日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响

[目的]本试验旨在探究日粮添加尿素对育肥湖羊空肠发酵、菌群结构以及氨和尿素转运蛋白表达的影响。[方法]将42只3月龄育肥公湖羊(约24.3 kg)随机均分为3个处理组,在饲喂基础日粮的基础上分别添加0 g·kg-1(U0组)、10 g·kg-1(U10组)、30 g·kg^(-1)(U30组)尿素。试验预饲期1周,正试期10周。试验结束每组随机选取6只屠宰,采集空肠内容物,测定发酵参数和定量总菌,并利用Illumina MiSeq测序分析空肠细菌组成;采集空肠上皮组织样品检测氨转运蛋白b(Rhbg)、氨转运蛋白c(Rhcg)和尿素转运蛋白B(UT-B)基因mRNA表达。[结果]与U0组相比,U10和U30组空肠氨态氮含量显著升高(P<0.05)。与U0组相比,U10组总挥发性脂肪酸和乙酸含量显著降低,U30组丁酸和异戊酸含量相较于U10组显著升高(P<0.05)。相较于U0组,U10和U30组的总菌数量显著升高(P<0.05)。Illumina-MiSeq测序结果显示,添加尿素并未影响空肠Chao 1、ACE、Shannon和Simpson指数(P>0.05),PCoA分析结果显示各组间空肠细菌群落组成明显区分。添加尿素对湖羊空肠中细菌门水平相对丰度无显著影响,但细菌属水平相对丰度存在差异。各处理组主要优势菌属为Lachnospiraceae NK3A20 group、Ruminococcus 2、Acetitomaculum和Bifidobacteriaceae unclassified,其中Lachnospiraceae NK3A20 group和Ruminococcus 2的相对丰度均在U10组中最高。此外,U10组Ruminococcus gauvreauii group和Olsenella的相对丰度相较于U30组显著升高(P<0.05)。与U0和U30组相比,U10组空肠上皮Rhbg基因mRNA表达水平显著上调(P<0.05);Rhcg基因和UT-B基因表达水平随尿素添加水平的升高逐渐降低,但差异不显著(P>0.05)。[结论]日粮补充适宜尿素(10 g·kg^(-1))可提高空肠内氨态氮含量,促进氮利用细菌的生长定殖,改善菌群结构。此外,添加尿素会影响空肠上皮Rhbg基因的表达,但不影响Rhcg基因和UT-B基因的表达。

厄贝沙坦对5/6肾切除及腹主动脉缩窄大鼠左心室肥厚及心肌尿素转运蛋白B表达的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂厄贝沙坦对5/6肾切除及腹主动脉缩窄大鼠左心室肥厚及心肌尿素转运蛋白B(UT-B)表达的影响。方法 SD大鼠随机分为假手术组、5/6肾切除组(肾衰组)、腹主动脉缩窄组(心衰组)、肾衰+心衰组及相应的厄贝沙坦干预组,每组8只。分组处理后,测定各组大鼠血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、B型利钠肽(BNP);取大鼠心脏,测定左心室质量与全心质量的比值(LVW/HW)、全心质量与体质量的比值(HW/BW)、左心室质量与体质量的比值(LVW/BW);RT-PCR和Western blotting检测心肌UT-B表达。结果与假手术组比较,肾衰组、心衰组及肾衰+心衰组大鼠出现心肌肥厚,LVW/HW、HW/BW、LVW/BW增大,血清AngⅡ和BNP水平增高,心肌组织UT-B mRNA和UT-B蛋白表达上调;肾衰组和肾衰+心衰组SCr、BUN水平升高。与肾衰组、心衰组及肾衰+心衰组比较,相应的厄贝沙坦干预组大鼠的心肌肥厚明显减轻,LVW/HW、HW/BW、LVW/BW降低,血清AngⅡ和BNP下降,心肌UT-B mRNA和UT-B蛋白表达下调。与肾衰组和肾衰+心衰组比较,相应的厄贝沙坦干预组大鼠SCr、BUN水平降低。结论 5/6肾切除及腹主动脉缩窄均可引起大鼠心功能明显下降,出现左心室肥厚,同时心肌UT-B表达增加;厄贝沙坦在改善心、肾功能的同时抑制心肌UT-B表达,UT-B可能在肾功能不全合并心力衰竭的发生中具有重要作用。

