外实验条件下对尤文氏肉瘤细胞系RD—ES的诱导凋亡及生长抑制作用。方法 不同浓度的紫杉醇作用于体外培养的RD—ES细胞,通过形态学观察,台盼兰染色,Gicmsa染色,流式细胞仪分析技术,原位末端标记分析凋亡细胞DNA降解产物等方法,观察紫杉醇诱导RD—ES凋亡的作用。结果 通过与其他化疗药物比较,及随时间剂量改变的情况,可见紫杉醇对RD—ES细胞的诱导凋亡作用呈时间,剂量依赖关系,细胞分裂受阻,凋亡峰明显,多核瘤细胞增多,胞浆中空泡明显。原位末端标记可见DNA降解后的阳性反应。结论 体外诱导实验证实紫杉醇对RD—ES细胞系的有丝分裂有明显的抑制作用及诱导凋亡作用且随时间,剂量增加而增大。

分化抑制因子基因沉默的人尤文肉瘤细胞系的建立

目的 应用短发夹RNA（shRNA）技术,构建分化抑制因子（Id2）基因稳定干扰的人尤文肉瘤细胞系,为进一步研究Id2在尤文肉瘤细胞生长、分化中的作用提供有用模型.方法 体外合成3条Id2序列特异性shRNA,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Id2真核表达载体,通过脂质体转染尤文肉瘤RD-ES细胞,采用Western blot方法检测Id2蛋白表达水平,采用细胞计数法检测shRNA转染后对细胞生长的影响,采用流式细胞术检测转染前后细胞周期的变化.结果 Western blot结果显示,稳定转染shRNA-Id2-543及shRNA-Id2-593的RD-ES细胞中Id2表达水平降低,与对照组相比分别下降54％及57％;转染组细胞的生长速度明显减慢,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）;细胞周期S期细胞比例分别为（36.60±1.53）％及（44.89±2.46）％,高于对照组的（29.73±2.03）％,差异有统计学意义（P＜0.05）,G2期比例无明显变化甚至降低.结论 成功建立Id2基因沉默的人尤文肉瘤RD-ES稳定转染细胞系.Id2表达下调可抑制尤文肉瘤细胞增殖,细胞周期阻滞于S期.Id2可能在尤文肉瘤细胞生长增殖中扮演重要角色.

尤文肉瘤EWS—FLI 1与特异序列结合并调节表达的研究

95％的尤文肉瘤家族（Ewing family of tumor，EFT）具有特异的EWS—FLI1融合基因。EWS—FLI1是一个比正常的FLI1强多许多倍的转录因子，并且可以与特异ACCGGAAGT基因序列结合。把该特异性结合序列插入到荧光素酶报告基因载体（pGL3-Promoter，promega公司）中，构建了新表达载体pS2。我们用脂质体法转染pS2到尤文肉瘤细胞系（RD—ES、SK—ES）及对照细胞系（NIH3T3、Hela），然后进行荧光定量检测，检测各组细胞系相对荧光强度。结果证实尤文肉瘤的EWS—FLI1确实能够与该特异序列结合并促进下游虫荧光素酶基因的高表达。