有尾噬菌体的结构及其受体研究进展

随着“超级耐药”细菌的不断出现和快速传播,噬菌体(细菌病毒)成为抗生素替代品研究的热点,是解决抗生素耐药难题、促进养殖业健康发展的新途径。噬菌体能够特异性裂解宿主菌是其发挥治疗功效的关键,然而噬菌体裂解细菌的特异性又取决于噬菌体受体结合蛋白与受体的识别与吸附。有尾噬菌体利用其受体结合蛋白(尾部纤维、尾钉和基板结构等)识别细菌表面受体(脂多糖、外膜蛋白、荚膜、鞭毛和菌毛等),最终将细菌裂解。本文综述了有尾噬菌体及其受体结合蛋白的类型和结构,以及噬菌体受体方面的研究进展,讨论了基于噬菌体与宿主菌互作研究基础上的噬菌体治疗制剂的选择策略,为后续深入研究噬菌体与其宿主菌互作机理、改造噬菌体和创制噬菌体生物杀菌制剂提供坚实的理论基础。

2株肺炎克雷伯菌肌尾噬菌体的鉴定

为了减少肺炎克雷伯菌对动物及人的危害,本试验以多重耐药肺炎克雷伯菌为宿主,采用双层平板法从健康猪、牛粪便中各分离到1株毒性噬菌体,命名为KP1、KP2。透射电镜观察发现,KP1、KP2均属肌尾噬菌体科,对乙醚、氯仿不敏感,在40~60℃或pH 4~11条件下有良好的感染性;二者的最佳感染复数分别为0.1、0.01,潜伏期分别为20 min、30 min,裂解期分别为60 min、80 min,裂解量分别约15 PFU/cell、11 PFU/cell。

新型R型噬菌体尾样细菌素对MRSA的抗菌活性研究

目的探索阴沟肠杆菌SHAMU191747所分泌的新型R型噬菌体尾样细菌素(phage tail-like bacteriocin,PTLB)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的抗菌活性。方法琼脂平板拮抗试验和肉汤微量发酵试验,检测阴沟肠杆菌SHAMU191747对MRSA的拮抗活性。超高速离心法和密度梯度离心法,制备阴沟肠杆菌SHAMU191747发酵上清液粗提物。使用透射电镜检测粗提物中有无新型R型PTLB。琼脂平板点种法,验证粗提物对MRSA的抗菌活性。采用SDS-PAGE电泳检测新型R型PTLB的分子量。结果阴沟肠杆菌SHAMU191747分泌新型R型PTLB,对MRSA具有强拮抗效应。新型R型PTLB的分子量约35 ku,能够高效杀伤MRSA;尾鞘未收缩的功能性分子的物理尺寸为(142.7±4.3)×(13.8±0.6)nm,尾鞘收缩的非功能性分子的物理尺寸为(57.7±1.2)×(20.8±1.5)nm。结论阴沟肠杆菌SHAMU191747产生的新型R型PTLB能够高效杀伤MRSA,具有开发成新型抗菌药物的潜力,临床应用前景很大。

黏质沙雷菌短尾噬菌体中国分离株的鉴定

以黏质沙雷菌jn01株为宿主菌,从环境污水中分离噬菌体,经反复挑取噬菌斑,获得1株纯化的噬菌体,定名为SmPjn。SmPjn在双层琼脂平板上可形成直径约2mm,圆形、透明的噬菌斑,边缘清晰。透射电镜观察,该噬菌体有一短尾,长(7±1.25)nm,头部长、宽分别为(58±2.16)nm×(55±0.47)nm,属短尾噬菌体科(Podoviridae)。可裂解jn01以外的2株黏质沙雷菌;与宿主菌共培养4h后的最佳感染复数为1;一步生长曲线表明该噬菌体的潜伏期约为50min,平均爆发量约为1125pfu/cell。基因组为大于27kb的DNA,可分别被HindⅢ、EcoRⅠ切成11和9个电泳片段。本报道为国内首次分离黏质沙雷菌短尾噬菌体。

短尾噬菌体识别宿主机制的研究进展

噬菌体可以作为抗生素的替代物,用于致病菌的防控和治疗。有尾噬菌体是最常见的噬菌体类型,可以根据尾部形态的不同分为短尾噬菌体、肌尾噬菌体和长尾噬菌体3类。不同噬菌体间不仅具有明显的形态差异,其对宿主细菌的识别机制也不相同。短尾噬菌体由于其较小的基因组长度和相对简单的结构组成,成为研究宿主与噬菌体的共进化关系、以及通过基因工程改造噬菌体的良好模型。本文综述了短尾噬菌体的分类特征及不同短尾噬菌体识别宿主受体的分子机制。通过明确短尾噬菌体的识别宿主机制,有助于对相应噬菌体进行工程化改造,解决噬菌体应用中存在的关键问题,使噬菌体更广泛地应用于生物、医学与食品工业等领域中。

