一株羊源尸毒梭菌的鉴定及生物学特性研究

为探究羊源尸毒梭菌的生物学基本特性,进行生理生化分析、16S rDNA基因扩增、动物回感试验、耐药表型和耐药基因检测等试验。结果显示,菌株LJH-1为革兰阳性菌。PCR扩增获得长度为1023 bp的片段。LJH-1与尸毒梭菌C4菌株聚类,从而判定LJH-1为尸毒梭菌。试验组小鼠全部死亡。小鼠肝中央静脉充盈大量红细胞,炎性细胞浸润,肾间质血管充血,肠黏膜上皮细胞脱落。LJH-1对头孢噻肟、氨苄西林等敏感,对头孢拉定、阿莫西林等耐药,并检出ant(3″)-Ia、aac(3)-IIa、aph(3′)-IIa、Sul2、Sul3和TEM耐药基因。这为该细菌性疾病的检测和防治提供了科学资料。

羊源尸毒梭菌三重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速检测羊源尸毒梭菌的方法,本研究参考尸毒梭菌23S rRNA基因、高致病性毒力岛irp2基因和溶血素hlyA基因的特异序列,设计合成3对特异性引物,通过优化条件建立了检测羊源尸毒梭菌的三重PCR方法,并评估了其特异性、敏感性和重复性。将尸毒梭菌人工感染小鼠,利用建立的三重PCR方法检测死亡小鼠各组织中的尸毒梭菌,并与16S rDNA PCR方法的检测结果相比较。结果显示,该三重PCR方法优化后的条件为:3对基因上、下游引物均为1μL终浓度均为10μmol/L,退火温度59℃。该方法仅对尸毒梭菌扩增出23S rRNA、irp2和hlyA 3个目的基因,而对蜡样芽孢杆菌、类志贺邻单胞菌、乳酸片球菌、藤黄微球菌、霍氏肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、柠檬酸杆菌及枯草芽孢杆菌均未扩增出目的基因;对尸毒梭菌DNA的最低检出量为2.76×101拷贝/μL,敏感性较高;该方法对同一稀释度及不同稀释度尸毒梭菌DNA的重复性检测结果均一致,重复性较好。人工感染1.5×109 cfu/mL的尸毒梭菌的小鼠12 h全部死亡,对照组小鼠未出现发病和死亡,且经本研究建立的三重PCR方法检测结果显示,每只死亡小鼠的肝脏、肾脏和肠道样品均为阳性结果,而其心脏、脾脏、肺脏检测结果均为阴性,与16S rDNA PCR方法的阳性检测结果均一致。本实验建立的致病性羊源尸毒梭菌三重PCR检测法特异性强、敏感性高、重复性好,为致病性羊源尸毒梭菌的检测和其感染的防治提供了技术支持。