早期糖尿病肾病患者尿高迁移率族B1蛋白、尿外泌体miR-129表达水平及临床意义研究

目的探讨早期糖尿病肾病(DN)患者尿外泌体miR-129、尿高迁移率族B1蛋白(HMGB1)表达水平,分析其临床意义。方法选取自2018年7月至2019年12月长江大学附属仙桃市第一人民医院收治的168例2型糖尿病患者作为研究对象,根据Mogensen分期将患者分为单纯糖尿病组(n=93)与早期DN组(n=75),另选取50例健康者纳入非糖尿病组。采集受试者尿液样本,采用实时荧光定量聚合酶链反应法和酶联免疫吸附测定法检测尿外泌体miR-129和尿HMGB1表达。采用Pearson法分析尿外泌体miR-129、尿HMGB1水平与随机血糖、尿白蛋白/肌酐比值(UALB/Cr)、估算的肾小球滤过率(eGFR)的关系。绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估尿外泌体miR-129和尿HMGB1对早期DN的诊断价值。结果单纯糖尿病组、早期DN组患者尿外泌体miR-129表达均低于非糖尿病组、尿HMGB1水平和空腹血糖水平均高于非糖尿病组,差异均有统计学意义(P<0.05)。而单纯糖尿病组患者尿外泌体miR-129表达和eGFR值均高于早期DN组,尿HMGB1水平、空腹血糖和UALB/Cr比值均低于早期DN组患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,早期DN患者尿外泌体miR-129表达与尿HMGB1水平、UALB/Cr比值均呈负相关性(P<0.05),与eGFR则呈正相关性(P<0.05)。经双荧光素酶报告基因分析,miR-129模拟物和HMGB1-3’UTR-WT1或HMGB1-3’UTR-WT2共转染后,可降低荧光素酶活性(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,尿外泌体miR-129、尿HMGB1诊断早期DN的ROC曲线下面积分别为0.83(95%可信区间0.76~0.91)和0.72(95%可信区间0.63~0.80),灵敏度为76.3%和63.4%,特异度为77.5%和72.0%。而联合诊断的ROC曲线下面积为0.96(95%可信区间0.90~0.99),灵敏度和特异度分别为90.0%和91.8%。结论早期DN患者尿外泌体miR-129表达降低,HMGB1蛋白水平升高,联合检测尿外泌体miR-129和尿HMGB1水平对DN早期诊断有一定的参考价值。

尿外泌体miR-29c对器官和非器官局限性膀胱尿路上皮癌临床结局的预测价值

目的 探讨尿外泌体微小RNA(miR)-29c对器官和非器官局限性膀胱尿路上皮癌(BUC)临床结局的预测价值。方法 2017年1月~2022年3月,从我院泌尿外科选取152例BUC病人作为验证集。另外,从我院体检中心选择了126例非癌对照。采用实时荧光定量PCR法检测尿外泌体miR-29c表达水平。结果 验证集BUC病人尿外泌体miR-29c水平低于非癌对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而尿外泌体miR-17-5p水平和miR-590-5p水平比较无明显差异(P>0.05)。尿外泌体miR-29c水平诊断BUC的ROC曲线下面积为0.969(95%CI:0.953~0.986),相应的敏感性和特异性分别为92.1%和90.2%。亚型分析中,非器官局限性BUC病人尿外泌体miR-29c水平较器官局限性BUC病人进一步降低(P=0.009)。预后分析中,尿外泌体miR-29c高表达组病人总生存期、无病生存期和疾病特异性生存期均更长(P<0.05)。结论 尿外泌体miR-29c低水平是BUC病人不利的预后因子,有希望作为器官和非器官局限性BUC不良临床结局的预测标志物。