1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性和杀菌能力评估

为探究类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性,本试验采用双层平板法分离筛选类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体;采用形态学、一步生长曲线、宿主范围测定分析该噬菌体的生物学特性;通过小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测评估该噬菌体的疗效。结果显示,成功分离出1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体,命名为HNS1。形态学观察显示,噬菌体头部为正二十面体,直径为(62.8±3.0)nm,尾部长为(54.9±5.0)nm,根据命名法则该噬菌体属于肌尾噬菌体。一步生长曲线测定结果显示,该噬菌体的潜伏期约为32 min,释放量约为8.04 PFU/infection center。宿主范围测定结果显示,该噬菌体的裂解率达到73.3%(11/15)。小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测结果显示,该噬菌体能够有效在小鼠体内和环境中裂解类鼻疽伯克霍尔德菌。结果表明,筛选得到的噬菌体具有较广的裂解谱,可能成为治疗类鼻疽伯克霍尔德菌感染的潜在抗菌剂。

沙门氏菌噬菌体LPST144尾纤维gp38的序列分析及其结合活性

对1株沙门氏菌短尾噬菌体LPST144的尾纤维进行序列结构分析和表达纯化,成功验证其尾纤维基因orf38表达产物gp38的特异性受体结合活性,从而得到一个潜在的沙门氏菌检测探针。首先采用生物信息学的方法分析LPST144噬菌体尾纤维gp38的氨基酸序列、理化性质、遗传进化关系和C末端二级结构,结果表明:LPST144的尾纤维包含646个氨基酸残基,N端具有2个保守结构域,且与T7噬菌体相似度较高;而C末端序列差异极大,存在大量的β-折叠结构,与T7噬菌体尾纤维C末端二级结构类似。gp38具有噬菌体受体结合蛋白的多个特点:具有模块化的性质、序列相似性低且C末端富含β-折叠结构。进一步将尾纤维基因orf38进行异源表达、纯化,采用全菌包被的酶联免疫吸附法检测其特异性结合宿主鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311的能力,结果表明实验组的吸光度为0.94±0.02,阴性对照组吸光度为0.17±0.01,对宿主菌具有较强的结合能力;且gp38重组蛋白与实验中受试的其他6株不同血清型的沙门氏菌均能结合;采用大肠杆菌T10、沙门氏菌外膜蛋白、金黄色葡萄球菌6538及磷酸盐缓冲液代替宿主菌作为对照,吸光度分别为0.58±0.03、0.56±0.01、0.59±0.03和0.53±0.005,实验组与对照组结果具有显著差异,表明尾纤维gp38具有特异性结合宿主鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311以及实验中其他受试沙门氏菌的能力。本研究可为开发基于噬菌体受体结合蛋白为分子探针建立沙门氏菌检测方法奠定实验基础。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法 电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果 噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论 PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3

分枝杆菌噬菌体CJAUS9 lysB基因的克隆与序列分析

参照GenBank中lysB基因序列设计特异引物,以耻垢分枝杆菌噬菌体CJAUS9的基因组为模板,PCR扩增出1029 bp的条带,经酶切、PCR鉴定含有目的基因的克隆载体pMD19-T正确后进行测序分析。结果显示,克隆出的lysB基因与已知分枝杆菌肌尾噬菌体lysB序列同源性为98.7%～99.1%;编码的氨基酸同源性为99%～100%,有酯酶保守的G-X-S-X-G基序,为研究LysB蛋白的生物学特性奠定了基础。

病毒分类的近况

国际病毒分类委员会(ICTV)于1995年发表了第六次病毒分类报告,就病毒分类提出了一些新的建议。1996年8月11—16日在以色列耶路撒冷召开了第10次国际病毒学会议,对第六次病毒分类报告中的建议进行审议通过。1997年5月ICTV执行委员会又在法国斯特拉斯堡召开会议。

云南松鼠鼠疫噬菌体的分离鉴定及其流行病学意义

目的了解云南松鼠是否携带鼠疫噬菌体,并探讨其流行病学意义。方法2015-2018年,在云南鼠疫疫源地和非疫源地的5个调查点进行鼠疫宿主动物调查。对调查中捕获的松鼠,取其脾、肝、肠道标本,低温保存备用。取肠道标本磷酸盐缓冲液(PBS)增菌液,经0.22μm滤膜滤过后加入到含有100μl鼠疫疫苗株(EV76)菌悬液的LB液体培养基中,28℃、220 r/min恒温气浴振荡培养18~24 h,采用双层平板法观察噬菌斑的生长情况,电镜下观察鼠疫噬菌体的形态结构;同时取脾、肝、肠道标本进行鼠疫菌特异标志基因caf1检测。结果共捕获到10只松鼠,其中赤腹松鼠8只,珀氏长吻松鼠2只。共分离出4株鼠疫噬菌体,其中在赤腹松鼠分离出2株,在珀氏长吻松鼠分离出2株;家鼠鼠疫疫源地弥勒县和新平县各分离出1株,野鼠鼠疫疫源地剑川县和洱源县未分离出,非鼠疫疫源地永善县分离出2株。肉眼下观察,家鼠鼠疫疫源地分离出的2株噬菌体产生的噬斑为透明状,生长状态良好;非鼠疫疫源地分离出的2株噬菌体产生的噬斑为半透明状,生长状态欠佳。电镜下观察,噬菌体为较典型的肌尾噬菌体,噬菌体头部直径约40 nm,肌尾约120 nm,肌尾末梢可见尾丝簇。10份松鼠脾、肝、肠道标本caf1检测均为阴性。结论云南松鼠中携带鼠疫噬菌体的比例较高,虽然鼠疫菌特异标志基因caf1检测均为阴性,但由于鼠疫噬菌体的存在,松鼠有可能成为鼠疫菌传播的一种载体。

