小麦尿卟啉原Ⅲ合成酶基因克隆及序列分析

根据水稻已公布的尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)基因和小麦EST的保守序列,设计特异性引物对小麦尿卟啉原Ⅲ合成酶基因的部分片段进行克隆,得到了364 bp的cDNA(命名为UROS1)。以UROS1作为种子进行电子克隆,得到一段长为1210 bp的cDNA序列,并设计特异性引物克隆到1个1077 bp cDNA序列。对该片段分析结果表明,克隆得到的小麦UROS基因包含了信号肽区和全长的成熟肽区。小麦UROS基因与水稻UROS基因的同源性为86%左右,其推导氨基酸序列与水稻和拟南芥蛋白序列同源性分别约91%和79%。动物、植物以及微生物间核酸序列的保守性较低,氨基酸序列保守性也不高,但都存在UROS保守结构域(Hem D)。进化分析显示,该酶在不同物种间的进化速度差异较大。

尿卟啉原Ⅲ合成酶研究进展

尿卟啉原Ⅲ合成酶(UrogenⅢS)是四吡咯化合物生物代谢中的关键酶之一,它催化羟甲基胆素重排环合形成天然四吡咯化合物的共同前体-尿卟啉原Ⅲ。总结了UrogenIIIS在生化性质、晶体结构、催化机理等方面的研究成果。

蒺藜状苜蓿尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶基因MtSUMT1的克隆及分析

利用RT-PCR的方法克隆了蒺藜状苜蓿尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶基因MtSUMT1,(GenBank登录号:EF520735),经核苷酸序列测定分析,发现该基因的完整阅读框共1086bp,推测其编码361个氨基酸,由核苷酸推导出的氨基酸序列比对发现该蛋白与UPM1(Arabidopsis thaliana)、ZmSUMT1(Zea mays)的一致性分别高达70%和63%.对其编码的蛋白序列进行了结构域和功能预测.用半定量PCR方法检测不同组织,发现该基因是普遍表达的.

玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶同功酶生物信息学分析、基因克隆和原核表达

尿卟啉原Ⅲ脱羧酶是生物卟啉类化合物分支合成的关键酶。从GenBank中搜寻到4种玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶:Les22、UROD1、UROD2和截短UROD,氨基酸序列比对显示N端的同源性较差;玉米les22基因比urod1基因在开放阅读框的上游少3个碱基,导致阅读框移码。植物除玉米外存在高度同源的UROD1和UROD2,具有结构完整性。本文以玉米幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR克隆了玉米les22和urod2基因,并对突变位点进行校正,同时通过定点突变获得urod1基因,它们都编码去除叶绿体导肽的尿卟啉原Ⅲ脱羧酶。再分别将les22、urod2和urod1基因插入大肠杆菌的不同表达载体,转化表达菌株BL21(DE3),16℃诱导表达18h,SDS-PAGE分析显示,Les22的N端含有组氨酸标签或SUMO蛋白,重组蛋白表达为包涵体,UROD2的N端含有组氨酸标签或SUMO、TRX、GST或MBP蛋白,未检测到目的蛋白在上清液的特异表达,而UROD1和MBP融合为可溶性表达,表明玉米UROD的N端氨基酸残基可能参与蛋白在大肠杆菌的折叠。这为研究玉米UROD的种类和功能奠定基础。

定点突变改善红色荧光指示蛋白玉米尿卟啉原Ⅲ甲基化酶的水溶性研究

尿卟啉原Ⅲ甲基化酶是一种新型的红色荧光指示蛋白,但是,在大肠杆菌重组表达的SUMT水溶性相对较低,限制了它的应用范围,而且对于结合在蛋白的色素组分尚不清楚。利用定点突变产生玉米尿卟啉原Ⅲ甲基化酶L88R/L89G双突变体和L166A突变体,两种突变体分别在大肠杆菌中重组表达,Ni-NTA一步纯化。紫外可见光谱扫描和质谱分析确定从纯化的L88R/L89G双突变体蛋白分离的色素组分。L88R/L89G双突变体在大肠杆菌细胞内有酶活,而L166A突变体胞内酶活丧失。结合蛋白的主要组分为三甲基化咕啉。纯化的双突变体蛋白水溶性增加,为提高它作为荧光指示蛋白检测外源融合蛋白的水溶性打下基础。

