高葡萄糖刺激血管内皮细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达上调、活性氧增加及细胞凋亡

目的研究在高葡萄糖刺激的条件下,人脐静脉内皮细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的表达、细胞内活性氧以及细胞凋亡的变化。方法倒置显微镜下观察人脐静脉内皮细胞形态;免疫荧光法检测人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的表达;高葡萄糖刺激人脐静脉内皮细胞,用逆转录聚合酶链反应检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4mRNA水平,Western blotting检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4蛋白表达的变化,DCFH-DA检测细胞内活性氧生成量,流式细胞仪和Hoechst染色检测细胞凋亡。结果高葡萄糖刺激人脐静脉内皮细胞时,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4mRNA及蛋白表达上调,细胞内活性氧生成增加,细胞凋亡增加。结论高葡萄糖处理促进人脐静脉内皮细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达上调并引起细胞内活性氧生成和凋亡增加。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4过表达对人脐静脉内皮细胞凋亡和活性氧水平的影响

目的研究尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4表达水平的改变对内皮细胞活性氧生成和凋亡的影响。方法转染尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4表达质粒或GFP质粒到人脐静脉内皮细胞和ECV304中,用逆转录聚合酶链反应检测转染后尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4mRNA的水平,用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平和细胞凋亡率,用Hoechst染色和TUNEL法观察细胞凋亡。结果转染后的人脐静脉内皮细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4mRNA水平明显高于GFP质粒组和对照组,不表达尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶的ECV304细胞系经转染后亦表达尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4mRNA;流式细胞仪检测发现,与GFP质粒组(ECV304和人脐静脉内皮细胞的凋亡率分别为1.56%±0.33%和4.56%±0.62%)和对照组(ECV304和人脐静脉内皮细胞的凋亡率分别为1.05%±0.25%和2.28±0.37%)相比,转染尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4质粒组内皮细胞的活性氧生成和凋亡率(ECV304和人脐静脉内皮细胞的凋亡率分别为9.60%±0.92%和12.41%±1.12%)明显增加(P<0.05,n=3);Hoechst和TUNEL染色发现,转染尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4质粒后有部分内皮细胞胞核出现凋亡特征性改变。结论尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4表达质粒可有效地转染人脐静脉内皮细胞,引起尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4mRNA水平升高;尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶4过表达可诱导人脐静脉内皮细胞凋亡。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在心肌细胞分化中的作用

目的探讨尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在心肌细胞分化中的作用。方法用核糖酶技术获得尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4低表达小鼠胚胎干细胞克隆,将小鼠胚胎干细胞分化为胚小体。应用荧光染料2,7二氯氢化荧光素二酯和定量氮蓝四唑试验检测活性氧水平;逆转录聚合酶链反应和Western blot测定尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶mRNA水平和心室肌肌球蛋白轻链2蛋白表达水平;DNA laddering检测细胞凋亡;原位杂交分析尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在胚胎心脏中的表达。结果活性氧清除剂N乙酰基半胱氨酸、过氧化氢酶和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抑制剂二甲苯基碘可抑制胚胎干细胞分化成心肌细胞,而较低浓度(1nmol/L^100nmol/L)的过氧化氢可明显促进心肌细胞分化,但较高浓度(1μmol/L)的过氧化氢显示出抑制作用(P<0.001)。实验发现,心肌细胞分化过程中内源性活性氧的产生主要来自尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4。应用核糖酶技术抑制胚胎干细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的表达,可引起活性氧水平下降(P<0.001),肌球蛋白轻链2含量显著降低,使心肌细胞的分化受到明显的抑制(P<0.001)。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的高水平表达使干细胞产生大量活性氧,也显著抑制心肌细胞的分化(P<0.05)。结论尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4通过产生活性氧在心肌细胞分化中起关键作用。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与动脉粥样硬化

