尾丝蛋白在噬菌体吸附鸭疫里默氏菌中的作用

【目的】以鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)噬菌体CRP2为对象,研究尾丝蛋白(Tail fiber protein,TFP)对噬菌体吸附功能的影响。【方法】克隆ORF70假定的TFP基因,构建重组表达载体pET28a(+)-TFP,在大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定重组蛋白与CRP2噬菌体的宿主菌外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)的结合作用。竞争吸附试验测定重组蛋白对CRP2噬菌体吸附率的影响。【结果】构建了pET28a(+)-TFP重组表达质粒,在大肠杆菌中得到了可溶性表达。纯化的重组蛋白可以与宿主菌的OMP结合,也可以抑制CRP2对其宿主菌的吸附。【结论】ORF70编码的TFP是噬菌体CRP2的一种受体结合蛋白,其对应的受体是宿主菌的OMP。

霍乱弧菌分型噬菌体VP3尾丝蛋白的表达及功能分析

目的研究霍乱弧菌分型噬菌体VP3的尾丝蛋白的受体结合功能,探讨VP3感染机制。方法分析VP3的尾丝蛋白gp44序列并克隆表达和纯化,以荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察尾丝蛋白与VP3敏感株和抗性株的结合能力。利用重叠PCR扩增、测定并分析对VP3有天然抗性的霍乱弧菌野生株的wav基因簇的序列。结果VP3的gp44与T7噬菌体尾丝蛋白gp17的同源性高。表达的重组蛋白His-gp44与大肠杆菌不能结合,与VP3敏感株和天然抗性株结合,敏感株的核心寡糖基因簇(wav)基因缺失后不能结合。能与His-gp44结合的敏感株和抗性株,其wav基因簇序列只有一个碱基的差异。结论VP3的gp44是尾丝蛋白,能与霍乱弧菌表面受体特异性结合。

T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库的构建

为筛选遗传背景清晰、裂解性能优良、宿主识别谱广泛的噬菌体用于抗菌产品开发,满足畜禽减抗、无抗养殖需求,通过易错PCR技术定向改变T7噬菌体尾丝蛋白羧基末端基因序列,并构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,为筛选识别不同宿主的T7噬菌体奠定基础。提取T7噬菌体基因组,用SfiⅠ进行单酶切,回收SfiⅠ位点左侧基因组。常规PCR扩增尾丝蛋白羧基末端基因序列(TF-ct,约350 bp)以及gene17至T7基因组右侧末端基因序列(约4000 bp)。以回收的TF-ct片段为模板,进行易错PCR扩增,将随机突变的TF-ct基因片段连接T载体,构建质粒文库。从质粒文库中用SfiⅠ/SphⅠ双酶切出TF-ct片段,并与SfiⅠ位点左侧基因组片段、gp17右侧基因组片段进行连接,利用包装蛋白拯救出T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库。结果易错PCR成功扩增TF-ct基因片段,并连接T载体构建质粒文库;同时随机突变的基因正确插入T7噬菌体基因组相应位置,成功拯救出尾丝蛋白定向进化T7噬菌体文库。从噬菌体文库中随机挑选15个克隆进行序列分析,目的基因的突变率在1.23%~2.16%;尾丝蛋白loop区域的氨基酸突变改变了T7噬菌体吸附宿主的能力。本研究成功构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,验证了loop区域在T7噬菌体识别宿主过程的作用,为后续筛选有益噬菌体开发抗菌产品提供支撑。

多价噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37结构分析

利用多种生物信息学软件对分离的一株多价烈性噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37进行结构预测及分析。结果表明:尾丝蛋白gp37与多株T4类噬菌体的尾丝蛋白亲缘关系较近,但与T4噬菌体尾丝蛋白亲缘关系远。氨基酸序列保守性分析显示Bp7尾丝蛋白gp37序列呈马赛克特征,N端序列高度保守,C端变异性强,存在亮氨酸拉链基元。二级结构分析显示其结构特征与T4噬菌体尾丝蛋白的二级结构具有相似性,但其C末端多出一个α螺旋区域。本研究结果将为Bp7尾丝蛋白gp37的基因改造并进一步拓宽噬菌体Bp7的宿主范围提供依据。

多价噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的表达及其对噬菌体增殖的影响

为研究大肠杆菌多价噬菌体Bp7的尾丝蛋白gp37在噬菌体宿主识别中的作用,通过PCR扩增噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的C末端基因,构建原核重组表达质粒pGEX-6p-1-gp37,并转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达。以鉴定正确的融合表达蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并检测抗血清对噬菌体增殖作用的影响。结果显示:经SDS-PAGE及Western blot鉴定证实得到含有GST标签67ku的融合表达蛋白;抗Bp7尾丝蛋白gp37的抗血清可明显抑制噬菌体Bp3、Bp7的增殖(P<0.05),对噬菌体Bp2、Bp5、Bp6的增殖具有抑制作用,但差异不显著(P<0.05),该抗血清对噬菌体Bp4的增殖反而具有促进作用。试验结果证实gp37参与噬菌体Bp7的宿主识别。

噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的原核表达与鉴定

为了研究噬菌体尾丝蛋白gp37在识别宿主菌大肠埃希菌K12过程中的作用,PCR扩增获得gp37基因C端1 161bp序列,以EGFP为荧光标签,构建重组表达质粒pET-28a-EGFP-gp37,在大肠埃希菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达重组蛋白EGFP-gp37,亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,重组蛋白EGFP-gp37在大肠埃希菌BL21(DE3)为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白与大肠埃希菌K12相互作用,激光共聚焦显微镜检测结果显示,尾丝蛋白gp37能够吸附到宿主菌K12表面,表明尾丝蛋白gp37参与宿主菌受体的识别和吸附过程。

噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38密码子用法及偏性分析

为了解噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38的密码子使用特征,利用生物信息学方法对1株临床分离的多价烈性噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38与其他5株T4类噬菌体进行密码子用法的分析比较。结果发现,Bp7尾丝蛋白gp38与其他5株T4类噬菌体密码子的使用模式差别大,Bp7尾丝蛋白gp38偏好于以C结尾的密码子,而其余5株噬菌体偏好A或U结尾;除了AUG(Met)和UGG(Trp)外,还确定了Bp7尾丝蛋白gp38使用的25种高频密码子;通过6株噬菌体gp38的密码子偏性比较发现,Bp7与任何一株噬菌体都存在较大差异;聚类分析的结果也表明,Bp7尾丝蛋白gp38与其余5株噬菌体不属于一类。总体上,噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38在密码子使用上比较特殊,gp38基因密码子的分析将为进一步研究噬菌体Bp7的感染机制及扩宽其裂解谱奠定基础。

噬菌体Bp7尾丝蛋白gp35、gp38对噬菌体增殖的影响

为了研究噬菌体尾丝蛋白gp35、gp38在噬菌体宿主识别中的作用,扩增并克隆gp35、gp38基因,分别构建重组表达质粒,得到重组融合蛋白后免疫家兔制备多克隆抗体,并检测不同的抗血清对噬菌体增殖的影响。结果显示,经SDS-PAGE及Western blot鉴定证实得到含有GST标签的67000、53000的gp35、gp38重组融合蛋白;抗噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38与gp35的抗血清均能明显抑制噬菌体Bp7的增殖,而其中gp38的抗血清更是能完全抑制Bp7增殖,证明gp35、gp38参与噬菌体Bp7的宿主识别过程。

1株禽致病性大肠杆菌T4噬菌体的分离及其尾丝蛋白的比较分析

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是养禽业最重要的细菌病原之一,由于抗生素治疗存在兽药残留及耐药性等问题,噬菌体作为一种替代的治疗方法,应受到重视。T4噬菌体是专性的裂性噬菌体,对其尾丝蛋白的研究对进一步阐明噬菌体与宿主结合以及新型抗菌制剂的开发非常重要。试验中分离到1株禽致病性大肠杆菌T4噬菌体,并且对该株噬菌体以及本实验室前期分离到的2株T4噬菌体的尾丝蛋白基因进行扩增,经测序后,与NCBI上下载的其他T4同名基因进行氨基酸的分析和比对,结果表明在比对的137个氨基酸中,第50至65位之间的氨基酸的保守性最差,同源性不超过25%,推测此区域为影响尾丝蛋白特异性的关键区域。

