尿素通道蛋白在正常人和尿毒症患者汗腺细胞中的表达

目的探讨尿素通道蛋白(UTs)在正常人和尿毒症患者中皮肤及汗腺细胞表达情况。方法切取尿毒症及肾功正常者腹部皮肤及腋臭患者的大汗腺组织,采用免疫组化SP法及免疫荧光法检测汗腺组织中UTs的表达特征,定量分析UTs在尿毒症及对照组间表达的差异。结果 UTs在人皮肤基底层细胞及大、小汗腺组织中均有表达。N-UT-A1、UT-B1蛋白亚型在尿毒症组的小汗腺细胞中表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),C-UT-A1蛋白亚型在两组间的表达差异不大(P>0.05)。结论人皮肤基底层细胞、小汗腺细胞及大汗腺细胞中均表达UTs,且UTs在尿毒症患者的小汗腺中表达比正常人更高。

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因(ureI)的克隆及其表达和纯化

目的 对幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI进行克隆、测序 ,并在昆虫细胞中表达及进行产物纯化。方法 克隆ureI基因 ,经测序正确后 ,酶切、连接到pFASTBACHb质粒上 ,与穿梭载体DH10BAC转座 ,获得Bacmid ureI质粒 ,转染Sf9细胞 ,采用Ni2 +螯合琼脂糖亲和层析纯化 ,经SDS PAGE和Westernblot鉴定。结果 克隆了ureI基因 ,并在昆虫细胞Sf9中表达纯化 ,蛋白纯度达 85 %以上 ,并与 6 His单抗特异结合。

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI的检测、克隆及序列分析

目的:检测镇江地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hpylori)尿素通道蛋白基因ureI,并进行克隆和序列分析.方法:从胃十二指肠疾病患者胃黏膜组织中分离培养获得60例Hpylori,PCR扩增检测ureI基因,部分菌株的ureI基因克隆至pMD18-T载体上,进行测序和序列分析.结果:60例Hpylori菌株的ureI检出率为100%,成功克隆了8株来源于慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的Hpylori菌株ureI并进行了序列分析.结果表明不同来源Hpylori菌株之间ureI核苷酸和氨基酸序列同源性均高达95.6%以上.结论:ureI基因在Hpylori中高度保守,可以作为鉴定Hpylori的分子诊断标志.

尿素通道蛋白B在人膀胱癌组织中的表达及其临床意义

目的:检测膀胱癌患者肿瘤组织和正常膀胱黏膜组织中尿素通道蛋白B(UT-B)的表达,阐明其在膀胱癌组织中表达的临床意义。方法:收集临床膀胱癌患者术后石蜡包埋标本52例,以正常膀胱黏膜组织15例作为对照,采用免疫组织化学方法检测UT-B蛋白阳性表达率,分析UT-B蛋白阳性表达率在膀胱癌组织和正常膀胱黏膜表达的差异以及其与患者临床病理参数的关联。结果:UT-B蛋白在膀胱癌组织中低表达,阳性表达率为44.2%;在正常膀胱黏膜组织中高表达,阳性表达率为93.3%,2组UT-B蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P=0.001)。膀胱癌组织中UT-B蛋白的阳性表达率随肿瘤组织分级的增高而逐渐降低,不同分级间比较差异有统计学意义(P=0.010)。膀胱癌组织中UT-B蛋白在非肌层浸润期(Ta+T1)的阳性表达率明显高于肌层浸润期(T2+T3),组间比较差异有统计学意义(P=0.014)。结论:UT-B蛋白的表达降低或缺失可能促进了膀胱癌的发生发展和侵袭。

尿素通道蛋白B敲除小鼠海马毛细血管的体视学

目的:研究尿素通道蛋白B(UT-B)敲除小鼠海马组织中尿素对海马毛细血管形态结构的影响,探讨UT-B基因敲除小鼠出现抑郁样行为的病理机制.方法:采用糖水偏好实验观察野生型和UT-B基因敲除小鼠的抑郁样行为,尿素检测试剂盒测定2型小鼠海马尿素水平,免疫组织化学和体视学定量检测2型小鼠海马毛细血管总长度、总体积、总表面积、平均直径等形态学指标.结果:糖水偏好实验中,野生型和UT-B基因敲除小鼠的糖水偏爱指数分别为77.22％±3.93％vs6L 20％±4.42％,差异具有统计学意义.野生型和UT-B基因敲除小鼠海马尿素水平,海马毛细血管的总长度、总体积、总表面积、平均直径差异均有统计学意义.结论:UT-B敲除导致小鼠海马尿素堆积,引发小鼠海马毛细血管的形态改变,毛细血管总体积下降造成海马血灌注量不足而引发小鼠的抑郁样行为.

