儿童腹型过敏性紫癜不同中医证候临床及尿液蛋白质组学差异比较

目的探讨儿童腹型过敏性紫癜(AHSP)不同中医证候的临床及尿液蛋白特征。方法按照诊断及纳入、排除标准,收集AHSP不同中医证候患儿的临床信息及尿样进行分析,并通过尿液蛋白质组质谱分析,筛选及比较AHSP不同证候的尿液差异蛋白。结果AHSP不同证候临床特征显示,皮肤紫癜首发者风热伤络证最多,湿毒内蕴证次之;皮肤紫癜伴腹痛症状首发者仅在脾虚不摄证中出现。不同证候间实验室指标未发现统计学差异。通过DDA及DIA定量方法,在不同证候间筛选出21个证候差异蛋白,其中风热伤络、湿毒内蕴证间2个,风热伤络、脾虚不摄证间3个,湿毒内蕴、脾虚不摄证间16个;经OPLS-DA分析筛选出10个差异蛋白,包括ALDOB、Glyc、GSTA2、GPDA、GAPDH、CRYL1、AK1A1、VMO1、Cat S、DHPR。结论AHSP不同证候间临床及尿液蛋白存在差异,这些差异可为腹型过敏性紫癜的证候诊断提供一定的帮助。

尿液蛋白质组学

随着新技术的出现与多种技术之间的交叉融合,尿液蛋白质组学研究发展迅速。论文概述了正常的尿液蛋白质组学研究发展历程,生理情况下的尿液蛋白质组学研究进展及在尿液中已检测到疾病相关蛋白标记物的研究,列举了一些收集和整合尿液蛋白质组数据的共享平台。目前,正常尿液中的大多数蛋白种类已近被发现,建立基本的尿液蛋白质数据库非常必要的;病理状态生物标记物的检测已进入临床应用阶段,然而一种生物标记分子往往不能特异性的标记一种疾病或一个生理变化,可能需要多个相关学科的整合协调。尿液蛋白质组学研究还面临着许多困难,仍有许多工作需要去做。

尿液蛋白质组在膀胱癌临床诊治中的应用

膀胱癌是一种常见的泌尿系统疾病,尿细胞学检查与膀胱镜检查是膀胱癌的主要临床诊断手段,但尿细胞学检查敏感性较差,膀胱镜检查为侵入性检查,易给病人带来强烈的不适感;且膀胱癌具有易复发的特点,大部分患者必须面临频繁的检查,临床亟需发展舒适、准确的检查手段.尿液存储是膀胱的主要生理作用,尿液可以直接接触肿瘤实体,肿瘤分泌的一些蛋白质分子极可能进入尿液中,并且患者尿液样本便于足量多次收集.同时,蛋白质组技术以及尿液蛋白质组研究的快速发展,为我们利用尿液研究膀胱癌提供了便利的途径.本文系统总结了尿液蛋白质组研究的主要技术手段,重点关注膀胱癌尿液蛋白质组研究趋势和应用方向,以期为利用尿液蛋白质组研究膀胱癌提供助力.

尿液蛋白质组学中样品前期处理方法的研究进展

尿液是血液经肾小球滤过，肾小管和集合管重吸收、排泻及分泌产生的终末代谢产物，其组成与性状可反映整个泌尿系统的状况。尤其是尿液中蛋白质种类和数量的变化携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的各种信息，而尿液蛋白质组学是诠释尿液蛋白所携带信息的最有效方法之一，而且此研究可以发现体内很多疾病的生物标志，例如膀胱癌和肾炎等。然而尿液中的盐浓度高，代谢废物多，还有很多低浓度的复合物，复杂的组成成分大大增加了尿液蛋白质组学的研究难度。因此，尿液样品的前期处理在尿液蛋白质组学分析和疾病分析过程中是一个相当重要的环节。本文着重阐述近年来国内外尿液蛋白质组学样品的前期处理方法以及各方法的比较。

尿液蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立及优化

目的 建立稳定的尿液蛋白质组学双向凝胶电泳技术体系。方法 对尿液蛋白质组双向电泳样品的收集保存、样品制备、上样量、水化方式、水化上样液成分、IPG胶条选择及电泳程序参数等进行了比较研究和条件优化。结果 双向电泳图谱清晰，检测到蛋白斑点数目为（849＋18）个，匹配率达到81．26％。结论 建立了较稳定的尿液蛋白质双向凝胶电泳方法，可用于开展疾病的尿液蛋白质组学研究。