一株金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解谱特异性和分子分类研究

【目的】从医院污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体,观察其形态,确证裂解谱特征并研究生物学和基因学特性,为噬菌体的临床应用奠定实验基础。【方法】将金黄色葡萄球菌ATCC25923作为宿主菌,采用双层琼脂平板法从医院污水中分离纯化噬菌体,电镜下观察形态并测定其最佳感染复数、一步生长曲线及裂解谱;全基因组测序并进行基因结构分析和功能注释。【结果】从4份医院污水中共分离到1株金黄色葡萄球菌噬菌体(命名为vB_SauH_SAP1),仅裂解10株临床分离的葡萄球菌属受试菌(共计37株),其余74株其他种属菌株不能被裂解;透射电镜观察具有正20面体头部和收缩性尾部,属于肌尾噬菌体;其最佳感染复数为0.1,潜伏期10 min,裂解期为20 min。vB_SauH_SAP1基因组全长143375 bp,G+C含量为30.2%,编码226个开放阅读框(ORF),未发现已知的毒力相关基因和抗生素抗性基因,基因组与Kayvirus属葡萄球菌噬菌体有较高的同源性。【结论】分离到1株新的Kayvirus属金黄色葡萄球菌噬菌体,根据生物学特性和基因组研究,具有一定的潜在应用价值。

一株新型旱獭源性宽谱大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及基因组分析

【目的】分离喜马拉雅旱獭肠内容物样本中的噬菌体,并研究其生物学特性和基因组特征。【方法】以大肠杆菌为宿主菌,利用双层琼脂平板法从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离噬菌体;用透射电镜观察形态特征;测定其最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱耐受度及宿主裂解谱等生物学特性,并进行全基因组测序。【结果】从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离得到一株裂解性大肠杆菌噬菌体,命名为vB_EcoM_TH18,其噬菌斑呈无晕环的透亮圆形,透射电镜观察发现该噬菌体头部直径为(90±5)nm,尾部长度为(115±5)nm;最佳感染复数为1;一步生长曲线显示其潜伏期为10 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为15 PFU/mL;在pH 4.5–9.5的范围内具有稳定活性;可裂解多种致病型和血清型大肠杆菌和宋内志贺氏菌,无法裂解沙门氏菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌及鲍曼不动杆菌;基因组测序结果表明,其基因组长度为133882 bp,GC含量为39.95%。基因组共注释到210个编码序列(CDS)和13个tRNAs,不含毒力基因及耐药基因。BLASTn比对结果表明该基因组与Avunavirus属噬菌体Av-05同源性为95.17%。基于噬菌体全基因组、主要衣壳蛋白和终止酶大亚基分别构建系统进化树,结果表明vB_EcoM_TH18是一株肌尾噬菌体科(Myoviridae)Avunavirus属的新型噬菌体。【结论】从喜马拉雅旱獭肠内容物中成功分离并鉴定了一株新型宽谱大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_TH18,可裂解多种致病型和血清型的大肠杆菌及宋内志贺菌。

一株希瓦氏菌低温噬菌体的分离及特征研究

采用双层平板法从新疆东帕米尔高原喀拉库勒湖中分离纯化低温噬菌体,并对其特征进行研究。结果分离得到1株烈性低温噬菌体,命名为KLP17,其宿主菌KLB17经16SrRNA基因序列分析鉴定为Shewanella菌株。KLP17裂解性好,可在双层平板上感染宿主菌KLB17形成直径2-4mm的圆形、透明噬菌斑。电镜下其颗粒形态呈头尾型,头部为正多面体对称,直径约88nm,收缩性尾长约160nm,属肌尾噬菌体科(Myoviridae)。噬菌体KLP17对高温敏感,耐碱不耐酸,对氯仿和异丙醇均不敏感,但对SDS和蛋白酶K十分敏感,推测其衣壳组分为蛋白质而无脂质包被。KLP17最佳感染复数为0.01,感染宿主菌KLB17的潜伏期、裂解期分别为55min和30min,裂解量为27。酶切结果显示其基因组为dsDNA,大小约67~69kb,研究结果不仅为进一步探究微生物适冷机制积累重要素材,而且为深入解析低温噬菌体与宿主菌及环境的互作关系提供数据参考。