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是一种多亚单位酶复合体,是细胞中一种可诱发的电子传递系统。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶目前被认为是血管内生成活性氧的主要酶体,它的激活受蛋白激酶C等信号途径介导。研究表明NADPH氧化酶和近年来新发现的gp91phox同工酶即NOX蛋白家族可能通过损伤血管内皮、促进低密度脂蛋白氧化等参与动脉粥样硬化的发生和发展。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、氧化应激和心力衰竭

活性氧增加与心力衰竭密切相关,产生活性氧的主要酶体是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶,它广泛存在于吞噬细胞外的其他组织细胞。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶过度激活所介导的氧化应激损伤参与心力衰竭的发生发展。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与心房颤动的研究

心房颤动是最常见的心律失常,其发生和维持的分子机制尚未明确。近年来发现心房颤动存在氧化应激,并已从动物实验、临床试验等多方面证实其主要来源为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶,推测NADPH氧化酶可能在心房颤动发生发展过程中起重要作用。以NADPH氧化酶为靶点的心房颤动干预措施如肾素-血管紧张素系统抑制剂和他汀类等也愈受关注。

芦丁通过靶向烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4调控活性氧/低氧诱导因子-1α信号参与子宫内膜异位细胞增殖迁移侵袭及凋亡

目的探究芦丁对子宫内膜异位细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用及其可能的作用机制。方法人子宫内膜异位细胞CRL-7566经不同浓度芦丁作用不同时间后,采用CCK-8法检测细胞活性。CRL-7566细胞经烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)过表达质粒(ov-NOX4)转染后,给予70μM芦丁处理。CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖;划痕和transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹法(Western Blot)检测增殖相关蛋白表达;RT-qPCR和Western Blot检测转移、凋亡相关蛋白、NOX4及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达;DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)水平。结果经芦丁处理后,CRL-7566细胞活性(71.06±0.61 vs.100.00±0.45)、克隆形成(38.38±2.71 vs.100.00±1.06)、迁移(46.04±2.95 vs.89.23±2.47)及侵袭能力(36.08±3.23 vs.135.33±6.49)降低,而凋亡能力(13.33±0.88 vs.4.54±0.57)增强,差异均有统计学意义(t=66.08、51.77、38.89、47.45及20.57,均P<0.05);且ROS生成减少(0.07±0.00 vs.1.00±0.06;t=40.45、P<0.05),NOX4 mRNA(0.28±0.06 vs.1.00±0.10;t=11.04、P<0.05)和蛋白表达(0.27±0.01 vs.1.00±0.05;t=33.56、P<0.05)、HIF-1α(0.39±0.05 vs.1.00±0.07;t=11.85、P<0.05)mRNA和蛋白表达(0.31±0.01 vs.1.00±0.05;t=31.02、P<0.05)降低。NOX4过表达可部分逆转芦丁对CRL-7566细胞活性(90.09±1.11 vs.70.92±0.72;F=585.00)、克隆形成(80.64±2.50 vs.41.85±0.80;F=2583.00)、迁移(65.41±1.54 vs.48.63±5.54;F=236.10)、侵袭(71.67±3.75 vs.35.42±2.94;F=1927.00)、凋亡(7.93±0.52 vs.13.32±0.85;F=198.00)、ROS生成(0.26±0.02 vs.0.07±0.01;F=1104.00)、NOX4 mRNA(0.63±0.03 vs.0.33±0.02;F=169.90)和蛋白表达(0.68±0.05 vs.0.29±0.02;F=510.60)及HIF-1αmRNA(0.64±0.06 vs.0.36±0.10;F=42.40)和蛋白表达(0.71±0.05 vs.0.29±0.01;F=508.00)的影响(均P<0.05)。结论芦丁可抑制子宫内膜异位细胞增殖、迁移及侵袭,并促进细胞凋亡,其机制可能与靶向NOX4并阻断ROS/HIF-1α信号有关。