尿液蛋白质组学在肾小球疾病研究中的应用

近几年来，蛋白质组学研究越来越多地应用于各个医学领域，各种功能蛋白质不仅是发挥机体正常生理作用的重要活性物质，也是与机体病理状态最具直接关系的物质。有研究显示，只有约2％的疾病仅与基因序列有关，而98％的疾病与蛋白质的表达有关。蛋白质组学的研究在肾脏病领域也已经广泛开展，肾脏病蛋白质组学研究主要包括肾组织不同结构，如肾小球、血管、肾小管、肾间质和足细胞蛋白质组学、尿液蛋白质组学以及肾脏替代治疗时透析液或超滤液的蛋白质组学等。

尿液蛋白质组学在膀胱尿路上皮癌早期诊断中的应用

目的寻找膀胱尿路上皮癌（BUC）患者与健康志愿者尿液蛋白质组学差异，为BUC的早期诊断奠定基础。方法采用25％乙醇沉淀法制备尿液双向电泳样品，尿液蛋白经双向凝胶电泳（2-DE）分离后行考马斯亮蓝染色，利用PDQuest8．02D凝胶图像分析软件进行分析，所得差异蛋白点用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（MALDI-TOF-TOF-MS）进行肽序测定，结合Swiss-Prot蛋白质数据库对差异蛋白进行初步鉴定，并应用Western blot方法对差异蛋白在两组间的差异表达情况进行验证。结果获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱。BUC组与对照组凝胶的蛋白质点数分别为（789±18）个和（762±14）个；与对照组比较，BUC组有6个蛋白质点表达明显下调，11个蛋白质点表达明显上调。经质谱分析后，初步鉴定了5种蛋白质，分别为纤维蛋白原、乳酸脱氢酶B、载脂蛋白A1、丛生蛋白和触珠蛋白，均在BUC组呈表达增高趋势。Western blot验证了双向凝胶电泳结果。结论BUC患者与健康志愿者的尿液蛋白质组存在明显的差异，差异蛋白的鉴定为进一步寻找BUC早期诊断的分子标志物提供了研究基础和依据。

尿液蛋白质组学与糖尿病肾病

蛋白质组学是系统研究细胞或组织全套蛋白质生物学信息的科学，其中尿液蛋白质组学以其独特的优点广泛应用于基础和临床研究领域。糖尿病肾病是糖尿病最常见且危害巨大的并发症之一，许多学者运用尿液蛋白质组学分析方法对糖尿病肾病进行研究，发现了一些与糖尿病肾病相关的生物学标志及可能的发生机制，展示了尿液蛋白质组学技术在糖尿病肾病早期诊断、动态监测病情及发现新的治疗靶点方面的前景。

尿液蛋白质组学在不同病因急性肾损伤早期诊断中的应用

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）发病率高，病死率高，早期诊断困难。传统的血肌酐诊断指标存在明显不足，而新型生物标志物如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase—associated lipocalin，NGAL）、尿肾损伤分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、白细胞介素18（IL-18）等也有一定局限，至今尚无一项实用可行的AKI早期诊断模式。近年来尿液蛋白质组学在AKI领域的应用，为建立无创、准确、特异性高的AKI早期诊断模式提供了技术支持。

细菌性脑膜炎大鼠模型的尿液蛋白质组学变化

与脑脊液和血液不同,尿液不受到稳态机制的调节,更倾向于积累和反应机体生理和病理状态下的变化。生物标志物的本质特征是变化,因此尿液是寻找疾病早期标志物的更好来源。在世界范围内,细菌性脑膜炎依然是引起新生儿和儿童疾病的主要原因。为了降低死亡率和致残率,需要用无创的方法寻找细菌性脑膜炎的相关线索。本研究中,使用大鼠脑室内注射大肠杆菌模型模拟细菌性脑膜炎,在第1天和第3天的大鼠尿液中寻找尿液蛋白谱的差异变化,为进一步寻找大肠杆菌性脑膜炎的早期生物标记物研究进行初步的探索。通过膜上酶切和胶内酶切将尿蛋白切成肽段并通过液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)分析肽段信息。第1天的尿液通过胶内酶切方法鉴定到17个差异蛋白,通过膜上酶切鉴定到20个差异蛋白;第3天的尿液通过膜上酶切方法鉴定到5个差异蛋白。这些差异蛋白为寻找细菌性脑膜炎早期生物标志物的初步探索奠定了基础。