miR-146a和miR-181a在系统性红斑狼疮患者尿液外泌体的表达及临床意义

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者尿液外泌体微小RNA(miR)-146a和miR-181a的表达及其临床意义。方法 选取2023年1月至2023年10月四川大学华西医院诊断为SLE的患者40例作为SLE组,另同期的体检健康者20例作为对照组。根据SLE病情活动指数(SLEDAI)将SLE患者分为低活动组19例(SLEDAI≤9分)和高活动组21例(SLEDAI>9分)。采用实时荧光定量PCR检测尿液外泌体miR-146a和miR-181a表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、补体C3、IgG和抗心磷脂抗体(ACA)水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析尿液外泌体miR-146a和miR-181a表达对SLE及SLE合并肾脏受累的诊断价值。结果 SLE组尿液外泌体miR-146a和miR-181a相对表达水平高于对照组(P<0.05),且高活动组尿液外泌体miR-146a和miR-181a相对表达水平高于低活动组(P<0.05)。肾脏受累的SLE患者的尿液外泌体miR-146a和miR-181a相对表达水平高于肾脏无受累的SLE患者(P<0.05)。高活动组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IgG和ACA水平高于低活动组,血清C3水平低于低活动组(P<0.05)。SLE患者的尿液外泌体miR-146a与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IgG和ACA水平呈正相关(r=0.443、0.493、0.410、0.381、0.340,P<0.05),与血清C3水平呈负相关(r=-0.340,P<0.05)。SLE患者的尿液外泌体miR-181a与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IgG和ACA水平呈正相关(r=0.342、0.470、0.373、0.371、0.334,P<0.05),与血清C3水平呈负相关(r=-0.368,P<0.05)。尿液外泌体miR-146a和miR-181a表达诊断SLE的曲线下面积分别为0.907、0.897(P<0.05),诊断SLE合并肾脏受累的曲线下面积分别为0.859和0.815(P<0.05)。结论 尿液外泌体miR-146a和miR-181a表达水平对SLE患者的疾病活动具有良好的评估作用,对SLE的病情预测和诊断具有潜在应用价值。

尿液外泌体miR-214表达在透明细胞肾细胞癌诊断和预后评估中的价值

目的探讨尿液外泌体miR-214表达在透明细胞肾细胞癌(ccRCC)诊断和预后评估中的价值。方法选取2021年2月-2022年2月临汾市中心医院接受手术治疗的ccRCC患者124例(ccRCC组)和肾脏良性疾病(肾炎、肾结石、肾囊肿等)患者124例(对照组)。收集所有患者的临床资料,并检测术前晨尿中段尿外泌体miR-214相对表达量。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价尿液外泌体miR-214诊断ccRCC的效能。采用Kaplan-Meier生存曲线评估ccRCC患者的生存情况。采用Cox回归分析评估ccRCC患者总生存率的影响因素。结果ccRCC组尿液外泌体miR-214相对表达量显著低于对照组(P<0.001)。尿液外泌体miR-214诊断ccRCC的曲线下面积(AUC)为0.86,最佳临界值为0.65,敏感性为86.7%,特异性为82.2%。不同TNM分期、Fuhrman分级和有无淋巴转移、远隔转移的ccRCC患者之间尿液外泌体miR-214相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-214低表达组总生存率显著低于miR-214高表达组(P<0.001)。尿液外泌体miR-214相对表达量≤0.65、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、Fuhrman分级Ⅲ~Ⅳ级、有淋巴转移、有远隔转移是ccRCC患者总生存率降低的独立危险因素[风险比(HR)值分别为1.96、1.55、1.80、1.52、1.24,95%可信区间(CI)分别为1.07~2.83、1.03~2.38、1.06~3.07、1.13~2.68、1.09~2.18,P<0.05]。结论ccRCC患者尿液外泌体miR-214呈低表达,且与肿瘤发生、发展和转移密切相关,可作为ccRCC的诊断标志物和预后评估指标。