基于ROCK/NOX4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响

目的基于RAS同源基因家族成员相关激酶(ROCK)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响。方法SPF级健康8周龄雄性C57BL/6大鼠60只,随机分为5组,各12只,健康组、模型组、刺芒柄花素低、中、高组,除健康组外均建立2型糖尿病大鼠模型,刺芒柄花素低组、刺芒柄花素中组、刺芒柄花素高组分别给予20、40、100 mg/kg刺芒柄花素灌胃,其余组别灌胃等体积生理盐水。采用自动生化分析仪测定肾功能指标。苏木素-伊红(HE)染色与Masson染色观察大鼠肾组织病形态。TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡。免疫组化检测RAS同源基因家族成员(Rho)A、NOX4、ROCK阳性表达。Western印迹检测内质网应激相关蛋白表达。结果HE染色结果显示:健康组肾脏组织结构正常;模型组肾小球有一定程度萎缩,组织结构排列不均匀,并且有肿胀、脱落现象、还存在空泡样变性、鲍曼囊腔扩,而经过刺芒柄花素干预后,上述情况有所改善,且呈现出明显的剂量依赖性。Masson染色结果显示:健康组肾组织正常;模型组肾小球、肾小管基底膜增厚,产生空泡样病变,肾间质胶原纤维沉积明显;在经过刺芒柄花素干预后上述状况明显改善,且呈现出明显的剂量依赖性。健康组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著低于模型组(P<0.05)。模型组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素低组(P<0.05)。刺芒柄花素低组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素中组(P<0.05)。刺芒柄花素中组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素高组(P<0.05)。结论刺芒柄花素可能是通过调控Rho/ROCK/NOX4信号通路抑制了2型糖尿病大鼠内质网应激,改善肾功能,对肾脏起保护作用。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介导骨形态发生蛋白4引起大鼠肺动脉平滑肌细胞内经典瞬时受体电位通道蛋白1和6上调

肺动脉高压（ pulmonary artery hypertension, PAH）是一类以静息状态下平均肺动脉压（mean pulmonary arterialpressure ,mPAP） ≥ 25 mmHg（ 1 mmHg =0. 133 kPa）为特征的疾病。其涉及疾病广，危害大，且缺乏有效的治疗手段。近年来对PAH的研究取得了较大的进展，但其发病机制仍不十分清楚。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4阻断剂对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经凋亡的影响

目的探讨糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠坐骨神经烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)表达改变及Nox4阻断剂VAS2870对DPN大鼠坐骨神经凋亡的影响。方法40只8周龄雄性SD大鼠,平均体重(203.5±6.4)g,30只大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ),其中20只患糖尿病,余10只大鼠淘汰;其余大鼠腹腔注射等体积柠檬酸溶液作为对照组(n=10)。8周后糖尿病大鼠建立DPN模型,采用随机数字表法将DPN大鼠分为2组,VAS2870组(n=10,尾静脉注射VAS28701 mg/kg,每日1次,共7 d)和DPN组(n=10,尾静脉注射等体积0.9%无菌NaCl溶液,每日1次,共7 d)。用PowerLab数据记录分析系统检测坐骨神经运动神经传导速度(MNCV)和感觉神经传导速度(SNCV),用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)检测坐骨神经Nox4、半胱氨酸天冬酶-3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达,用蛋白印迹检测坐骨神经Nox4、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平,采用单因素方差分析比较各组间的差异,用Tukey检验进行两两比较。结果DPN大鼠坐骨神经MNCV[(41.21±7.36)m/s]及SNCV[(30.39±7.66)m/s]均低于VAS2870组[(49.14±8.67)m/s,(38.95±6.24)m/s],VAS2870对MNCV及SNCV的下降具有减轻作用(q=3.58,4.53;均P<0.05)。DPN大鼠坐骨神经Nox4(4.72±0.42)、caspase-3(5.02±0.43)、Bax(5.63±0.82)mRNA(q=7.02,6.40,7.65;均P<0.05)及蛋白水平(0.86±0.10,0.78±0.17,0.95±0.13,q=7.83,9.15,6.87;均P<0.05)较对照组mRNA(5.79±0.53,6.90±0.79,7.39±0.67)及蛋白水平(0.59±0.13,0.45±0.14,0.64±0.14)表达上调,Bcl-2 mRNA(6.81±0.60,q=6.31,P<0.05)及蛋白水平(0.44±0.12,q=6.20,P<0.05)表达下调。VAS2870组Nox4、caspase-3、Bax mRNA(5.31±0.44,5.71±0.60,6.41±0.95)(q=3.66,2.98,4.02,3.38;均P<0.05)及蛋白水平(0.72±0.13,0.60±0.18,0.79±0.15)(q=4.24,5.78,3.83;均P<0.05)均低于DPN组,Bcl-2 mRNA(6.29±0.47)的及蛋白水平(0.56±0.12)表达均高于DPN组(q=3.38,2.81;均P<0.05),VAS2870部分逆转了Nox4、caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达水平。结论DPN大鼠坐骨神经Nox4表达水平增高,通过调节凋亡相关蛋白caspase-3、Bax及Bcl-2表达促进坐骨神经凋亡;Nox4阻断剂通过减轻坐骨神经凋亡发挥恢复DPN大鼠坐骨神经传导速度的作用。