脑型失衡综合征可能的分子基础:尿毒症小鼠脑组织水通道蛋白1,5及尿素转运蛋白B1表达的变化

目的探讨水通道蛋白1,5及尿素转运蛋白B1在慢性肾衰竭小鼠脑组织中表达水平的变化及影响,进一步揭示血液透析脑型失衡综合征可能的分子基础。方法选用6~8周龄,雄性BALB/c小鼠,将小鼠分为正常组（N）、假手术组（S）和慢性肾衰竭模型组（CRF组）。CRF模型小鼠通过对其右肾2/3肾皮质透热毁损,并在1周后将左肾完全切除的方法建立。假手术组小鼠只进行麻醉和手术切口,肾脏不做处理。正常组的小鼠不做任何处理。模型建立后10、40和70天3个时间点每组各处死5只小鼠,并留取小鼠的肾脏、血清和脑组织标本。检测三组小鼠肾组织病理、血清肌酐和尿素氮;用Western Blotting方法测定在造模后10天、40天和70天3组小鼠脑组织内水通道蛋白1,5（Aquaporin,AQP）及尿素转运蛋白B1（Urea Transportprotein,UT-B1）的表达。结果 CRF模型组在造模后10天肾组织病理结果显示部分肾小囊扩张,球囊粘连,肾小管上皮细胞颗粒样变性。造模后40天、70天表现为部分肾小球增生硬化,部分肾小管萎缩。造模10,40,70,天CRF模型组血清肌酐分别是（841.80±336.93）umol/L、（1885.17±689.49）umol/L、（1276.56±496.09）umol/L,与正常组和假手术组肌酐值相比均显著升高（10d：F=26.768,P=0.007;40d：F=34.928,P=0.004;70d：F=29.998,P=0.005）,提示慢性肾衰竭模型成功。Western Blotting检测实验各组脑组织AQP1、AQP5及UT-B1的表达,结果显示：在造模10,40,70天,CRF模型组UT-B1均未表达,正常组及假手术组表达差别无统计学意义。在造模后10天正常组AQP1表达量与假手术组及CRF组比较均有统计学差异（P〈0.05）。CRF模型组较正常组AQP1表达量升高46.67%（t=0.122,P=0.001）;AQP-5表达量较正常组升高41.09%（t=0.012,P=0.001）。在造模后40天,假手术组与正常组AQP-1,5表达量无显著性差异;而CRF模型组AQP-1表达量较正常组升高28.98%（t=4.926,P=0.001）,AQP-5表达量较正常组升高20.83%（t=0.857,P=0.003）。在造模后70天,假手术组与正常组AQP-1,5表达量无显著性差异,而CRF模型组AQP-1表达量较正常组升高30.26%（t=8.471,P=0.001）;AQP-5表达较正常组升高45.67%（t=3.352,P=0.001）。结论 CRF模型小鼠脑组织AQP1,5的表达明显增加,同时伴有尿素转运蛋白B1的不表达或表达明显下降,这一结果为揭示脑型失衡综合症提供了线索。脑组织尿素转运蛋白的低表达导致快速血液透析脑中尿素清除延迟,进而形成脑血尿素浓度梯度,驱动水分通过过多表达的水道蛋白进入脑组织,导致脑水肿。

大鼠尿素转运蛋白B基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆sD大鼠尿素转运蛋白B（ureatransporterB，UT-B）的CDS全长基因并构建其真核表达载体。方法从SD大鼠肾髓质中提取总RNA并经逆转录反应获取总cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增UT-B基因的CDS区全长片段，PCR产物加＂A＂尾后克隆至pMD-18T克隆载体，双酶切后获取UT-B片段，T4DNA连接酶将UT-B片段与KpnI和BamHI双酶切后的真核表达载体pcDNA3-1（-）连接，构建大鼠UT-B真核表达载体pcDNA3．1（-）-UT-B。结果成功克隆了sD大鼠UT-B基因，构建的pcDNA3．1（-）-UT-B载体经PCR扩增、KpnI和BamHI双酶切鉴定及测序验证，表达载体包含UT-B基因，且UT-B碱基序列与GeneBank中收录的大鼠UT-B序列-致。结论成功克隆了该基因并构建了其真核表达载体pcDNA3．1（-）-UT-B，为进-步进行UT-B基因转染治疗尿毒症的研究奠定了基础。