胎盘源性外泌体miR-122-5p改善妊娠糖尿病脐静脉内皮细胞功能损伤的机制研究

目的探讨胎盘源性外泌体(Exo)miR-122-5p改善妊娠糖尿病(GDM)小鼠脐静脉内皮细胞(MUVECs)功能损伤的机制。方法取妊娠小鼠腹腔注射0.25%链脲佐菌素溶液以诱导GDM模型(GDM组),对照组小鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,检测两组FPG和胰岛素水平验证模型。采用HE染色观察小鼠胎盘组织形态,qRT-PCR法检测miR-122-5p表达情况,Western blot法检测核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)炎症小体相关蛋白[包括NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白、半胱氨酸蛋白酶-1]表达。采用差速离心法获得胎盘源性Exo,并采用透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分子对Exo表征进行鉴定;与MUVECs共培养后,采用免疫荧光法观察MUVECs对Exo的摄取。采用噻唑蓝法、流式细胞术、Transwell实验和血管形成实验检测MUVECs细胞活性、凋亡能力、迁移能力和成管能力。结果GDM组小鼠FPG水平明显高于对照组(P<0.001),胰岛素水平低于对照组(P<0.001),提示模型构建成功。与对照组相比,GDM组小鼠胎盘组织出现明显损伤,miR-122-5p表达水平降低,NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。MUVECs能对胎盘源性Exo进行摄取,且GDM小鼠胎盘Exo上调了MUVECs中miR-122-5p表达水平(P<0.001)。GDM小鼠胎盘Exo共培养的MUVECs较对照小鼠胎盘Exo共培养的MUVECs细胞活性增强,凋亡能力减弱,迁移能力和成管能力均增强,且NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。过表达miR-122-5p的MUVECs细胞活性增强,凋亡能力减弱,迁移能力和成管能力均增强,NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);抑制miR-122-5p表达后,MUVECs细胞活性减弱,凋亡能力增强,迁移能力和成管能力均减弱,NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论胎盘源性Exo的miR-122-5p对GDM MUVECs起到保护作用,且可能通过调控NLRP3炎症小体的活化来改善MUVECs的损伤。

食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p通过靶向抑制PTEN促进肿瘤相关巨噬细胞极化

目的:探究食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p对M2型巨噬细胞极化的影响及机制。方法:提取并鉴定食管鳞状细胞癌外泌体,qRT-PCR检测miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞及其外泌体中的表达。M0型巨噬细胞分为PBS组、HEEC exo组、Eca-109 exo组、miR-NC exo组、miR-181b-5p exo组、miR-NC组、miR-181b-5p mimic组、si-NC组、si-PTEN组、miR-181b-5p exo+PTEN组,qRT-PCR检测各组细胞中CD163、CD206、iNOS、TNF-α表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181b-5p和PTEN的靶向关系。结果:miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞TE-13、TE-12、TE-10、Eca-109、KYSE30及其外泌体中显著高表达(P<0.001)。相比于miR-NC组,miR-181b-5p mimic组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示PTEN为miR-181b-5p的靶基因。相比于si-NC组,si-PTEN组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于PBS组,Eca-109 exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-NC exo组,miR-181b-5p exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-181b-5p exo组,miR-181b-5p exo+PTEN组CD163和CD206表达显著下调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著上调(P<0.001)。结论:外泌体miR-181b-5p抑制PTEN表达而促进M2型巨噬细胞极化。

间充质干细胞来源的外泌体调控miR-143对大鼠颅内动脉瘤形成的影响机制

目的 研究间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体调控miR-143对大鼠颅内动脉瘤(IA)形成的影响及机制。方法 原代分离大鼠骨髓MSCs(BMSCs)和脑血管平滑肌细胞(VSMCs)。将VSMCs分为PBS组、外泌体-miR-NC组(ExosomemiR-NC)、Exosome-miR-143组、Exosome-miR-143+GW4869组、过表达对照组(oeNC)、过表达KLF5组(oeKLF5)和oeKLF5+Exosome-miR-143组。超速离心法分离BMSCs来源的外泌体,并用透射电镜和纳米示踪分析鉴定外泌体。PKH26染色检测外泌体转移。miR-143 mimic和miR-NC转染BMSCs或VSMCs。实时荧光定量PCR检测miR-143和KLF5 mRNA的表达,Western blot检测相关蛋白的表达。CCK-8实验、EdU实验、流式细胞术实验、划痕实验和Transwell迁移实验检测VSMCs的活力、增殖、凋亡和迁移能力。双荧光素酶报告基因系统分析miR-143与KLF5的关系。构建大鼠IA模型,研究BMSCs来源的外泌体miR-143在体内对IA形成的影响。结果 与细胞裂解液组相比,miR-143在BMSCs外泌体中表达显著增加(P<0.01),且可通过外泌体转移到VSMCs中。与Exosome-miR-NC组相比,Exosome-miR-143组VSMCs的活力增加(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数显著减少(P<0.01);与Exosome-miR-143组相比,Exosome-miR-143+GW4869组细胞活力降低(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显增加(P<0.01)。与miR-NC或Control组相比,miR-143、Exosome-miR-143和ExosomemiR-NC组WT-KLF5的荧光素酶报告基因活性及KLF5的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),而MUT-KLF5的荧光素酶报告基因活性不变(P>0.05)。与oeNC组相比,oeKLF5组细胞活力显著降低(P<0.01),EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显增加(P<0.01);与oeKLF5组相比,oeKLF5+Exosome-miR-143组细胞活力明显增加(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显减少(P<0.01)。体内实验结果与细胞实验相一致。结论 BMSCs来源的外泌体miR-143通过靶向KLF5抑制大鼠IA的形成。