抑制Wnt/β-catenin信号和NOX4表达阻碍二氧化硅诱导肺上皮细胞损伤的修复

目的探究Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)相互作用对二氧化硅(SiO_(2))诱导的肺脏上皮细胞增殖的影响。方法采用二氧化硅气道滴灌C57BL/6小鼠制备小鼠矽肺模型,免疫组织化学染色法检测矽肺模型小鼠肺组织NOX4的表达;二氧化硅刺激BEAS-2B人肺上皮细胞制备上皮细胞氧化损伤细胞模型,Wnt信号活化的条件培养基(Wnt3a-CM)及Wnt信号抑制剂XAV939改变Wnt信号活性,表达NOX4短发夹RNA(NOX4 shRNA)的腺病毒感染人肺上皮细胞敲低细胞NOX4水平。Western blot法检测肺组织和人肺上皮细胞Wnt3a、活化β联蛋白(ABC)、转录因子4(TCF4)、NOX4和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达;CCK-8法检测不同剂量二氧化硅刺激人肺上皮细胞24 h和48 h对细胞存活率及敲低NOX4的表达对细胞增殖的影响;CellROX?荧光探针负载法检测二氧化硅作用下人肺上皮细胞活性氧(ROS)的水平。结果成功制备小鼠矽肺模型和氧化损伤细胞模型。二氧化硅刺激肺脏上皮细胞可显著激活Wnt/β-catenin信号和诱导NOX4表达,使ROS大量释放,而ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)与二氧化硅共同作用可抑制ROS的释放,进而抑制Wnt/β-catenin信号ABC蛋白表达;Wnt3a-CM诱导的Wnt信号激活可上调NOX4的表达;反之,Wnt信号抑制剂XAV939则抑制NOX4的表达;而敲低NOX4表达后,可显著抑制Wnt/β-catenin信号ABC蛋白和cyclin D1的表达,抑制细胞增殖。结论阻断Wnt/β-catenin信号、下调NOX4表达抑制肺上皮细胞增殖,抑制二氧化硅诱导的肺脏上皮细胞损伤修复。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚单位4在草酸钙结石患者肾乳头中的表达及其机制