甘蓝型油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因BnHemd的克隆和功能分析

为探讨油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因Bn Hemd的功能及其与叶绿素合成的关系,促进光合效率和产量的提升,利用基因编辑技术对甘蓝型油菜中双11号中该基因在A9和C8染色体上的两个拷贝进行编辑。从中双11号中克隆到基因Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd,CDS序列分别为885 bp和876 bp,均由9个外显子构成,各编码294和291个氨基酸残基。Bn Hemd蛋白性质与结构分析结果表明,甘蓝型油菜中基因Bn Hemd的两个拷贝的蛋白理化性质十分相似,均为不稳定蛋白,相对分子质量分别为31.97 k D和31.40 k D。系统进化树分析表明,Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd分别与白菜和甘蓝中的同源基因亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,Bn Hemd在中双11号的根、茎、叶、花蕾、种子和角果皮中均有表达,在角果皮和花蕾中的表达量远高于根、茎、叶。初步的功能分析结果表明,中双11号中该基因两个拷贝同时编辑的植株表现为:叶绿素含量显著减少、光合速率降低、生长迟缓,表明甘蓝型油菜BnHemd对叶绿素合成起重要作用,同时影响光合效率和生长发育。

基于尿卟啉原Ⅲ代谢增强的VB_(12)发酵培养基优化

基于VB_(12)代谢过程能量流、物质流分析,针对性地增强了尿卟啉原III代谢流向,并结合科研院所的研究成果对主要易得的关键代谢物质进行配方优化,利用Design-Expert软件进行方案设计及数据分析,得出谷氨酸和小肽蛋白为重要模型项,之后结合成本核算得出现阶段最优配方解,成功在小试实验中使发酵单位提高了16.3%,之后成功进行了中试放大实验,连续3批放大实验中的平均单位较该中试罐1~6月份同罐批平均单位提高了6.39%。

模拟失重条件下小鼠骨组织尿卟啉原Ⅲ合酶通过增加破骨细胞活性促进骨量流失

目的 探究尿卟啉原Ⅲ合酶(UROS)对失重性骨丢失的影响。方法 将8只C57BL/6J雄性小鼠(9周龄)分为对照组和尾吊组(HLU),每组4只。小鼠尾吊28 d后,取小鼠后肢分别进行Micro CT和力学实验检测。利用旋转式细胞培养系统(RCCS)建立失重的破骨细胞模型,通过实时定量PCR(qPCR)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色明确失重导致破骨细胞活性的变化,qPCR和Western印迹检测UROS表达水平变化;构建UROS敲除RAW264.7稳定株,通过qPCR和TRAP染色进一步明确UROS缺失后破骨细胞活性的变化。结果 小鼠尾吊后骨组织骨量流失明显,UROS的蛋白表达水平显著上调;破骨细胞失重处理后,UROS的蛋白表达水平上调,并且破骨分化基质金属蛋白酶9、抗酒石酸酸性磷酸酶等表达水平上调。敲低UROS后,破骨细胞分化相关标志物表达水平显著下调。结论 失重应激条件下,破骨细胞中UROS表达水平上调,进而导致破骨细胞活性增强,骨吸收大于骨形成,从而导致骨量流失。

荚膜红细菌尿卟啉原Ⅲ转甲基酶的纯化及其酶学性质

S-腺苷-_L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-_L-methionine uroprophyrinogenⅢmethyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(UroprophyrinogenⅢ,urogenⅢ)的中心碳原子C-2和C-7位上甲基化生成前咕啉-2,是维生素B12生物合成途径中的一步关键酶,但大部分SUMT受其底物urogenⅢ和副产物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosy-_L-homocysteine,SAH)的抑制作用。为了挖掘能耐受高浓度urogenⅢ的转甲基酶,文中从荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus SB1003中克隆2个SUMT基因(RCcobA1,RCcobA2),经表达与纯化后,检测发现RCcobA1和RCcobA2的酶活分别为27.3 U/mg和68.9 U/mg,后者比VB_(12)工业生产菌株脱氮假单胞菌Pseudomonas denitrificans中内源的SUMT(PDcob A,27.9 U/mg)高2.4倍,并且当urogenⅢ浓度高达70μmol/L时都几乎不受抑制作用。因此,RCcobA2的发现可以为解除VB_(12)合成途径的瓶颈以及提高VB_(12)产量提供理论支持和方向指导。