miR-146a-5p miR-155-5p在寻常型银屑病不同体液外泌体中的表达

目的 探讨外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者血浆、唾液、尿液中的表达及意义。方法 采用超速离心法提取40例寻常型银屑病患者血浆、唾液和尿液中外泌体,利用投射电镜观察外泌体形态,并提取RNA,利用核酸测定仪检测RNA浓度,RT-qPCR检测miR-146a-5p、miR-155-5p的表达水平。结果 外泌体外形呈现圆形或椭圆形,直径均在60~200 nm;外泌体RNA在银屑病患者血浆、唾液、尿液中的浓度分别为3.9 ng/μl、61.6 ng/μl、0.57 ng/μl;外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者血浆、唾液、尿液中的表达分别为血浆(0.01±0.002)、(0.06±0.002),尿液(1.03±0.02)、(0.95±0.08),唾液(0.02±0.00)、(0.18±0.01)。结论 外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者不同体液中存在表达性差异,从微观角度研究银屑病,有利于为今后的诊断、治疗及发病机制的研究提供科研依据。

miR-192-5p及TAMs源性外泌体对人子宫内膜癌细胞裸小鼠成瘤性的影响

目的探究miR-192-5p及肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)源性外泌体对人子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)细胞增殖及成瘤性的影响。方法采用TAMs、阴性模拟物NC转染的TAMs以及miR-192-5p转染的TAMs源性外泌体刺激子宫内膜癌细胞,并分别注入裸小鼠体内,进行肿瘤细胞移植瘤实验。然后测量各组移植瘤的体积,分别采用RT-PCR和Western blot检测肿瘤组织内miR-192-5p、相关激酶(IRAK1)和下游核因子-κB(NF-κB)表达情况,评估上调miR-192-5p的表达水平对EC细胞增殖及IRAK1和NF-κB表达水平的影响。结果TAMs源性外泌体促进肿瘤生长,miR-192-5p过表达可明显缩小肿瘤体积;miR-192-5p过表达抑制了肿瘤组织中IRAK1和NF-κB的表达。结论上调TAMs中的miR-192-5p的表达水平可能通过IRA K1和NF-κB信号通路抑制EC细胞的增殖及成瘤性。

舒适护理在泌尿结石患者体外冲击波碎石术中的应用效果研究

分析在泌尿结石患者实施体外冲击波碎石术后给予舒适护理的应用价值。方法 围绕60例患者展开研究,依据护理方式划分成两个组边,一组为观察组(舒适护理),另一组为对照组(常规护理),分析护理方式不同对患者的影响。结果 观察组碎石成功率较高,P<0.05;与对照组相比,观察组护理满意度更佳,P<0.05;观察组患者情绪更加稳定,发生并发症情况较小,P<0.05。结论 舒适护理能够提高患者的手术舒适度和满意度,减轻疼痛感,并提高治疗效果,在临床中具有良好的应用效果。

过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞外泌体调控小胶质细胞M2型极化对脑卒中的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)过表达miR-124-1基因(Exo/124-1)调控小胶质细胞(microglia,MG)的M2型极化对脑卒中的影响。方法分离培养大鼠BMMSCs,收集其Exo(BMMSCs-Exo),采用流式细胞术、Western blot与透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分别对其进行检测鉴定。30只大鼠简单随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、Exo移植组(Exo组)、空病毒(Empty lentivirus,Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv组)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1组),每组6只。Sham组仅行假手术,其余各组均复制大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型。模型复制1 d与14 d后,各移植组动物于右侧脑室植入相应移植物,Sham组、模型组注入相同剂量生理盐水作对照。术后2 h及1、3、7、14、21、28 d,分别对各组动物行改良神经系统严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)。三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测其梗死体积。在基因与蛋白水平分别检测各组28 d脑组织MG的M1型分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、M2型分子(CD206)的表达情况。结果成功获取并鉴定了BMMSCs及其Exo。Exo/124-1显著表达miR-124-1。所有动物(假手术组除外)术后出现神经功能缺损。术后7~28 d,Exo/124-1组的mNSS明显低于MCAO/R组(P<0.05)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01);术后28 d,Exo/124-1组的脑梗死体积、TNF-α的表达明显小于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01),CD206的表达显著高于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01)。结论BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因可能调控MG的M2型极化,抑制M1型介导的炎症反应,促进脑卒中大鼠神经功能的恢复。