目的探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚单位4(Nox4)在草酸钙结石患者肾乳头中的表达及其作用机制。方法通过GEO数据库检索Randall钙斑芯片,按照GSE73680的样本描述,将样本分为无结石对照组(6例)和草酸钙结石组(24例)。采用GEO2R分析正常人肾乳头和草酸钙肾结石患者肾乳头组织中Nox4及成骨相关蛋白基因的表达差异变化。采用高钙处理大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),免疫荧光技术(IF)检测Nox4的表达,蛋白质印迹法(Western blot)检测Nox4和骨形态发生蛋白(BMP-2)的表达,化学发光法测定氧化应激标志物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。组间比较采用t检验。结果GEO2R分析结果显示Nox4在草酸钙结石组表达升高,差异表达倍数为0.726倍(t=2.040,P<0.05),基质Gla蛋白(MGP)在草酸钙结石组表达下降,差异表达倍数为-1.228倍(t=-1.230,P>0.05),骨钙素(OCN)在草酸钙结石组表达升高,差异表达倍数为0.439倍(t=1.241,P>0.05),骨保护素(OPG)在草酸钙结石组表达升高,差异表达倍数为0.639倍(t=0.888,P>0.05),骨桥蛋白(OPN)在草酸钙结石组表达升高,差异表达倍数为1.664倍(t=1.171,P>0.05)。免疫荧光结果显示高钙处理的NRK-52E细胞中Nox4的平均荧光吸光度明显高于对照组(0.651、1.446、1.480,t=8.023、6.477,P<0.05)。Western blot显示相对于未处理的正常对照组,高钙处理的NRK-52E细胞中Nox4的表达明显增加(0.426、0.594、0.734,t=28.954、53.082,P<0.01),BMP-2表达也呈增高趋势(0.242、0.472、0.676,t=12.765、14.257,P<0.01)。此外,高钙处理NRK-52E细胞后,MDA含量增加(0.188、0.390、0.650,t=2.679、6.686,P<0.05),SOD活性下降(40.630、38.060、36.230,t=4.079、10.390,P<0.05)。结论Nox4在肾结石患者肾乳头中表达明显增加,Nox4介导的氧化应激可能在肾结石形成过程中发挥重要作用。

慢性阻塞性肺疾病合并肺动脉高压患者血清活性氧和硫化氢水平及肺组织还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶-4和胱硫醚-γ-裂解酶表达及其意义

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重期患者血清活性氧(ROS)、硫化氢(H2S)水平,及COPD 稳定期患者肺组织中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶-4 (NOX4)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)表达及其意义.方法(1)选2015年11月至2016年12月在宁夏回族自治区人民医院呼吸科住院的COPD急性加重患者60例,根据是否合并肺动脉高压(PH)分为COPD急性加重合并PH组和COPD急性加重未合并PH组,另选同期健康体检者30例为健康对照组,采用酶联免疫法测3组受试者血清ROS、H2S水平.(2)收集2012年11月至2017年4月在宁夏回族自治区人民医院心胸外科因肺癌行肺叶切除42例患者的肺组织,根据是否合并PH分为COPD稳定期合并PH组和COPD稳定期未合并PH组、对照组,免疫组化法测3组患者肺组织NOX4、CSE表达,并观察肺小动脉壁厚度.结果(1)COPD急性加重合并PH组患者血清ROS水平[(613.52± 69.66)IU/ml]高于COPD急性加重未合并PH组[(565.76±71.33)IU/ml]、健康对照组[(294.63±60.39) IU/ml],COPD急性加重未合并PH组患者血清ROS水平高于健康对照组(P<0.05).COPD急性加重合并PH组患者血清H2S水平[(18.59±5.50)nmol/ml]低于COPD急性加重未合并PH组[(20.49± 4.97)nmol/ml]、健康对照组[(38.03±4.43)nmol/ml],COPD急性加重未合并PH组患者血清H2S水平低于健康对照组(P<0.05).ROS水平与肺动脉收缩压(PASP)呈正相关(r=0.59,P<0.05),H2S水平与PASP呈负相关(r=-0.62,P<0.05).(2)COPD稳定期合并PH组肺组织NOX4表达(0.08±0.01)高于COPD稳定期未合并PH组(0.06±0.01)、对照组(0.03±0.01),COPD稳定期未合并PH组肺组织NOX4表达高于对照组(P<0.05).COPD稳定期合并PH组肺组织CSE表达(0.03±0.01)低于COPD稳定期未合并PH组(0.07±0.02)、对照组(0.12±0.02),COPD稳定期未合并PH组肺组织CSE表达低于对照组(P<0.05). COPD稳定期合并PH组WT%[(40.58±6.63)%]高于COPD稳定期未合并PH组[(36.87±5.60)%]、对照组[(31.27±6.24)%],COPD稳定期未合并PH组WT%高于对照组(P<0.05).COPD稳定期合并PH组WA%[(32.33±6.27)%]高于COPD稳定期未合并PH组[(30.20±5.28)%]、对照组[(25.20±4.31)%],COPD稳定期未合并PH组WA%高于对照组(P<0.05).NOX4表达与WT%、WA%呈正相关(r值分别为0.81、0.66,P值均<0.05),CSE表达与WT%、WA%呈负相关(r值分别为-0.55、-0.39,P值均<0.05).结论 NOX4/ROS和CSE/H2S信号通路在COPD合并PH的发病机制中可能起重要作用.