表达大肠杆菌谷氨酸-1-半醛氨基转移酶对红色荧光报告蛋白尿卟啉原Ⅲ甲基化酶的影响

谷氨酸-1-半醛氨基转移酶(Glutamate-1-semiadhyde aminotransferase,GSAT)是尿卟啉原Ⅲ生物合成上游途径的一个酶,尿卟啉原Ⅲ是红色荧光报告蛋白尿卟啉原Ⅲ甲基化酶(Uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase,UPMT)的底物。为了探明大肠杆菌共表达GSAT对UPMT荧光强度的影响,通过PCR扩增玉米upmt基因,将其插入pETDuet-1质粒中第2个顺反子中,构建的载体命名为pETU,表达UPMT的N端含有组氨酸标签;通过PCR扩增大肠杆菌编码GSAT的hemL基因,定点突变去除hemL基因中NcoⅠ序列,亚克隆至pET-51b质粒,再将获得的hemL基因插入pETU质粒的第一个顺反子中,构建pETeGU载体。表达GSAT的N端含有Strep标签。和单独表达upmt基因相比,表达2个基因后,蛋白印迹分析表明没有明显改变UPMT表达量,光谱扫描分析显示没有改变荧光物质的组成,但是增强了重组细胞的红色荧光物质三甲基咕啉的含量,该物质在354nm有特异吸收。用2mmol/L的GSAT抑制剂3-氨基-2,3二羟基苯甲酸处理后,表达两种酶的菌落荧光消失,表明重组GSAT可能增加内源尿卟啉原Ⅲ水平,从而增强重组UPMT催化产生的红色荧光。

小麦尿卟啉原合酶的分离和纯化

以40%～70%饱和度硫酸铵分级沉淀、DEAESepharoseiCL-6B、SephadexG-100、羟基磷灰石、PhenylSepharoseCL-4B和制备电泳分离纯化了小麦的尿卟啉原合酶(UROS)。酶的亚基分子质量为54ku,全酶分子质量为66ku,酶的等电点6.3,在pH8.2时比活为257μmol/(mg·min),最适反应温度40℃,5mmol/L的巯基乙醇和Mg2+促进酶活,纯化的小麦UROS在-20℃下0.1mol/L,pH8.5的Tris-HCl,内含质量分数为50%的甘油,5mmol/L的巯基乙醇和MgCl2中贮藏7d酶活损失90%。

虾夷扇贝UROS基因的全基因组鉴定、序列特征及表达分析

为探明尿卟啉原Ⅲ合酶(UROS)基因在贝类壳色形成中的分子功能,利用生物信息学和实时荧光定量PCR等方法,进行虾夷扇贝UROS基因的全基因组鉴定、序列特征及其在不同壳色个体中的表达分析。结果显示,在虾夷扇贝全基因组范围内鉴定获得1个单拷贝的UROS基因,将其命名为PyUROS基因。PyUROS基因的序列全长为68808 bp,包括9个外显子、8个内含子,共编码298个氨基酸。在PyUROS蛋白质序列中预测到1个HemD保守功能域,表明本试验中所鉴定的PyUROS基因为UROS基因。PyUROS基因在虾夷扇贝成体各组织中广泛表达,表明其在虾夷扇贝生命活动中发挥重要作用。PyUROS基因在虾夷扇贝不同外套膜区域及不同壳色个体间显著差异表达,推测其在虾夷扇贝壳色形成中发挥重要功能。本试验结果为贝类壳色形成分子机制研究提供了重要参考,为贝类壳色遗传育种工作奠定了理论基础。

低温条件下钼对冬小麦叶绿素合成前体的影响

目的探讨低温缺钼条件下冬小麦叶绿素合成受阻位点。方法采用土培试验、微区试验、营养液培养试验,设不施钼(CK,土壤有效钼0.112mg·kg-1)和施钼(+Mo,施钼水平为0.13mg·kg-1)处理,及δ-氨基酮戊酸(ALA)转化抑制剂乙酰丙酸(LA)处理,研究了缺钼对冬小麦品种叶绿素几种重要合成前体的影响。结果低温时叶绿素a与叶绿素b的比值(Chla/Chlb)上升,而不施钼时比值不变,表明低温抑制Chla向Chlb的转化,而缺钼不影响它们的转化。叶绿素合成前体原叶绿素酸(酯)(Pchl)、镁原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)、原卟啉Ⅸ(protoⅨ)、尿卟啉原Ⅲ(UroⅢ)不施钼时显著下降,其中UroⅢ急剧下降,ALA、谷氨酸(Glu)显著累积,表明从Glu或ALA向UroⅢ的转化可能受阻;加入ALA转化抑制剂LA后,ALA含量逆转为不施钼小于施钼,表明缺钼条件下ALA向UroⅢ的转化受阻。结论缺钼影响ALA向UroⅢ的转化,导致叶绿素合成受阻,含量下降。

