尿嘧啶N糖基化酶(UNG)的研究进展

尿嘧啶N糖基化酶是碱基切除修复过程中的重要组分。本文从酶的概况、在生物体内的分布范围、人尿嘧啶N糖基化酶的基因结构、基因表达与调控、酶的作用机制等方面进行了介绍 ,并讨论了进一步研究的意义与方向。

中国人群耐药Ph阳性急性淋巴细胞白血病高比例ABL激酶区G∶C→A∶T突变和尿嘧啶-N-糖基化酶异常表达研究

大多数费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)患者在使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗后常表现为复发时间短及易出现ABL激酶区突变现象。为进一步研究Ph+ALL患者使用TKI治疗后易复发特点,本研究采用直接测序法检测了35例TKI耐药Ph+ALL患者ABL激酶区突变。结果发现,77.1%(27/35)患者存在ABL激酶区突变,其中T315I突变患者占ABL激酶区突变患者55.6%,特别是首次发现G:C→A:T突变Ph+ALL患者占总ABL激酶区突变Ph+ALL患者77.8%(21/27),包括T315I、E255K和E459K。其次,8例具有两种或两种以上ABL激酶区突变Ph+ALL患者染色体均为复杂核型,5例染色体由初诊单纯t(9;22)进展为复杂核型的TKI耐药Ph+ALL均出现ABL激酶区突变;并且,尿嘧啶-N-糖基化酶2(UNG2)在耐药Ph+ALL组中转录水平表达显著低于初诊组,具有统计学差异(P<0.05),而细胞核内UNG2缺失能增加G:C→A:T突变几率。结论:中国人群TKI耐药Ph+ALL具有高比例ABL激酶区G:C→A:T突变和高度基因组不稳定性。耐药Ph+ALL患者低表达UNG2可能是耐药Ph+ALL患者发生高比例ABL激酶区G:C→A:T突变的因素之一。

用尿嘧啶糖基化酶预防PCR污染的研究

利用尿嘧啶糖基化酶（ＵＤＧ）能特异性地降解ＤＮＡ双链中的尿嘧啶核苷的作用，在ＰＣＲ体系中以ｄＵＴＰ代替ｄＴＴＰ使产物中掺入ｄＵＴＰ，在ＰＣＲ扩增前用ＵＤＧ水解，即可特异性地预防ＰＣＲ产物的污染。引用该酶消化建立的防污染ＰＣＲ体系，０．１Ｕ的ＵＤＧ即可预防１０３～１０１０产物分子污染，并用于动物标本中土拉热弗朗西丝氏菌的检测。

人尿嘧啶糖基化酶cDNA的克隆及其在食管鳞癌组织中的检测

尿嘧啶糖基化酶是碱基切除修复过程的起始酶 ,对于维护基因稳定具有重要意义。在不同组织及不同细胞周期中 ,该酶的表达水平存在差异。通过反转录PCR克隆了人尿嘧啶糖基化酶的cDNA编码序列 ,进一步以克隆所得的已知UNG基因拷贝数的重组质粒作为定量标准 ,通过实时荧光定量RT_PCR测定了食管癌病人手术切除组织中尿嘧啶糖基化酶的mRNA水平 。

脱氧尿嘧啶及尿嘧啶DNA糖基化酶抗PCR产物污染能力研究

目的探讨脱氧尿嘧啶及尿嘧啶DNA糖基化酶抗PCR产物污染的能力。方法用Taq-Man荧光定量PCR检测方法进行定量检测。将一系列不同浓度的含dUTP的HBVvDNA PCR扩增产物作为污染源,分别加至含dUTP/UDC的PCR反应体系和普通荧光定量PCR反应体系中,在荧光定量PCR仪上进行定量检测,从而得出含dUTP/UDC的PCR反应体系的抗污染能力。结果最佳抗污染实验条件:UDG酶含量0.05 U,消化时间37℃5 min,灭活时间92℃1 min;dUTP100%代替dTTP。含0.05 U的UDG抗污染反应体系对每管浓度为103拷贝/ml的污染物可完全消化,并随UDC含量的增高及消化时间的延长,抗污染能力增强。结论dUTP/UDG反应体系的应用能有效防止PCR产物污染,但抗污染能力是有一定限度的,尚需加强实验室标准化管理,才能真正达到抗污染效果。

尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR防污染中的应用

1.PCR"残留污染" 在PCR操作过程中,最容易出现"污染"问题,原因主要有如下几种情况:①模板的交叉污染:在样品采集或处理中,气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染,造成假阳性,属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染;②扩增产物的污染:在扩增过程中,将碱基T置换成U,使得扩增产物为U-DNA(由A、U、G、C四种碱基组成),由于产物量特别大,容易溢漏引起污染,造成假阳性;③核酸酶、蛋白酶的污染造成假阴性;在这三种情况中最为严重是第二种,即称之为"残留污染",因为PCR扩增的放大倍数高达千万倍,而且在实际应用中扩增一直在反复进行,造成扩增产物的大量堆积,难于将其控制降解,即使是荧光PCR也很难避免扩增产物的污染,为了使得PCR结果更加可靠、准确,有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法,将操作过程中可能带入的残留污染物破坏,使其不能成为新一轮扩增的模板,从UDG的生物学性质可知,它是完成这一任务的最佳选择.

连接酶反应介导的荧光策略用于高效检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的活性

目的:灵敏检测尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性有利于生物医学研究和疾病预后.这里,构建一种连接酶反应介导的荧光策略用于高效检测UDG活性.方法:在本策略中,两条短寡核苷酸链分别与发夹探针环部序列的一半杂交,形成含缺口的DNA复合物.在UDG作用下,发夹探针环部的单个U碱基被移除,产生无嘌呤/无嘧啶(AP)位点.AP位点能抑制缺口处的连接酶反应,使位于发夹探针末端的立足点和链迁移区域仍彼此邻近,从而引发杂交链式反应(HCR),产生大量G四倍体(G4)结构.最后,G4与N甲基卟啉IX(NMM)结合,产生增强的荧光信号.结果:本策略检测限低至0.000 20U/mL,并能区分UDG与其它DNA糖基化酶.结论:本策略为生物医学研究和疾病预后提供了一种有潜力的工具用于灵敏定量检测UDG活性.

采用十二烷基硫酸钠抑制PCR产物中残留尿苷酶

目的 :研究抑制PCR产物中残留尿苷酶 (uracilDNAglycosylase ,UDG)活性的试剂。 方法 :采用DNA EIA技术检测在全dU DNA扩增物中含有稳定剂和不含稳定剂的样品 ,置室温 2 4h和 37℃ 4 8h的DNA杂交百分率。结果 :(1)在PCR产物中加入稳定剂A液和B液置室温 2 4h ,取 5 μl直接杂交 ,其杂交百分率为 6 1.4 70 %和6 8.996 % ,对照组为 99.2 83%。 (2 )在 30 μlPCR产物中加入稳定剂后 ,并加 1×PCR缓冲液稀释至 70 μl,置 37℃4 8h取 10 μl样品杂交 ,5 μl和 2 .5 μlA液组杂交百分率为 71.0 92 %和 6 7.6 91% ,对照组为 6 8.0 2 0 %和 6 3.90 6 %。5 μl和 2 .5 μlB液组杂交百分率为 91.333%和 80 .30 7% ,对照组为 6 3.90 6 %和 6 8.0 2 0 %。 结论 :B液可抑制PCR产物残留UDG活性 ,对保护全dU

dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗污染能力评价

目的 探讨dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗PCR产物污染的能力。方法 用TaqMan荧光定量PCR检测方法进行定量检测。将一系列不同浓度的含dUTP的HBV DNA PCR扩增产物作为污染源 ,分别加至含dUTP/UDG的PCR反应体系和普通荧光定量PCR反应体系中 ,在荧光定量PCR仪上进行定量检测 ,从而得出含dUTP/UDG的PCR反应体系的抗污染能力。结果 1.最佳抗污染实验条件 :UDG酶含量 0 .0 5U ,消化时间 37℃ 5min ,灭活时间 92℃ 1min ;dUTP10 0 %代替dTTP ,四种底物浓度相等。 2 .含 0 .0 5U的UDG抗污染反应体系对每管浓度为 10 3 拷贝 /ml的污染物可完全消化 ,并随UDG含量的增高及消化时间的延长 ,抗污染能力增强。结论 dUTP/UDG反应体系的应用能有效防止PCR产物污染 ,但抗污染能力是有一定限度的 ,尚需加强实验室标准化管理 ,才能真正达到抗污染效果。