雪旺细胞来源的外泌体miR-21通过靶向SPRY2促进大鼠坐骨神经损伤后修复的研究

目的:研究高表达miR-21的雪旺细胞(Schwann cells,SC)来源外泌体对坐骨神经损伤(sciatic nerve injury,SNI)的修复作用及机制。方法:分别采用空载慢病毒和高表达miR-21的慢病毒感染SC株,收集SC上清外泌体并进行鉴定。采用神经断端吻合术建立SNI大鼠模型,术后随机分为模型组、SC来源外泌体组和高表达miR-21的SC来源外泌体组(n=10)。其中,SC来源外泌体组和高表达miR-21的SC来源外泌体组分别采用体外收集的外泌体局部注射进行治疗,3周后行为学实验检测神经功能恢复,免疫荧光染色评价SNI后轴突髓鞘再生,RT-q PCR检测血清外泌体miR-21及神经组织中miR-21和SPRY2的表达水平,双荧光素酶报告基因实验体外验证miR-21和SPRY2之间的靶向互作。结果:与模型组相比,其余各组大鼠坐骨神经功能和神经再生情况均出现明显改善,RT-q PCR结果显示血清外泌体及神经组织中miR-21的表达水平显著升高,神经组织中SPRY2的表达水平显著降低,其中高表达miR-21的SC细胞来源外泌体组较SC来源外泌体组变化更显著;双荧光素酶报告基因实验表明miR-21靶向调节SPRY2的表达。结论:高表达miR-21的SC来源外泌体通过靶向SPRY2显著促进SNI后修复。

Lrrk2 R1628P转基因小鼠尿液外泌体诱导帕金森病样病理变化

目的:探讨Lrrk2 R1628P转基因小鼠尿液外泌体能否诱导帕金森病(PD)样病理改变。方法:提取野生型(WT)和Lrrk2 R1628P转基因小鼠尿液外泌体,使用免疫印迹法检测尿液外泌体标记物TSG101和CD81,Y216位点磷酸化糖原合成酶激酶-3β(pGSK-3β-216)表达水平。在C57小鼠纹状体中分别注射WT小鼠(C57-WT组,n=8)和Lrrk2 R1628P小鼠尿液外泌体(C57-Lrrk2组,n=8)。注射前3天,注射后1、3、6个月,利用平衡木、挂线、转棒和旷场实验对小鼠进行行为学分析,免疫组化法分析脑组织中磷酸化α-突触核蛋白(pα-syn)的沉积情况,免疫印迹法检测脑组织中pα-syn的表达。结果:Lrrk2 R1628P小鼠尿液外泌体TSG101和CD81表达水平与WT小鼠比较,差异无统计学意义(P>0.05),pGSK-3β-216表达水平高于WT小鼠(P<0.001)。C57-Lrrk2组小鼠出现PD样行为学表型(P<0.001),皮层、纹状体和黑质中有pα-syn沉积,脑组织中pα-syn表达水平为(0.44±0.06),C57-WT组则无表达(P<0.001)。结论:小鼠纹状体中注射Lrrk2 R1628P转基因小鼠的尿液外泌体能够诱导PD样病理改变。

