营养缺陷型酿酒酵母AY生长代谢的热动力学研究

用微量热法研究了尿嘧啶缺陷型酿酒酵母AY,和该菌株分别经穿梭质粒pYLZ-2、重组质粒pYLZ-2/f27、pYLZ-2/622转化的3种菌株的生长代谢热动力学.尿嘧啶缺陷型酿酒酵母AY在基本培养基中不生长,没有代谢热效应产生,而在葡萄糖蛋白胨培养基和丰富营养培养基(YPD)中生长,并且在YPD中生长最好;向基本培养基中加入尿嘧啶后,AY能够生长,而且随着尿嘧啶浓度的增加,其生长速率常数增大;经质粒转化的3个菌株均能在基本培养基中生长,代谢产热曲线各不相同,与转入质粒的结构、功能密切相关.研究结果表明了各菌株遗传特征的差异.

酿酒酵母呼吸缺陷型和野生型酒精发酵特性的比较分析

比较了酒精发酵生产菌株IFFI 1 30 0及其呼吸缺陷型突变株在酒精产量、发酵动力学、耐酒精能力及与酒精发酵相关的乙醇脱氢酶活性等方面的特性。结果表明 :1 )发酵终期的酒精产量 ,45株呼吸缺陷型的平均值与野生型没有显著性差异 ;但部分缺陷型的酒精产量高于野生型。2 )酒精发酵动力学结果显示 ,呼吸缺陷型酒精产生速度略高于野生型。3)单位重量干菌体的乙醇脱氢酶活性 ,呼吸缺陷型高于野生型。以上结果提示 :呼吸缺陷型用于酒精发酵以提高酒精产量和缩短发酵周期是有潜力的。4)单位体积发酵液的乙醇脱氢酶活性则野生型高于呼吸缺陷型 ,主要原因在于呼吸缺陷型的生物量明显低于野生型。 5)呼吸缺陷型菌株之间的耐酒精能力差别很小 ,耐酒精能力的高低与酒精产量的高低没有明显的正相关性。一般的 ,酒精产量高的菌株耐酒精能力较强。在实验结果的基础上 。

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。

酿酒酵母菌单倍体分离及其呼吸缺陷型的选育

采用不同培养基对MT09酿酒酵母进行不同条件下的生孢培养实验,通过菌体前培养和诱导生孢子、单倍体细胞的分离、单倍体生孢能力的确认、菌体生长曲线的绘制、单倍体菌株的诱变和营养缺陷型的筛选,得出单倍体菌株D3作为最好的诱变出发菌株。最后筛选出菌株D3-02为遗传稳定性的呼吸缺陷型突变株。(孙悟)

酿酒酵母遗传缺陷型菌株化学转化方法研究

研究酿酒酵母遗传缺陷型菌株化学转化方法的目的是通过特定的手段,来改变转化条件,从而达到提高酿酒酵母遗传缺陷型DNA的转化率。为了充分发挥酿酒酵母遗传缺陷型菌株的作用,首先需要提高其转化率,为此,我们在针对酿酒酵母遗传缺陷型菌株化学转化方法时,可以以此为切入点,将对遗传缺陷型菌株的转化带来影响的元素进行解析,通过相应的处理方法降低这些元素对遗传缺陷型菌株转化率的影响,从而提高酿酒酵母遗传缺陷型菌株的转化率。

耐盐酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建

在酱油高盐稀态发酵过程中通常添加假丝酵母(T酵母)和鲁氏酵母(S酵母)来增强酱油的风味品质。但是目前对T酵母和S酵母进行遗传操作没有相应的营养缺陷型菌株。因此,对T酵母和S酵母分别进行甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate,EMS)诱变和紫外诱变,以酵母的致死率为诱变标准做单因素试验,得到最佳的EMS质量分数、EMS作用时间,紫外照射距离、紫外照射时长,酵母菌浓度。通过筛选、测序获得尿嘧啶营养缺陷型菌株,为后续耐盐酵母的分子生物学研究提供理论依据。

酿酒酵母缺陷型原生质体的形成再生及融合条件的探讨

营养缺陷型作为酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)单倍体融合亲株的遗传标记。采用营养缺陷型LY—2和LY—4菌侏的对数生长前期的细胞,在0.5%的蜗牛酶作用时间40分钟,0.7MKCl高渗稳定剂的条件下,制备原生质体。两亲株的原生质体形成率分别为98.2%和91.0%。原生质体再生率为6.12%和2.13%。两亲株的原生质体在35%聚乙二醇(PEG,M.W.6000),50mMCaCl下诱导融合15分钟,在基本培养基上长出营养互补的融合菌株,融合频率为4.14x10。本文就两亲株的原生质体形成和再生条件进行了初步的探讨,并进行了原生质体融合的尝试.