抗污染扩增试剂在法医物证检验中的应用

客观、准确的法医遗传检验结果是作出准确鉴定意见的基础。随着检验设备、扩增检测试剂检验灵敏度日益增加,防控实验室污染、样品污染的压力与日俱增,其中PCR扩增产物对检测结果的污染最难防控。本文测试一款抗污染扩增试剂盒NH-18A,该试剂盒包含16个常染色体STR基因座,1个性别识别基因座(Amel)和一个Y染色体插入缺失基因座(Indel),NH-18A通过STR复合扩增可得到含有尿嘧啶碱基的DNA片段,该类型的DNA片段在50℃时可被尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)高效水解,每次新一轮PCR扩增前增加一步50℃保温孵育可以彻底消除既往扩增产物对结果的污染威胁。经实验验证,NH-18A具有优异的抗扩增产物污染能力,且替换碱基扩增不改变DNA分型结果,检测灵敏度和DNA产物片段稳定性不降低,后续电泳分析不受影响。利用此试剂盒可以有效消除扩增产物对鉴定结果的污染。

细菌双杂交验证古菌UDG与TRX相互作用的研究

目的验证别府硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii,S.tokodai)i DNA碱基切除修复中重要的酶-尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase,StoUDG)与硫氧还蛋白(thioredoxin,StoTRX)之间的相互作用,方法将StoUDG和StoTRX的基因分别克隆到细菌双杂交载体上,共转化至报告菌株,从筛选平板上检测StoUDG和StoTRX相互作用的强弱.结果 (1)pBT-TRX与pTRG-UDG等细菌双杂交质粒共转化至报告菌株,可使报告菌株在含氯霉素、四环素和卡那霉素的LB平板上生长;(2)含pBT-TRX与pTRG-UDG质粒的细菌双杂交报告菌株可在筛选平板上缓慢生长,且不发生自激活.结论 StoUDG与StoTRX存在较弱的相互作用,提示StoTRX参与依赖于StoUDG的DNA碱基切除修复过程,

尿嘧啶N糖基化酶的功能和表达调控

尿嘧啶N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase,UNG)是存在于多种生物体内的一种重要的DNA修复酶,可以在细胞内识别并切除DNA中错配的尿嘧啶,防止基因突变的出现,对保护基因组的完整性具有重要意义。UNG最主要的功能是参与碱基切除修复。此外,UNG在抗体类别转换重组、HIV-1病毒防御过程中也具有重要作用。UNG在细胞内通过与Ugene、PPM1D和Ndk等分子相互作用发挥其功能。UNG的表达受细胞周期及CpxA/CpxR系统的调控。深入了解UNG发挥功能的分子机制,将为寻找治疗肿瘤和艾滋病的新靶点提供线索。本文从UNG的功能、相互作用分子及表达调控等方面进行综述,并讨论进一步研究的意义与方向。

疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因及其编码蛋白的研究进展

概述了疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因的特点、编码蛋白的基本功能和分布定位及与其他蛋白的相互作用的研究进展并进行了展望,以期为该基因的深入研究提供参考。认为,疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因属于早期基因,其编码的蛋白通过与其他蛋白相互作用共同完成DNA的修复与合成。

DNA切除修复标志物在肺癌、食管癌组织中的表达

[目的 ]研究切除修复中切除修复鼠缺陷交叉互补基因 2 (ERCC2 )蛋白、尿嘧啶DNA糖基化酶 (UDG)、细胞增殖核抗原 (PCNA)在肺癌和食管癌组织中的表达水平差异。 [方法 ]通过免疫组织化学和原位杂交方法研究三种生物标志物在不同部位的肿瘤组织和非肿瘤组织之间的表达水平进行比较。 [结果 ]ERCC2蛋白和mRNA、UDG蛋白在肺和食管良性病变中的表达水平均明显高于其癌和癌周组织。UDGmRNA水平在食管良性病变组织中明显高于癌和癌周组织 ,在肺良性病变、癌和癌周组织中无显著差异。PCNA蛋白和mRNA在肺和食管癌和癌周组织中的表达水平均明显高于良性病变组织。三种标志物蛋白和mRNA表达水平在癌组织和癌周正常组织之间均无明显差异。 [结论 ]ERCC2、UDG表达水平在良性病变组织中明显高于肿瘤组织、PCNA表达水平在肿瘤组织中明显高于良性病变组织。