清肾颗粒通过调控外泌体、miR-330-3p以及CREBBP表达抑制小鼠肾纤维化

目的探讨清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型及尿酸刺激下NRK-49F细胞的作用及其调控外泌体、miR-330-3p和CREBBP的机制。方法动物实验:构建腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型,分为正常组、模型组和清肾颗粒组(8.0 g·kg^(-1)·d^(-1)),6只/组,灌胃12周。采用尾静脉注射腺相关病毒载体,实验结束后收集双侧肾组织。观察小鼠肾组织外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测小鼠肾组织Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;HE和Masson染色观察小鼠肾组织病理学变化。细胞实验:构建尿酸刺激下的NRK-49F细胞模型(尿酸400μmol/L),SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验,分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。观察NRK-49F细胞中外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测NRK-49F细胞中Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;双荧光素酶报告基因检测miR-330-3p与CREBBP靶向关系;RT-qPCR和Western blotting检测NRK-49F细胞中miR-330-3p与CREBBP表达变化。结果动物实验中,Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平降低(P<0.05)。Western blotting及免疫荧光结果显示,与正常组相比,模型组Col-III、α-SMA、FN表达增加,E-cad表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN表达减少,E-cad表达增加(P<0.05)。肾脏病理检查显示,清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,尾静脉注射腺相关病毒病毒载体抑制miR-330-3p表达,增加CREBBP水平,减轻肾纤维化(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,CREBBP是miR-330-3p的靶点(P<0.05)。RT-qPCR和Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组miR-330-3p表达增加,CREBBP表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组miR-330-3p表达减少,CREBBP表达增加(P<0.05)。细胞实验结果与动物实验结果趋势一致。结论清肾颗粒通过干预外泌体,降低miR-330-3p水平,增加CREBBP表达抑制肾纤维化。

尿源外泌体在肾脏疾病中的研究进展

目前,关于肾损伤与外泌体的临床研究大多集中在尿源外泌体上,特别是在肾脏疾病患者中,尿源外泌体提供的信息可能直接反映肾脏的生理状态,有望作为肾脏疾病的一种新型分子标志物,应用于肾脏疾病的诊断。此外,尿源外泌体也可用于部分肾脏疾病的治疗,并且在肾脏疾病的发病机制中发挥重要作用。因此,研究从尿液中分离出的外泌体对于早期诊断、治疗和监测肾脏疾病的作用及其致病机制具有重要意义。未来可对其进行深入探索,以为尿源外泌体在肾脏疾病中的应用提供理论依据。

过表达miR-486-5p的骨髓间充质干细胞通过外泌体来保护缺氧损伤心肌细胞

目的探讨过表达miR-486-5p小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)来源外泌体(Exo)对缺氧损伤心肌细胞的影响及机制。方法通过慢病毒转染来构建过表达miR-486-5p的小鼠BMSC。提取转染成功的BMSC所分泌的Exo,包括空载体BMSC分泌的Exo(Exo-NC)、miR-486-5p过表达BMSC分泌的Exo(Exo-miR-486)及未处理BMSC分泌的Exo(Exo-Control)。取12~18 d胎鼠原代心肌细胞,将其分为常氧培养组(Normoxia组)、缺氧培养组(Hypoxia组)、Hypoxia+Exo-NC组及Hypoxia+Exo-miR-486组,并给予不同时间的缺氧处理来模拟心肌细胞缺氧状态,检测细胞增殖状态、凋亡率,以及活性氧(ROS)、核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)和裂解的胱天蛋白酶-1(cleaved caspase-1)的表达水平。结果Hypoxia组心肌细胞增殖能力低于Normoxia组,而凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表达水平均高于Normoxia组(P<0.05);Hypoxia+Exo-NC组心肌细胞增殖能力高于Hypoxia组,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表达水平低于Hypoxia组(P<0.05);Hypoxia+Exo-miR-486组心肌细胞增殖能力高于Hypoxia+Exo-NC组,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1表达水平低于Hypoxia+Exo-NC组(P<0.05)。结论来自miR-486-5p过表达BMSC的Exo能减少缺氧导致的ROS的产生及其引起的心肌细胞凋亡,并改善缺氧引起的心肌细胞增殖缓慢的问题。

地塞米松干预的间充质干细胞来源外泌体中miR-708对成骨分化、增殖和迁移的影响

目的探讨用地塞米松干预的间充质干细胞(MSC)来源外泌体中miR-708对MSC成骨分化、增殖和迁移的影响。方法通过超速离心获得未被和被地塞米松干预的MSC外泌体Exo-1和Exo-2,透射电镜观察外泌体形态,Wsetern印迹检测外泌体标志蛋白CD63,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测两种外泌体中miR-708表达。将MSC分为对照组、Exo-1组和Exo-2组,并进行成骨诱导分化培养,外泌体处理组分别加入20μg/ml Exo-1或Exo-2,对照组加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)。茜素红染色观察细胞成骨分化能力。CCK-8检测细胞增殖活力。划痕实验评估细胞迁移能力。结果MSC外泌体有典型的茶托样结构且检测到CD63表达;用地塞米松干预的MSC外泌体中miR-708高表达。与对照组和Exo-1组相比,Exo-2组MSC成骨分化能力、增殖活力和迁移能力显著降低(P<0.05)。结论用地塞米松干预的MSC来源外泌体中miR-708可抑制MSC成骨分化、增殖和迁移。