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在血管性认知障碍中的作用及其机制的研究进展

氧化应激(OS)是导致血管性认知障碍(VCI)的因素之一。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)产生的活性氧(ROS)是VCI重要的致病分子。VCI的危险因素如高血糖及缺血/再灌注等在上游增加NOX的活化;其他危险因素如高龄、高血压及卒中是NOX依赖ROS产生的下游损伤。VCI的成因包括与NOX相关的危险因素及NOX依赖的ROS导致的细胞损伤。研究表明,抑制NOX活性可减轻认知障碍、降低其发生的危险因素。本文对NOX在VCI中的作用及其机制的研究进展进行综述。

NADPH氧化酶4抑制剂对缺氧诱导的人RPE细胞中VEGF表达的抑制作用

目的观察还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶4(NOX4)抑制剂对缺氧诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法将APRE-19细胞分为Avastin干预组和VAS2870干预组,并按照药物剂量不同将Avastin干预组亚分为常氧对照组、缺氧对照组及0.25 mg/ml、0.50 mg/ml和0.75 mg/ml Avastin干预组,将VAS2870干预组亚分为1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组,缺氧对照组采用终浓度为300μmol/L CoCl2处理ARPE-19细胞以建立细胞化学缺氧模型。采用细胞免疫荧光染色技术对不同干预组细胞中NOX4和VEGF表达进行测定和定位,采用Western blot法对不同干预组细胞中NOX4和VEGF蛋白相对表达量进行测定和比较。结果Western blot法检测显示,常氧对照组、缺氧对照组及0.25 mg/ml、0.50 mg/ml和0.75 mg/ml Avastin干预组NOX4蛋白相对表达量分别为0.657±0.153、1.000±0.200、1.206±0.300、1.260±0.200和1.413±0.273,VEGF-A蛋白相对表达量分别为0.821±0.110、1.210±0.100、0.672±0.100、0.340±0.120和0.300±0.130,组间总体比较差异均有统计学意义(F=17.631,P<0.001;F=4.777,P=0.020),其中0.75 mg/ml Avastin干预组细胞中NOX4蛋白表达量明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.001),0.25、0.50和0.75 mg/ml Avastin干预组VEGF-A表达量均明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。常氧对照组、缺氧对照组及1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中NOX4的蛋白相对表达量分别为0.970+0.120、1.060+0.130、0.880+0.130、0.567+0.135和0.450+0.120,VEGF-A蛋白相对表达量分别为0.387+0.135、0.627+0.125、0.370+0.140、0.363+0.140和0.160+0.100,组间总体比较差异均有统计学意义(F=12.933,P<0.001;F=4.948,P<0.05),其中3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中NOX4蛋白相对表达量明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.001);1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中VEGF-A蛋白相对表达量明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论NOX4抑制剂可抑制人RPE细胞中VEGF-A表达。