细菌16SrDNA基因T碱基特异的PCR产物片段化

目的 探讨细菌 16SrDNA检测芯片杂交前的样本处理优化方法。方法 设计针对细菌 16SrDNA基因全长的通用引物 ,通过PCR时掺入一定比例的dUTP替代dTTP ,扩增长度为 1 5kb的片段 ,用尿嘧啶 DNA糖基化酶 (UDG)消化处理掺入到双链上的dUTP后 ,再经浓氨水特异性断开DNA双链上原dUTP处的磷酸二酯键 ,然后用聚丙烯酰胺凝受胶电泳 (PAGE)和琼脂糖电泳确认片段化的效果。结果 本实验选用的基因当dUTP与dTTP的比例在 3∶7～ 1∶1时 ,都能够获得比较理想的片段化结果。结论 通过控制一定的dUTP掺入比例再经UDG及氨水处理能够得到稳定的片段化结果。

UDPE在鼠疫腐败材料检测中的应用

[目的 ]探讨UDPE在鼠疫腐败材料检测中的实际应用价值。[方法 ]用鼠疫EV菌感染小白鼠 ,未腐败前同时进行反向血凝试验 (RIHA)及UDPE检测 ,确认感染 ;经实验室模拟自然腐败不同天数后 ,再次检测。 [结果 ]经 16d以下(含 16d)腐败的脏器 (肝、脾 )RIHA和UDPE法检测均阳性 ,经 5 0d腐败取骨髓材料 ,UDPE法检测阳性率比RIHA法高。[结论 ]UDPE法适用于鼠疫腐败材料的检测。

防污染PCR检测食源性沙门菌方法的建立

本试验基于尿嘧啶糖基化酶(UNG)能特异地识别并切割DNA分子中出现的尿嘧啶核苷的原理,以构建一种防污染的食源性沙门菌(Salmonella)PCR检测方法。经过酶量、抑制剂(UGI)用量、反应时间的优化,最终确立的防污染条件为:在PCR反应前,扩增体系所用的dNTP中以3倍浓度的dUTP代替dTTP;在阳性对照的反应体系中加入1.5U UNG、2U UGI以及含有尿嘧啶的DNA(U-DNA)阳性模板;其他检测样品的反应体系中加入1.5U UNG;50℃保温10 min,再25℃保温15 min,然后进行常规的PCR扩增。结果显示,即使在高浓度U-DNA污染的反应体系里(所有PCR扩增产物均为含有尿嘧啶的U-DNA),UNG也可有效地消除污染,且对PCR的特异性和敏感性无影响。因此,本试验建立的防污染PCR检测方法高效快速,操作简便,对提高食源性沙门菌检测的准确性以及防止假阳性的出现具有实际意义。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌UDPE检测方法的建立和应用

目的 建立防止产物污染的UDPE(UDG -DuplexPCR -EIA)技术 ,用于检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌。方法 选择类鼻疽伯克霍尔德氏菌FUR(FerricUptakeRegulator)基因为靶序列 ,设计两对引物进行PCR扩增 ,用UDG(尿嘧啶糖基化酶 )防止PCR产物污染 ,并用微孔板杂交 -酶联显色检测扩增的PCR产物片段 ;用不同的模板考察方法的特异性和灵敏度。结果 该检测系统可以特异性地检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌 ;对于纯DNA模板 ,检测灵敏度可以达到 10fg/ μl;对于系列稀释菌液提取的模板 ,灵敏度可达 0 1个菌 / μl;对于模拟污水标本、模拟组织标本和模拟土壤标本的检测灵敏度分别为 10个菌 / μl,10 0个菌 / μl和 10 0个菌 / μl;检测系统可以防止 10 9个PCR产物分子的污染 ;检测系统可以在 37℃下稳定保存 7d。结论 本研究建立了稳定的 ,防止产物污染 。

孕妇生殖道B群链球菌快速检测方法的建立和初步应用

目的建立一种快速、灵敏、特异的PCR检测孕妇生殖道GBS感染的方法。方法根据GBS保守序列:cfb设计特异性扩增引物,优化PCR反应,通过电泳判断结果,同时使用UNG酶,dUTP避免PCR产物污染。结果本研究通过PCR条件的反复摸索,优化了PCR检测方法。同微生物培养方法相比,PCR方法灵敏度更高,检测更快速。直接煮沸法和试剂盒法的DNA提取效率具有差别,试剂盒法更适合临床诊断使用。结论本研究成功建立了快速、灵敏、特异的孕妇生殖道GBSPCR检测方法。