大肠杆菌噬菌体Bp4尾部蛋白在宿主识别中的作用研究

为了研究大肠杆菌噬菌体Bp4尾部蛋白中的假定蛋白gp10、尾丝蛋白gp11和尾刺蛋白gp13在噬菌体吸附宿主菌中的作用,本研究经PCR扩增gp10、gp11和gp13基因,克隆至原核表达质粒pcoldTF中,构建重组质粒pcoldTF-gp10、pcoldTF-gp11、pcoldTF-gp13,并分别在E.coli BL21(DE3)中经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定,结果显示各重组蛋白均获得了表达。将获得的各尾部蛋白纯化后分别4次免疫家兔,获得的各重组蛋白的多克隆抗体(anti-gp10、anti-gp11、anti-gp13)经琼脂双向扩散试验测定效价,分别为1:4、1:8、1:8。将各尾部蛋白与O;血清型大肠杆菌孵育10 min后,加入噬菌体Bp4增殖液进行竞争吸附试验,5 min后利用双层平板法检测并计数噬菌斑,计算噬菌体对大肠杆菌的相对吸附率;分别将各多克隆抗体与噬菌体孵育5 min以阻断噬菌体对大肠杆菌的吸附,再加入大肠杆菌5 min后采用上述双层平板法检测并计数大肠杆菌的噬菌斑,计算噬菌体对大肠杆菌的相对吸附率。尾部蛋白竞争吸附试验结果显示,gp13组中噬菌体对大肠杆菌的相对吸附率为0,与对照组差异极显著(P<0.01);而gp10组和gp11组中噬菌体对大肠杆菌的相对吸附率均为100%,均与对照组无差异,表明gp13能有效抑制噬菌体Bp4对宿主菌的吸附,而gp10和gp11则无此抑制作用。抗体阻断吸附试验结果显示,anti-gp11和anti-gp13组中噬菌体对大肠杆菌的相对吸附率均为0,与对照组差异均极显著(P<0.05);而antigp10组与对照组中噬菌体对宿主菌的相对吸附率均为100%,表明anti-gp13和anti-gp11均能够完全阻断噬菌体对宿主菌的吸附,而anti-gp10对其的吸附无阻断作用。上述结果首次证实大肠杆菌尾部蛋白gp13是大肠杆菌噬菌体Bp4吸附宿主菌的关键蛋白,本实验为研究噬菌体Bp4的感染机制及拓宽该噬菌体的宿主谱奠定了基础。

鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp37的克隆表达

目的为进一步了解噬菌体与宿主菌之间的相互作用机制,对鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp37进行克隆表达。方法原核表达噬菌体ZZ1重组受体结合蛋白gp37,从分子质量、抗原性以及对ZZ1吸附竞争干扰的功能等对表达的重组受体结合蛋白gp37进行鉴定。结果PCR扩增ZZ1gp37基因后,成功诱导表达了含6×His标签的ZZ1重组受体结合蛋白gp37,SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量约为140×10^(3);使用0.5 mmol/L IPTG 16℃诱导过夜较37℃诱导4 h,蛋白可溶性表达增多;Western blot显示纯化蛋白可分别被his标签抗体和小鼠抗ZZ1多克隆抗体识别;竞争吸附试验显示,在重组ZZ1gp37蛋白存在的情况下,ZZ1对鲍曼不动杆菌AB09V的吸附效率与对照组的63.5%相比下降39.5%。结论成功表达了噬菌体ZZ1的重组受体结合蛋白gp37,蛋白的分子质量、反应原性以及对ZZ1吸附的竞争干扰作用均符合预期,为噬菌体ZZ1与宿主菌相互作用机制研究奠定了基础。

鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp12的克隆表达及ZZ1 RBP受体性质鉴定

目的 为进一步了解噬菌体与宿主菌之间的相互作用机制,对鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1短尾丝蛋白gp12进行克隆表达并对ZZ1 RBP吸附受体进行鉴定。方法 原核表达噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp12,根据分子质量、抗原性以及对ZZ1吸附竞争干扰的功能等对表达的重组受体结合蛋白gp12进行鉴定。分别用细菌膜蛋白提取试剂盒和细菌脂多糖提取试剂盒提取鲍曼不动杆菌表面OMP和LPS,采用ELISA的方法对噬菌体ZZ1作用受体性质进行鉴定。分别用蛋白酶K和高碘酸盐对AB09V菌进行处理以破坏细菌表面的蛋白质和LPS,观察噬菌体ZZ1对两种方法处理AB09V菌的吸附效率。结果 PCR扩增ZZ1gp12基因后,成功诱导表达了含6×His标签的ZZ1重组受体结合蛋白gp12,SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量约为55 ku;使用0.5 mmol/L IPTG诱导4h,蛋白表达基本趋于稳定;Western blot显示纯化蛋白可分别被his标签抗体和小鼠抗ZZ1多克隆抗体识别;竞争吸附试验显示,在ZZ1重组gp12蛋白存在的情况下,ZZ1对鲍曼不动杆菌AB09V的吸附效率与对照组的63.5%相比下降42.4%;当ZZ1重组gp37蛋白和ZZ1重组gp12蛋白均存在的情况下,ZZ1对鲍曼不动杆菌AB09V的吸附率下降55.8%。ELISA和进一步验证试验显示ZZ1重组受体结合蛋白均吸附宿主菌AB09V菌表面的LPS。结论 成功表达了噬菌体ZZ1重组受体结合蛋白gp12,ZZ1重组gp37蛋白和ZZ1重组gp12蛋白均吸附宿主菌AB09V表面的LPS。