尿素通道蛋白的研究进展

尿素通道蛋白是转运尿素的跨膜蛋白 ,目前已克隆出的尿素通道蛋白包括两个家族。UT A家族有 5个亚型 ,主要分布在肾脏 ,UT B家族分布广泛 ,主要分布在红细胞膜和肾直小血管降支。尿素通道蛋白在肾脏尿浓缩过程中起重要作用 ,其表达可受加压素、血浆渗透压和饮食蛋白量的调节。

尿素通道蛋白的组织分布和生理功能

尿素通道蛋白（urea transporter,UT）是一类特异性通透尿素的跨膜蛋白,其包括两个亚家族。UT-A亚家族有6个成员（UT-A1~UT-A6）,主要分布在肾脏。UT-B亚家族只有1个成员UT-B。UT-B分布广泛,在红细胞、肾脏、大脑、膀胱、睾丸、血管内皮等多组织器官表达。尿素通道蛋白在肾脏尿液浓缩过程中发挥重要作用,也参与其所表达组织器官的生理功能。该文主要综述尿素通道蛋白的组织分布及其生理学功能。

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI的真核载体构建、表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(UreI)的真核表达的重组载体,并在COS-7细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法以原核表达质粒pET32a(+)/UreI为模板,扩增UreI编码基因片段,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pEGFP-N1进行连接,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pEG-FP-N1/UreI,并在COS-7细胞中表达,以荧光蛋白和Western blot法检测其表达产物。结果经酶切、测序证实插入的基因片段为H.pyloriUreI蛋白编码基因;荧光显微镜下和Western blot法等检测显示,该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白,同时能够被H.pylori阳性患者血清所识别。结论成功地构建了真核重组载体pEGFP-N1/UreI,并在COS-7细胞中表达。

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。

尿素通道蛋白B基因敲除小鼠心脏电生理特性的改变

目的:研究尿素通道蛋白B(UT-B)基因敲除对小鼠心脏电生理特性的影响。方法:使用常规的心电图、心肌细胞动作电位记录方法和膜片钳实验技术。结果:①UT-B基因敲除小鼠30%发生了不同程度的心律失常,而对照组的野生C57小鼠无一例发生心律失常。②基因敲除小鼠心室肌细胞动作电位幅值(APA)及最大除极速度(Vmax)明显受到抑制(P<0.05),而心室肌细胞动作电位复极50%、90%时程(APD50、APD90)和正常对照组比明显延长(P<0.05)。③基因敲除小鼠心室肌细胞膜上钠离子通道电流幅值和对照组比明显降低(p<0.01)。结论:UT-B基因敲除可以导致小鼠心脏电生理特性发生改变。

尿素通道蛋白B敲除引起小鼠大脑皮质毛细血管形态改变的体视学研究

目的:研究尿素通道蛋白B(Urea transporter B,UT-B)敲除对小鼠大脑皮质毛细血管形态结构的影响及出现抑郁样行为的病理机制。方法采用强迫游泳实验观察野生型和UT-B基因敲除小鼠的抑郁样行为,免疫组化技术和体视学方法定量检测两型小鼠大脑皮质毛细血管总长度、总体积、总表面积、平均直径等形态学指标。结果强迫游泳实验中,野生型和UT-B基因敲除小鼠的不动时间分别为(123±19 s)和(86±13 s),P=0.0012<0.05,差异具有显著性。两型小鼠大脑皮质的体积皱缩率分别为0.53±0.04、0.51±0.07(P>0.05),无显著性差异。野生型小鼠和UT-B基因敲除小鼠大脑皮质毛细血管的总长度为(29.20±1.20)m和(24.00±2.45)m(P=0.093>0.05),总体积为(1.159±0.095)mm3和(0.855±0.060)mm3(P=0.035<0.05),总表面积为(6.143±0.377)cm2和(4.616±0.455)cm2(P=0.042<0.05),平均直径为(6.506±0.161)μm和(5.564±0.118)μm(P=0.016<0.05)。结论:UT-B敲除可能导致小鼠大脑皮质毛细血管总表面积、总体积和平均直径显著下降,造成大脑血灌注量不足而引发小鼠的抑郁样行为。