大鼠、豚鼠和金黄地鼠的尿液蛋白质组比较

生物标志物是指与生理或病理变化相关的可监测的变化。尿液作为机体的一种排泄物,不受稳态机制的调节,可以反映机体的多种变化。动物模型可以模拟人类疾病过程,监测疾病的变化,并为早期诊断提供线索。大鼠作为常用的模型动物并非所有疾病的优势模型动物,因此比较大鼠与其他动物的尿液蛋白质组,从而为其他疾病选择优势模型动物提供线索。文中通过膜上酶切切成肽段再通过液相色谱与串联质谱偶联技术(LC-MS/MS)分析肽段信息,比较大鼠、豚鼠和金黄地鼠的尿液蛋白,结果显示3种鼠的尿蛋白数量不同,在机体不同系统中表达情况不同,参与的生物功能也不同。这为不同疾病选择不同的优势模型动物提供了依据。

同位素标记定量技术评估肾病综合征尿液蛋白质谱变化的初步探讨

目的旨在通过同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术分析原发性肾病综合征(PNS)患者尿液差异表达蛋白,寻找高特异性、无创性评估PNS的病理损害标记蛋白,并结合相应蛋白功能探讨其在PNS发病机制及疾病进展中的作用。方法 9例PNS患者肾穿刺当日和3例健康人的晨尿标本经毛细管高效液相色谱仪分离后,Q-Exactive质谱仪进行质谱分析,Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3软件进行查库鉴定、定量和数据分析。结果成功得到PNS尿液蛋白SDS-PAGE电泳图谱,并得到724个蛋白质组,其中≥2的唯一肽段308个,定量、查库鉴定和数据分析最终得到差异蛋白表达明显的19个。其中与3例健康对照患者差异表达的蛋白3个,包括抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰凝乳蛋白酶(AACT)和微管蛋白酪氨酸连接酶类似物7。结论 i TRAQ技术评估PNS尿液蛋白质组变化具有现实可行性,可以用于更深入的研究。

从健康人尿液筛选年龄相关蛋白质

目的筛选健康成人尿液中与年龄相关的差异表达蛋白质,探讨成人因年龄增长而发生的蛋白质改变。方法选取14名健康男性及15名健康女性,按年龄各分为3组(20~30、40~50和≥60周岁),用非标记定量蛋白质组学技术进行尿液蛋白质组分析,筛选年龄相关尿液蛋白。结果从男性尿液中共获得100个与年龄增长相关的尿蛋白,其中上调66个,下调34个。从女性尿液中共获得94个与年龄增长相关尿蛋白,其中上调79个,下调15个。获得男女共有的年龄增长相关尿蛋白12个。蛋白功能分析显示,这些蛋白与凝血系统、蛋白泛素化、LXR/RXR激活、糖酵解等通路相关。结论尿液中存在与年龄增长相关的蛋白质,有可能成为衰老相关的尿液标志物,并为后续疾病生物标志物发现提供基础。

Label-free与iTRAQ蛋白质组学方法在IgA肾病中的应用

目的:探讨蛋白质非标记(label-free)定量技术与同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术两种尿液蛋白组学技术在IgA肾病(IgA-N)中的应用价值。方法:选取正常人(健康对照组)和IgA-N患者(IgA-N组)各12例,均留取新鲜晨尿,组内混合,预实验判断样品质量,初步确定蛋白质鉴定数量,FASP酶解后分两部分进行:一部分iTRAQ标记分级后与另一部分进行label-free的LC-MS/MS质谱、数据分析。比较两种实验方法蛋白覆盖情况、实验重复性及差异蛋白数量。结果:经过质谱鉴定,label-free经质谱鉴定到的肽段长度7~26,高峰10~18,各肽段长度范围内的数目最多达800种。iTRAQ实验经质谱鉴定到的肽段长度6~26,高峰分布6~16,各肽段长度范围内的数目最多达1400种。iTRAQ计算组内变异系数(CV)为5.7%~11.2%,组间CV为7.9%~22.0%(CV<0.3)。Label-free实验计算组内CV为3.7%~13.2%,组间CV为5.9%~19.0%(CV<0.3)。Label-free鉴定到624种蛋白,iTRAQ鉴定到621种蛋白。通过火山图分析两种实验方法均可以很好筛选出差异蛋白,且聚类效果好;经GO分析两种实验方案均显示出相似度较高的生物分类功能。结论:iTRAQ标记可检测到更多的蛋白,且在低分子量检测中占优势,而label-free实验得到的CV相对较小,需要依据实验目的优化实验方案。