饲料中添加沸石对慢性肾衰犬结肠尿素转运蛋白B及氨转运体蛋白Rh表达的影响

本研究旨在探究沸石对慢性肾衰犬结肠尿素转运蛋白B及氨转运体蛋白Rh表达的影响。选取15条2岁左右的中华田园犬,采用肾动脉结扎制作慢性肾衰(CRF)模型,另取5只犬仅腹壁切开作为假手术对照组(SOG)。造模成功后,随机等分成3组:模型组(MD)、低剂量沸石组(LCD)和高剂量沸石组(HCD),SOG组与MD组饲喂基础饲料,LCD组为1%沸石饲料,HCD为5%沸石饲料,试验连续4周。用自动化血液生化仪检测血清尿素氮(BUN)和粪尿素氮(FUN),用谷氨酸脱氢酶法测定门静脉血氨,用尿素检测试剂盒测定尿尿素量(uUrea),qRT-PCR检测结肠黏膜尿素转运蛋白B(UT-B)、氨转运体蛋白b(Rhbg)与氨转运体蛋白c(Rhcg)mRNA表达,Western blot法检测UT-B、Rhbg与Rhcg的蛋白表达。结果显示,MD组的BUN、FUN及门静脉血氨均高于SOG组,uUrea降低(P<0.01),与MD组比较,HCD组的BUN、FUN、门静脉血氨均显著降低(P<0.05);MD组Rhbg、Rhcg的mRNA表达显著高于SOG组(P<0.05),与MD组比较,HCD组Rhbg、Rhcg及LCD组Rhcg的mRNA表达显著下调(P<0.05),各组间UT-B的mRNA表达无显著变化(P>0.05);MD组Rhbg、Rhcg的蛋白表达显著高于SOG组(P<0.05),与MD组比较,HCD组Rhbg、Rhcg的表达降低,MCD组Rhcg表达降低,差异显著(P<0.05),各组间UT-B表达无差异;Pearson相关性分析发现,慢性肾衰犬BUN水平与Rhcg呈强的正相关(r=0.855,P<0.05),与Rhbg呈中等正相关(r=0.769,P<0.05)。以上结果表明,沸石具有促进CRF犬BUN经肠排泄的作用,与结肠黏膜Rhbg、Rhcg的表达下调有关,以添加5%剂量最佳。

反刍动物体内尿素循环及其转运蛋白的分子调控机制研究进展

虽然在哺乳动物体内都存在尿素循环利用机制,但是反刍动物由于瘤胃的存在而使得尿素循环在维系机体氮平衡和提高氮素利用效率等方面发挥着更加重要的生物学意义。通过瘤胃壁扩散或转运,血液中的尿素可进入胃肠道,在脲酶的作用下转化为氨态氮,从而为瘤胃微生物蛋白合成提供氮源。研究表明,尿素在瘤胃上皮的自由扩散速度较慢,而尿素转运蛋白可以介导尿素分子高效地进行跨膜转运,其也被认为是反刍动物尿素循环最重要的调控因子。然而,相关报道已经证实,尿素转运蛋白的表达和功能发挥受到日粮营养水平与结构组成、瘤胃内环境、动物年龄等因素的影响。本文以尿素循环为出发点,重点阐述了反刍动物体内尿素循环的特点、影响因素以及尿素转运蛋白的表达特征及其分子调控过程,以期从分子生物学角度解析反刍动物尿素循环的作用机制,从而为生产实践中动物氮素的精准营养提供理论依据和技术支撑。

AQP3缺失小鼠尿素和尿浓缩能力的研究

目的:肾脏表达水通道蛋白3(AQP3)在尿浓缩机制中起着极其重要的作用。AQP3缺失小鼠表现为尿浓缩功能严重障碍。为阐明这种基因缺失的生理特性和发生机制,我们利用AQP3基因敲除小鼠和野生型小鼠复制急性尿素负荷动物模型,对其作用机制及影响进行研究。方法:对小鼠实施急性尿素负荷,从实验前2h到尿素负荷后第8h,每隔2h收集1次尿样分别检测尿量、尿渗透压及尿素浓度。分离肾脏组织RNA进行实时荧光定量RT-PCR反应。应用Western blotting分析肾组织中尿素转运蛋白(UTs)的变化。结果:给予尿素后4h左右,2种不同基因型小鼠均有负荷尿素的排泄。尿素负荷后AQP3缺失小鼠尿的渗透压和尿素含量逐渐增高,第8h,几乎与野生型小鼠值相等,但尿中非尿素溶质浓度却没有改变。在最后4h内尿量下降到基础值的1/4。AQP3基因缺失和野生型小鼠尿素负荷显著地上调了UT-A3的表达。结论:AQP3基因缺失并没有直接干扰肾脏对尿素的浓缩功能,但却减弱了对尿中其它溶质浓缩的能力。这种对溶质选择性的反应是由于AQP3对水和尿素转运能力的不同所致。结果表明AQP3对尿中非尿素溶质的浓缩具有特殊作用。