NOX4对高糖代谢乳腺癌细胞侵袭转移能力的作用

利用2-氟[18F-2]脱氧葡萄糖([18 F]fluorodeoxyglucose,18F-FDG)乳腺癌细胞摄取实验筛选高糖酵解率的乳腺癌细胞;采用基因沉默技术,降低细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX 4)表达;采用免疫印迹方法检测三组细胞(空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性NOX 4-siRNA转染组)的上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关分子HIF-1α和TGF-β表达水平;通过细胞侵袭实验分析三组细胞的侵袭能力差异。结果显示,高侵袭力的MDA-MB-231较低侵袭力的MCF-7乳腺癌细胞系具有高糖酵解率(t=10.52,P<0.05);抑制MDA-MB-231细胞的NOX 4表达,降低了细胞EMT相关因子HIF-1α、TGF-β表达(P均<0.01)与细胞侵袭能力(t=-8.0,P<0.01)。本研究初步证实NOX 4失活能够降低高糖代谢乳腺癌细胞的侵袭转移能力。

NOX4的表达与非小细胞肺癌预后的关系

目的探索烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)的表达与非小细胞肺癌预后的关系。方法收集经病理确诊为肺原位癌和不典型增生患者的石蜡包埋标本作为癌前病变组(20例),选取经病理确诊的非小细胞肺癌患者石蜡包埋的手术标本作为肺癌组(40例),以及经病理确诊为肺癌转移性胸腔积液沉渣的石蜡包埋标本作为肺转移癌组(17例),采用免疫组织化学的方法分别检测各组肺组织标本NOX4的表达情况。分析NOX4蛋白的表达与非小细胞肺癌临床参数,即年龄、性别、吸烟史、肿瘤类型、肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移的相关性,并分析NOX4蛋白的表达与患者预后生存的关系。结果NOX4主要表达部位为细胞胞浆及胞核,在癌前病变组、肺癌组及肺转移癌组中NOX4表达的平均光密度值分别为10.06±2.32、19.47±4.71和18.44±3.62,3组比较差异具有统计学意义(P<0.05),肺癌组及转移癌组比癌前病变组表达升高(P<0.05),而肺癌组及转移癌组中NOX4表达差异无统计学意义(P>0.05);在非小细胞肺癌组织中,NOX4的表达与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05),并且Kaplan-Meier曲线显示高NOX4表达的患者总体生存率明显低于NOX4低表达或阴性的患者(P<0.05),COX生存分析显示NOX4是影响非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素。结论非小细胞肺癌肿瘤组织及转移灶内存在NOX4高表达,NOX4的阳性表达与非小细胞肺癌患者预后密切相关,NOX4可能通过氧化-抗氧化的信号途径参与肿瘤侵袭转移的过程,因此NOX4可能是一个良好的预后标志物。