尿外泌体非编码RNA在糖尿病肾病发病机制及诊断中的最新研究进展

糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)如今占所有导致终末期肾病(end-stage renal disease ESRD)原发病的近50%^([1])。目前糖尿病肾病的诊断及分期主要依靠尿微量白蛋白的检测,其缺点是敏感性和特异性相对较低,而肾穿刺活检术则操作风险较高,尚缺少采集程序无创性的理想检测标志物。外泌体是直径范围40~160nm被脂质双层膜包裹的囊泡,广泛分布于血液、尿液等体液中。

miR-155调控巨噬细胞极化并经外泌体介导足细胞损伤的作用机制研究

目的探讨miR-155调控巨噬细胞极化并经外泌体介导足细胞损伤的作用机制。方法选择巨噬细胞RAW264.7和肾小球足细胞MPC5进行实验。将miR-155mimics、miR-155mimicsNC、miR-155inhibitor和miR-155inhibitorNC慢病毒转染至RAW264.7细胞,构建miR-155过表达/低表达巨噬细胞系及其对照,分离巨噬细胞外泌体。采用流式细胞术检测各组巨噬细胞M1/M2表型比值。采用Transwell法将RAW264.7细胞与MPC5细胞进行共培养,分别于共培养12h、24h后采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测巨噬细胞miR-155表达水平;采用Westernblot法检测巨噬细胞IL-6、IL-10表达水平,以及肾小球足细胞synaptoporin和nephrin表达水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾小球足细胞IL-1β、IL-10表达水平;采用TUNEL染色法检测肾小球足细胞凋亡情况。结果成功构建miR-155过表达/低表达巨噬细胞系并分离其外泌体。miR-155过表达可诱导巨噬细胞极化为M1型,抑制miR-155可诱导巨噬细胞极化为M2型。在miR-155mimics慢病毒转染至巨噬细胞24h后,其miR-155表达水平显著增加(P<0.05),并上调IL-6的表达水平(P<0.05),抑制IL-10的表达水平(P<0.05),经Transwell共培养使足细胞synaptoporin、nephrin表达水平下降(P<0.05),IL-1β表达水平升高(P<0.05),并促进足细胞发生凋亡。而转染miR-155inhibitor慢病毒至巨噬细胞后所得结果趋势与miR-155mimics相反。RT-qPCR检测结果显示,miR-155mimics组巨噬细胞外泌体中miR-155水平显著升高(P<0.05),miR-155inhibitor组巨噬细胞外泌体中miR-155水平显著降低(P<0.05)。结论miR-155过表达可诱导巨噬细胞极化为M1型,并通过外泌体介导引发足细胞损伤,而下调miR-155表达则逆转这一作用。

龙钻通痹方对类风湿关节炎外泌体miR-155的作用机制研究

目的本研究从分子生物学水平探讨龙钻通痹方对类风湿关节炎(RA)外泌体miR-155的影响,以揭示龙钻通痹方如何干预其表达,从而为治疗RA夯实理论基础。方法本研究以胶原诱导型(CIA)的造模方式建立RA模型大鼠为研究对象,采用随机数字表法的方式将其分为正常组、模型组、龙钻通痹方组,经壮药龙钻通痹颗粒灌胃给药后,测定大鼠踝关节的肿胀指数;运用Elisa法检测血清肿瘤免疫因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子水平;并运用实时荧光定量PCR法检测血清外泌体中miR-155水平。结果不同组大鼠的踝关节肿胀程度不尽相同,正常组大鼠关节未见肿胀;而相较于治疗组,模型组大鼠未经治疗,关节肿胀程度更高(P<0.05)。治疗组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均低于模型组(P<0.05)。治疗组大鼠血清外泌体miR-155水平高于正常组,但低于模型组(P<0.05)。结论壮药龙钻通痹方可调控miR-155的表达,抑制炎症因子的表达,进而发挥抗炎作用。