高盐饮食对尿素通道蛋白B基因缺失小鼠动脉血压的影响及其机制

目的:探讨高盐饮食对尿素通道蛋白B基因(UT-B)缺失(UT-B^-/-)小鼠动脉血压的影响,阐明UT-B^-/-导致小鼠动脉血压改变的可能机制。方法:杂合子小鼠交配获得遗传背景相同野生型(UT-B^+/+)小鼠和UT-B^-/-小鼠;选取4周龄雄性UT-B^+/+小鼠和UT-B^-/-小鼠,分别给予4周普通饮食(0.3%NaCl)或高盐饮食(8.0%NaCl),分为UT-B^+/+小鼠+普通饮食组(UT-B^+/++N)、UT-B^-/-小鼠+普通饮食组(UT-B^-/-+N)、UT-B^+/+小鼠+高盐饮食组(UT-B^+/++H)和UT-B^-/-小鼠+高盐饮食组(UT-B^-/-+H),共4组。监测各组小鼠饮水量和平均动脉压的变化,采用RT-PCR法、Westernblotting法和免疫组织化学法检测脑组织脉络丛(CP)UT-BmRNA和蛋白表达水平和定位,ELISA法检测各组小鼠血清血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平和脑脊液中钠离子水平。结果:PCR法检测鼠尾基因组DNA,UT-B^+/+小鼠在400bp处有1条碱基片段,杂合子小鼠在250和400bp处各有1条碱基片段,UT-B^-/-小鼠在250bp处有1条碱基片段。与普通饮食组比较,高盐饮食组小鼠饮水量明显增加(P<0.01);与UT-B^-/-小鼠+普通饮食组和UT-B^+/+小鼠+高盐饮食组比较,UT-B^-/-小鼠+高盐饮食组小鼠平均动脉压明显升高(P<0.01);UT-BmRNA和蛋白表达于UT-B^+/+小鼠脑组织CP上皮细胞。与UT-B^-/-小鼠+普通饮食组和UT-B^+/+小鼠+高盐饮食组比较,UT-B^-/-小鼠+高盐饮食组小鼠血清AngⅡ水平明显升高(P<0.01),脑脊液中钠离子水平明显升高(P<0.05)。结论:高盐 饮食可导致UT-B^-/-小鼠平均动脉压明显升高,其机制与升高小鼠血清AngⅡ和脑脊液钠离子水平有关。

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a(+)分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a(+)/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585 bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a(+)/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130 ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a(+)/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达。

六、其他药物药理学——尿素通道蛋白的分子生物学和药理学研究

尿素通道（UT）是特异性通透尿素的膜通道蛋白。目前已经克隆了7个成员，分为UT-A和UT-B两个亚家族，UT—A亚家族包括6个成员（UT—A1至UT-A6）由同一基因（Slc14a2）经不同启动子调控和转录后剪切所产生。

尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变与抑郁样行为的关系

目的探讨尿素通道蛋白B(UT-B)敲除小鼠海马超微结构改变,以及水通道蛋白4(AQP4)的表达变化,探讨形态改变与小鼠抑郁样行为的关系。方法采用糖水偏好和强迫游泳实验检测野生型与UT-B敲除小鼠(各10只)的行为差异,透射电子显微电镜观察小鼠海马组织的超微结构改变,免疫组织化学观察脑组织AQP4的表达,免疫印迹技术检测AQP4表达水平。结果野生型小鼠与UT-B基因敲除小鼠糖水偏好指数分别为(84.67±4.85)%和(65.67±7.97)%(P<0.001),而强迫游泳实验不动时间分别为(128.56±11.24)s和(209.11±20.99)s(P<0.001);两种行为学检测结果显示,UT-B敲除小鼠表现出抑郁样行为。电子显微镜结果显示,敲除小鼠出现神经元神经纤维肿胀和退行性改变,血管周围星形胶质细胞终足肿胀。免疫组织化学结果显示,敲除小鼠脑皮质、海马、丘脑等部位AQP4免疫阳性细胞数量明显减少,AQP4免疫阳性细胞主要分布于软脑膜、室管膜及脑血管周围,但脑血管周围免疫染色减弱。免疫印迹法检测提示,海马组织中AQP4表达水平下调27.1%(P<0.05)。结论UT-B基因敲除小鼠脑皮质和海马AQP4表达减少,可能通过影响神经发生和脑代谢引起小鼠的抑郁样行为。

幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的克隆、表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的原核表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法从前期已构建好的融合表达质粒pET32a(+)/UreI中,酶切目的基因UreI,并胶回收目的基因片段,将目的基因UreI与载体pQE3.0分别经HindIII和KpnI双酶切、纯化、连接,转化并筛选含有目的基因的重组质粒pQE30/UreI,并在E.coliBL21中表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经KpnI、HindIII双酶切后,小片段大小为585bp,为插入的基因片段HpUreI基因,经KpnI、NbaI双酶切,小片段为1749bp,与实验设计相一致。重组质粒pQE30/UreI经SDS-PAGE分析显示,在原核细胞中得到了高效表达,目的蛋白分子量为21kD左右,以包涵体形式表达。通过Quantity-one软件分析,其表达量约占菌体总蛋白的20%。经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达90%以上,Western blot分析显示,该目的蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的免疫原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pQE30/UreI,并在原核细胞中得到了高效表达。

尿素通道蛋白B的转运特性

尿素通道蛋白B(urea transporters B, UT-B)主要表达在红细胞和一些上皮及内皮细胞膜,介导尿素的跨膜转运。近年来研究发现UT-B亦参与其他物质的转运,如水、NH3和尿素类似物等,提示UT-B还可以作为水和气体通道。本文主要阐述UT-B对这些物质的转运特性,并探究其可能的生理学意义。

幽门螺杆菌尿素通道蛋白研究进展

幽门螺杆菌是人类最常见的致病菌,我国普通人群的感染率为50%～80%,而且仍以每年1%～2%的速度增加。H.pylori感染与人B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系,同时与MALT淋巴瘤和胃癌以及胃肠外疾病也有重要的关系。实验证明H.pylori能够导致蒙古沙鼠胃癌的发生,故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原。抗生素在H.pylori根除及其相关疾病治疗方面取得了较大进展,但其毒副作用明显、疗效不稳定,

尿素通道蛋白B基因敲除对小鼠心电图与心肌动作电位的影响

尿素通道蛋白B(UT-B)为介导尿素跨膜转运的通道蛋白,在肾脏和其他肾外组织,如红细胞、脑、心脏、膀胱和睾丸等组织、细胞中广泛表达.为探讨UT-B缺失对心脏表型的影响,应用RT-PCR,Westernblot检测UT-B mRNA,UT-B蛋白在野生型小鼠(UT-B+/+)和UT-B基因敲除纯合子小鼠(UT-B+/+)心脏组织的表达情况,对比观察6,16,52周UT-B基因敲除纯合子(UT-B+/+)与野生型小鼠肢体Ⅱ标准导联心电图,应用悬浮微电极法记录分离的16周小鼠心室肌细胞动作电位各参数变化.结果显示UT-B的mRNA和蛋白在UT-B+/+小鼠心脏有表达,而UT-B+/+小鼠无表达;UT-B+/+小鼠P-R间期((43.5±4.2),(45.5±6.9),(43.8±7.6)ms)明显长于UT-B+/+小鼠((38.6±2.9),(38.7±5.6),(38.2±7.3)ms,P<0.05),随增龄P-R间期无明显延长,但老龄组(52周)Ⅱ度和Ⅲ度房室传导阻滞发现率超过20%;动作电位记录结果显示UT-B+/+小鼠的动作电位幅值(APA),动作电位最大除极速度(Vmax)与UT-B+/+小鼠比较,前者明显受到抑制(P<0.05),其APD50,APD90明显延长(P<0.05).总之,本研究发现野生型小鼠心肌有UT-B表达,UT-B基因敲除导致小鼠进展型心脏传导阻滞,提示UT-B在介导心肌电生理特性方面有重要作用.

人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达

目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。