益气活血通络方对糖尿病肾病大鼠肾组织RAGE/NOX4/ROS信号通路及氧化应激的影响

目的:观察益气活血通络方对糖尿病肾病(DKD)大鼠模型晚期糖基化终末产物受体(RAGE)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)/活性氧(ROS)信号通路以及氧化应激的影响,探讨其治疗DKD的可能作用机制。方法:雄性SD大鼠40只随机分为正常对照组(CON)和造模组。造模组大鼠通过为期6周的高糖高脂饲料饲养,联合链脲佐菌素(每kg大鼠体质量注射35 mg链脲佐菌素)建立DKD大鼠模型,成模大鼠随机分为模型组(MOD)、益气活血通络方低剂量组(DL)、益气活血通络方高剂量组(DH)、厄贝沙坦组(IRB)进行灌胃,给药组分别灌胃给药20周,期间CON组及MOD组予等量生理盐水。给药结束后全自动分析仪检测各组大鼠尿微量白蛋白与尿肌酐比值(UACR),羟胺法检测血清锰超氧化物歧化酶(SOD2)活性,TBA法检测血清丙二醛(MDA)浓度;HE染色法、Masson染色法、PAS染色法观察各组大鼠肾组织病理形态学变化;二氢乙锭(DHE)荧光探针检测大鼠肾组织ROS表达;免疫组化法(IHC)检测大鼠肾组织RAGE、NOX4蛋白表达;Western blot法检测SOD2、RAGE、NOX4蛋白表达;Real-time PCR检测大鼠肾组织NOX4 mRNA表达;结果:与CON组比较,MOD组大鼠UACR值显著升高,SOD2活性显著降低,MDA浓度明显升高(P<0.01),有明显肾脏病理损伤表现,肾小球肥大,基底膜明显增厚,系膜基质增生,部分出现K-W结节,肾小管上皮细胞泡沫样变,提示模型制备成功;另外,ROS表达增多(P<0.05),NOX4、RAGE蛋白在肾小球系膜细胞表达显著升高(P<0.01),NOX4的mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01),SOD2蛋白表达水平显著降低,NOX4、RAGE蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与MOD组比较,DH组及IRB组UACR、MDA含量水平明显降低,SOD2活性升高(P<0.05,P<0.01),DL组差异无统计学意义;肾组织病理学明显改善;DL组、DH组、IRB组RAGE、NOX4的蛋白表达减少(P<0.05,P<0.01);DH组ROS表达减少(P<0.05);DH组、IRB组SOD2蛋白表达升高,NOX4 mRNA,RAGE、NOX4蛋白表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论:益气活血通络方可能通过RAGE/NOX4/ROS通路减少了DKD大鼠ROS的生成,缓解氧化应激,减少蛋白尿,从而起到明显的减轻肾脏损害及延缓病程进展作用。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4上调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ表达的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅱ(SPⅡ)与肝细胞蛋白——尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4(NADHDH4)结合机制及其调节功能。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术,参照HBVayw基因序列与NADHDH4cDNA序列全编码区设计相应引物,以pCP10质粒及肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增SPⅡ和NADHDH4的DNA片段,将其分别克隆至pCAT3及pcDNA3.1(-)中,构建pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体和pcD-NA3.1(-)-NADHDH4真核表达载体,以其质粒共转染HepG2细胞。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体对pcDNA3.1(-)-NADHDH4真核表达载体的调节活性。结果成功构建了pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体和pcDNA3.1(-)-NADHDH4真核表达载体,pCAT3-SPⅡ实验组酶表达为pCAT3的2.8倍,而pcDNA3.1(-)-NADHDH4+pCAT3-SPⅡ实验组酶表达约为pCAT3-SPⅡ的5倍,结果显示NADHDH4对HBVSPⅡ具有上调作用。结论共转染实验证实了NADHDH4对SPⅡ有明显的上调作用,为进一步阐明乙型肝炎病毒致病的分子生物学机制奠定了基础。

沉默NOX4对百草枯诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化应激和凋亡的影响

目的通过siRNA沉默人肺泡Ⅱ型上皮样A549细胞中NOX4基因,探讨NOX4在百草枯诱导肺泡上皮细胞凋亡中的作用。方法根据GeneBank中NOX4全长cDNA序列,选取特异性序列为干扰作用的靶点,构建NOX4 siRNA表达载体,脂质体介导转染A549细胞,筛选出最佳干扰siRNA。实验设置正常对照组、PQ组、PQ+转染组及转染对照组。正常对照组仅给予培养基处理24 h,PQ组加入百草枯(700μM)处理24 h,PQ+转染组给予NOX4 siRNA转染细胞48 h后,用含百草枯(700μM)的DMEM培养液培养24 h,转染对照组仅加入NOX4 siRNA。结果与正常对照组相比,PQ组A549细胞活力下降,细胞凋亡率显著升高,NOX4表达明显增加,MDA含量显著增加,ROS水平明显升高;与正常对照组相比,转染对照组仅见NOX4表达显著降低;而与PQ组相比,PQ+转染组细胞活力上升,细胞凋亡率显著减低,NOX4表达明显降低,MDA含量显著减少,ROS水平亦显著下降。结论降低NOX4表达可抑制PQ诱导的A549细胞氧化应激和凋亡。这一结果可能为肺纤维化提供了新的治疗靶点。