线粒体功能缺陷酵母研究模型的探索

目的诱变筛选酿酒酵母呼吸缺陷型菌株,为进一步以酵母为模式生物开展线粒体疾病研究奠定基础。方法采用溴化乙锭(EB)进行诱变筛选酿酒酵母呼吸缺陷型菌株。结果诱变得到的酿酒酵母呼吸缺陷型菌株不能在非发酵性碳源(甘油)培养基上生长;菌落呈现出面积较小,表面干燥,边缘不整齐,呈乳白色等特点。结论成功得到酿酒酵母呼吸缺陷型菌株。

对呼吸缺陷型酵母的认识

酵母菌是一大类真菌的统称,按照Answorth(1973)年的真菌分类系统纲要,酿酒酵母归属于:真菌界--真菌门--子囊菌纲--原子囊菌亚纲--内孢霉目--酵母科--出芽酵母亚科--酵母属,酵母属下包含啤酒酵母和葡萄汁酵母.

HIV-1 gp160截短蛋白在酿酒酵母中的表达

利用PCR技术从pNL-43上扩增出截短的编码gp160蛋白的基因片断,克隆到酿酒酵母表达载体YEpFLAG-1上构建表达质粒YEp-gp160Δ12,电转化到酿酒酵母中,用缺色氨酸的SC培养基筛选出阳性克隆,重组子经YP培养基诱导后进行全菌蛋白的SDS-PAGE和Western Blotting分析,筛选出高表达菌株.纯化后的重组gp160Δ12(rgp160Δ12)蛋白经ELISA鉴定显示具有良好的生物活性.

安琪酿酒酵母与管囊酵母原生质体制备和再生

通过紫外诱变筛选得到呼吸缺陷型酿酒酵母R40,再以R40和管囊酵母P01为亲本,进行原生质体制备与再生的研究,考察了酶浓度、酶解温度和酶解时间对两亲本原生质体制备和再生的影响。结果表明,当酶解时间为1 h,酶浓度为2%时,35℃下酶解酿酒酵母R40所得原生质体的形成率和再生率分别达到96.1%和12.5%;30℃下酶解管囊酵母P01所得原生质体的形成率和再生率为97.2%和10.1%。

拟南芥K^+转运蛋白AtKup1基因的DNA改组

采用同源重组法制备钾离子转运蛋白基因TRKI和TRK2缺失的酿酒酵母钾营养缺陷型。通过RNA反转录PCR方法从拟南芥幼根扩增获得片段长度为2 139bp的AtKup1基因,以此片段为膜板,采用DNA重排技术,经DNase I降解,Primerless PCR和Primer PCR建立AtKup1基因突变库。将突变库和未经DNA重排处理的AtKup1基因分别构建酵母穿梭载体,并导入K+转运蛋白基因TRK1和TRK2缺失的酿酒酵母中,分别在低钾(5．0mmoL／L KC1)不合色氨酸的培养基上筛选转化子,从突变基因库酵母转化子中获得2株长势明显优于AtKup1基因转化子的突变基因转化菌株,菌株质粒上的突变AtKup1基因核苷酸测序结果表明突变基因AtKup1发生了2个碱基的置换,造成了2个氨基酸的改变。转化烟草烟叶化学成分分析证实突变基因的吸钾活性显著提高。

CRISPR/Cas9介导的高产谷胱甘肽原养型酵母工程菌的构建

谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是具有多种生理功能的非蛋白质类巯基化合物,已广泛应用于药品、食品等行业,且市场需求量逐年增加。遗传工程育种是提高细胞内GSH含量的重要策略,但在遗传操作过程中使用到的营养缺陷型遗传标记可能会影响菌株的正常生长,且不利于高密度发酵的进行。为回复工程菌株的营养缺陷型,利用g RNA转录表达框和靶基因同源DNA片段直接共转化酵母细胞,由细胞内表达的Ⅱ型CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-Cas9)介导的基因组编辑技术将营养缺陷型GSH工程菌株W303-1b/FGP回复为原养型菌株。结果显示,与营养缺陷型菌株相比,原养型菌株生长周期缩短,且可以利用简单的合成培养基进行培养,方便菌株的大规模培养。