离心条件对丙酮沉淀法提取尿蛋白质的影响

目的探究丙酮沉淀后离心转速和离心温度对尿蛋白质组的影响及健康人尿液蛋白质组的个体差异。方法用不同离心转速(4000×g和12000×g)和离心温度(4℃和20℃)对丙酮沉淀后的人尿液样品进行处理,提取尿蛋白进行质谱分析,比较不同方法的鉴定效果,确定丙酮沉淀后尿蛋白离心的最佳条件。将上述方法用于36例(男女比例为1∶1)健康人尿液蛋白质组分析,研究健康人的个体差异。结果在低温高转速条件下(4℃,12000×g),鉴定效果最好,健康人尿蛋白质组个体差异为0.635。结论丙酮沉淀后,低温高转速(4℃,12000×g)提取尿蛋白的效果较好,尿蛋白的个体差异与血浆蛋白质组相近,具有一定的稳定性,可以用于大规模临床分析。

痛风患者尿液蛋白组学高尿酸高血脂生物信息学分析

目的临床诊疗中伴有三酰甘油增高的痛风患者病程更长且疼痛症状更加严重。探究高血脂特别是高三酰甘油在痛风发生过程发挥作用可能的机制。方法采用同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)LC-MS/MS蛋白组学技术,分析高尿酸高血脂痛风组,高尿酸痛风组,正常组尿液中蛋白质表达情况。采用生物信息学方法分析差异表达蛋白质信息。结果本研究共鉴定出65个差异蛋白[差异倍数(FC)的绝对值>2且P<0.05]。GO富集分析表明差异表达蛋白明显富集的生物过程(BP)中有体液免疫反应、丝氨酸型内肽酶活性的正向调节、三酰甘油的稳态、脂肪合成代谢的正向调节等;分子功能(MF)有磷脂的结合、脂质结合、醛脱氢酶[NAD(P)+]活性等。KEGG通路富集分析显示差异表达蛋白富集的代谢通路主要有脂肪消化与吸收、PPAR信号通路、甘油脂代谢、胰腺分泌等。结论高尿酸高血脂痛风患者与高尿酸痛风患者相比较表达的差异蛋白与脂肪代谢和体液免疫有关,为高尿酸高血脂痛风的病理机制和治疗干预提供新的依据。

丙酮沉淀法富集尿液蛋白的影响因素分析

尿液蛋白质组学是体液蛋白质组学的重要组成部分。有机溶剂沉淀法是常用的尿蛋白富集方法，综合富集效率、富集蛋白种类及重复性等因素，丙酮沉淀法效果最佳。但丙酮沉淀法尚缺少共识性的标准流程，本文从防腐剂、尿液解冻方法、丙酮沉淀时间和尿液与丙酮体积比4个方面，探讨丙酮沉淀法富集尿蛋白的影响因素，以优化尿蛋白质组学研究中样本收集及蛋白富集的标准流程。

尿液蛋白生物标志物验证时要考虑的因素

生物标志物是和疾病相关的可监测的变化.尿液因其不受人体稳态调节而比血液更富于变化,是早期、敏感的生物标志物来源.尿液由于受到的各种因素的影响,变化极其复杂,一个排除这些影响的方法就是在动物模型上控制其他影响因素,单独观察每个应用因素的作用,找到与疾病直接相关的尿液变化,并且在选择需要验证的疾病候选标志物时应该考虑是不是已经被发现受到一些常见因素的影响,最后再在临床样本上验证找到的尿液标志物线索与人类疾病的关系.本文拟通过列表形式展示疾病候选标志物受影响因素(生理因素、药理因素)影响的情况,提示验证疾病候选标志物时应该慎重考虑这些蛋白,减少验证的成本和精力,以期更有效地建立起人类疾病与其尿液标志物的相对特异的关系.

尿液蛋白富集方法的比较

人尿液中蛋白含量低,在进行质谱分析时易被高丰度蛋白掩盖。因此,发展高效和高选择性的富集方法,是实现尿蛋白标记物深度覆盖的必要前提。探究不同实验方法对尿液蛋白富集和尿蛋白质组的影响尤为重要。本研究采用超滤法、硝酸纤维素膜富集法和饱和硫酸铵沉淀法,等体积各处理5例健康志愿者和膀胱癌患者10 mL尿液样本,富集尿液蛋白,SDS-PAGE分离尿蛋白,比较不同方法纯化的效率;通过质谱分析,比较不同纯化方法的肽段鉴定效果,确定针对尿液蛋白质组蛋白的最佳富集方法。相对于超滤和硝酸纤维素膜富集法,饱和硫酸铵沉淀法成功地应用于健康人尿蛋白的富集和质谱检测,在保证回收蛋白质量的前提下,可减少高丰度白蛋白的干扰,富集更多低丰度蛋白,提高了质谱鉴定的灵敏度。综上所述,饱和硫酸铵提取尿蛋白的效果较好,该方法具有大规模处理尿液、提高蛋白质组学筛选临床诊断标记物研究的应用潜力。