植物体内西罗血红素的研究进展

植物以硫酸盐和硝酸盐的形式从土壤中吸收硫元素和氮元素,但硫酸盐和硝酸盐皆需要一定的还原反应才能被同化吸收利用。该还原过程的第二步是由亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NiR)和亚硫酸盐还原酶(sulphite reductase,SiR)催化的,这些酶的结构中都具有一个起关键作用的西罗血红素辅助因子。本文主要介绍生物体内西罗血红素的合成过程及其在硫元素、铁元素生化反应中的作用。

小麦UROS基因的可变剪接

可变剪接是一种重要的基因表达调控机制,对植物的发育、生理、代谢、信号转导以及外界逆境的响应等多个过程都有调控。为进一步探讨小麦基因的可变剪接机制以及深入研究小麦UROS基因的功能,以返白系、矮变1号和中国春三个普通六倍体小麦品种为材料,克隆了尿卟啉原Ⅲ合成酶基因(UROS)的gDNA和cDNA序列,并利用生物信息学技术研究了小麦叶片中UROS基因的可变剪接方式。结果表明,根据在线小麦基因组数据库,将克隆到的UROS基因组DNA序列分别定位在4BL和4DL两个基因位点,命名为UROS-4B和UROS-4D。从三个品种中克隆得到大约50个不同的UROS基因cDNA序列,通过在线预测和与基因组序列比对,发现UROS基因存在可变剪接,并鉴定出两个UROS基因位点各有一个标准剪接转录本和两个非标准剪接转录本。可变剪接方式以内含子保留为主,还有可变的供体剪接位点和可变的受体剪接位点,品种间的剪接方式不完全相同。由不同转录本预测编码的多肽氨基酸序列也存在差异,两个基因位点选取的六个转录本所编码的多肽有12个氨基酸位点的变异。

擎天凤梨苞片叶绿素代谢关键基因的分离及褪绿的分子机理

【目的】擎天凤梨是一种新潮花卉,其苞片在成花变色过程中常常伴随着绿色的逐渐消退。分离叶绿素生物合成与降解途径的关键基因,探索在苞片变色过程中叶绿素代谢的分子基础和机理,有助于解析呈色苞片中绿色退化的原因。【方法】通过c DNA文库构建及EST批量测序获得叶绿素合成关键酶:谷氨酰t RNA合成酶基因(glutamyl-t RNA synthetase,GTS)和尿卟啉原-Ⅲ合酶基因(uroporphyrinogen-Ⅲsynthase,UROS);通过同源克隆技术获得叶绿素降解关键酶:脱镁叶绿素酶(pheophytin pheophorbide hydrolase/pheophytinase,PPH)基因;通过采用透光系数法测量叶绿素含量、HPLC法测定类黄酮含量以及采用实时定量PCR法测定叶绿素代谢关键基因的基因表达模式,探索呈色苞片中绿色部分消失的分子机理。【结果】获得的GTS(Gen Bank:KP144289),序列长为1 140 bp,编译171AA的蛋白氨基酸序列,并存在Gln RS-cataytic core和Nt-trans superfamily保守区;获得的UROS(Gen Bank:KP144288)c DNA序列长为613 bp,编译188AA的蛋白氨基酸序列,并存在Hem D和Hem D Superfamily保守区;获得的PPH(Gen Bank:KP723523)c DNA序列长为266 bp,编译88AA的蛋白氨基酸序列,并存在Abhydrolase-6保守区。通过对不同变色阶段苞片的叶绿素、类黄酮含量测定以及叶绿素代谢相关基因的表达水平分析,可知苞片变色过程伴随着叶绿素含量的显著降低和类黄酮含量的明显增加,同时叶绿素合成相关的GTS和UROS表达水平也明显降低,而叶绿素降解关键酶基因PPH的表达水平在苞片变色初期显著上升,在变色完成后则降低到接近绿叶状态的最低水平。而作为对照材料的绿叶,其叶绿素含量是最高的,而类黄酮含量是最低的,同时叶绿素的合成相关酶基因表达量最高,而降解相关酶基因表达量最低,这与彩叶植物中叶绿素和类黄酮色素的表现较为一致。【结论】获得了擎天凤梨的叶绿素合成相关酶基因GTS和UROS以及降解关键酶基因PPH。由于叶绿素合成量减少,降解量显著增加引起叶绿素含量的降低,从而影响苞片变色过程中绿色的消退,并伴随类黄酮含量的增加。PPH在叶绿素的降解过程中起关键性作用。