反刍动物瘤胃尿素氮代谢的研究进展

尿素氮循环再利用对哺乳动物维持体内氮平衡和提高氮素利用率等方面具有重要意义,尤其是对反刍动物而言,当饲料日粮中氮含量摄入不足时,会更加依赖于尿素氮循环再利用。本文以反刍动物尿素氮循环再利用为对象,阐述了反刍动物体内尿素氮循环利用的特点及影响瘤胃尿素氮循环再利用的因素,为实际生产中反刍动物的精准营养提供理论依据和技术支撑。

大鼠UT-B重组腺病毒载体的构建及体外转染Caco-2细胞后基因表达

目的采用GatewayTM技术构建含大鼠尿素转运蛋白B(Urea transporter B,UT-B)和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fuorescent protein,EGFP)的重组腺病毒载体,并以该载体体外转染Caco-2细胞,观察Caco-2细胞内UT-B的表达。方法分别以pMD18-UT-B和IRES2-EGFP质粒为模板,PCR扩增UT-B和IRES-EGFP序列,通过引物重叠区进行PCR拼接,并在UT-B-IRES-EGFP两端引入attB1、attB2重组臂序列。PCR产物经BP重组系统将UT-B-IRES-EGFP融合基因重组到入门载体pDONR221中,构建入门克隆。入门克隆与表达载体pAD/CMV/V5-DEST使用LR重组系统进行体外重组,构建表达克隆pAD-UT-B-IRES-EGFP,pAD-UT-B-IRES-EGFP转化DH-5α,筛选阳性克隆,PCR及测序验证。pAD-UT-BIRES-EGFP用Pac I酶切线性化后由Lipofectamine 2000介导转染293A细胞,包装病毒,收集病毒液并测定滴度。重组的腺病毒体外感染培养的Caco-2细胞,RT-PCR观察Caco-2细胞中UT-B mRNA的表达。结果成功构建了pAD-UT-B-IRES-EGFP载体,经PCR及测序验证,表达载体包含UT-B基因,且序列与GeneBank中收录的大鼠UT-B序列一致。重组的腺病毒感染Caco-2细胞后可检测到UT-B mRNA的表达。结论利用GatewayTM系统成功构建了包含UT-B和IRES-EGFP的腺病毒表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。

人腹膜间皮细胞中UTB表达的研究

目的:研究人腹膜间皮细胞(HPMC)中尿素转运蛋白(UTB)的表达。方法:收集患者腹膜透析液,采用细胞悬液分离HPMC,并进行HPMC原代及传代培养;免疫组化法鉴定体外培养细胞;抽提HPMCRNA,RT-PCR法扩增基因片段,以人肾髓质为对照,对扩增产物进行测序分析。结果:HE染色及免疫组化鉴定细胞角蛋白和波形蛋白染色均为阳性,细胞第Ⅷ因子相关抗原及白细胞CD45抗原染色均呈阴性,证实培养细胞为HPMC,纯度可达96%以上,RT-PCR扩增产物经电泳检测与预期结果相符243bp,扩增产物测序结果与UTB序列比较结果一致。结论:HPMC中存在UTB表达,本研究有助于进一步了解腹膜透析超滤不充分的机制,为其临床防治提供依据。

亚洲人阿尔兹海默症miRNA-mRNA网络的生物信息学分析

随着社会人口老龄化加剧,以阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease, AD)为代表的认知障碍疾病越来越严重地危害着人类的生命健康,带来了巨大的社会和经济负担。然而目前AD的发病机制尚未明确,也未见有效的治疗药物。此外,现有关于AD的机制研究大多数集中在高加索人群,而关于亚洲人群的研究少见报道。收集GEO公共数据库中亚洲人AD患者与正常人mRNA/miRNA芯片表达数据,筛选核心差异基因与差异miRNA,构建miRNA-mRNA差异表达网络。结果发现hsa-mi-22、hsa-miR-24、hsa-miR-125b-1-3p、hsa-mi-125-3p等差异miRNAs以及四个脑区的靶基因,并构建四个脑区的miRNA-mRNA差异表达网络。发现了四个脑区共有靶基因SLC14A1以及单脑区特有靶基因,为亚洲人AD的诊疗提供新的靶点与依据。

免疫组化指标在膀胱癌中的研究进展

膀胱癌是较常见的泌尿系统肿瘤,对患者的生命健康产生着严重影响,但膀胱癌的早期诊断率较低,复发率较高,因此,寻找可靠的免疫组化指标,对于膀胱癌早期诊断、监测以及膀胱癌的治疗、患者治疗费用的降低都具有重要意义。近年来,科学研究发现越来越多的免疫组化指标与膀胱癌有关,本文就免疫组化指标半乳凝素-9、程序性死亡配体-1(PD-L1)、尿素转运蛋白B(UT-B)等在膀胱癌中的研究进展作一综述。