幽门螺杆菌尿素酶A、过氧化氢酶的表达及纯化

目的 :探讨重组尿素酶A亚单位 (UreA)、过氧化氢酶 (KatA)疫苗在防治幽门螺杆菌 (HP)感染中的作用。方法 :构建表达UreA、KatA的重组质粒 ,用IPTG诱导表达融合蛋白 ,并进行SDS PAGE凝胶电泳及Westernblot分析 ,BulkGSTPurifica tionModule试剂盒纯化UreA和KatA。结果 :构建的重组质粒能表达GST UreA和GST KatA融合蛋白 ,表达量占细菌总蛋白量的 35 %和 19% ,并能与抗GST抗体发生特异性反应。纯化的UreA、KatA的纯度达 95 %以上。结论 :该工作为进一步的动物免疫实验奠定了基础 。

幽门螺杆菌尿素酶A基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)标准株NCTC11639尿素酶A(UreaseA,UreA)编码基因的重组质粒,测定、分析其核酸序列,并在E.coli中表达,研究其抗原性。方法应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增UreA编码基因片段,将其克隆至pMD18-T载体上进行序列测定,并与GenBank上公布的其它Hp菌株基因序列进行比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1上进行表达和纯化,用Western-blot检测产物的抗原性并用于对24株抗Hp全菌小鼠单克隆抗体的鉴定。结果扩增的UreA基因全长675bp(登录号为DQ141577),与GenBank上公布的其它Hp菌株的UreA核酸序列的同源性为95%～98%,表达的UreA融合蛋白分子量为52000,表达产物可被病人血清和全菌免疫的小鼠血清识别,29株抗Hp小鼠单克隆抗体中有4株是针对UreA抗原的。结论重组UreA具有较好的抗原性,为Hp检测试剂和疫苗的研究奠定基础。

幽门螺杆菌尿素酶A基因克隆表达及动物抗血清免疫保护作用研究

旨在研究动物抗血清在抗幽门螺杆菌感染方面的免疫交叉保护作用。以幽门螺杆菌标准株基因组为模板,PCR特异性扩增尿素酶A亚基基因,构建表达载体pBVIL1-ureA并转化大肠杆菌,诱导转化菌表达,用纯化的表达蛋白免疫家兔得到家兔抗血清,用抗血清和病人血清进行ELISA试验。结果显示,原核表达的抗原蛋白IL1-UreA既能与兔抗血清反应也能与幽门螺杆菌感染的病人血清反应,且两种血清与抗原蛋白存在竞争性结合反应。动物抗血清具有免疫保护作用,可以利用动物特异性抗体进行幽门螺杆菌感染的免疫预防和免疫治疗。

幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白高效表达研究

目的高密度培养重组细菌和高效表达重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白。优化细菌培养和重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白表达的发酵工艺条件。重组细菌的培养条件 :培养温度为 35℃ ,培养基pH值为7.0～ 7.5 ,葡萄糖浓度为 0 .5 %～ 2 .0 % ,采用合理的策略控制发酵过程代谢副产物乙酸盐浓度不高于 4mg ml。在BiofloⅢ发酵罐中 ,3批实验结果表明 :重组细菌的平均生物量大约为 6 0g L发酵液 (DCW) ,重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白平均表达量为 35

套式聚合酶链反应扩增尿素酶A基因检测幽门螺杆菌

应用互补于幽门螺杆菌(HP)尿素酶A基因片段的两对引物进行套式聚合酶链反应(N-PCR),外引物的扩增片段为552bp,内引物扩增片段为310bp,用该方法检测1株HP标准菌株(N-CTC14126)和20个HP临床分离株均阳性,而其他12种肠道菌均为阴性,特异性100％,敏感性可检测到0.1fg细菌DNA的水平,优于目前国外的报道。取胃粘膜活检标本30例,用细菌培养、尿素酶试验、组织学染色作为参照方法检测,20例为阳性,10例阴性,N-PCR检测结果与之完全一致。

幽门螺旋杆菌尿素酶A亚基抗原表位肽与霍乱毒素B亚基融合蛋白的生物信息学设计及表达优化研究(英文)

幽门螺旋杆菌(Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的重要致病因子。研发基于Hp尿素酶的表位疫苗是一种很有前景的防治Hp感染的策略。本研究主要通过生物信息学软件对Hp尿素酶表位肽U21和霍乱毒素B亚基(CTB)的连接顺序和间隔序列加以分析,设计出一种由U21和CTB构成的Hp表位疫苗CTB-UA。通过基因克隆技术构建含有融合基因CTB-UA的重组表达载体pETCUA及其重组菌株;重组菌株经经蛋白表达和优化后,利用Ni-NTP镍离子亲和层析和DEAESepharoseFF阴离子交换层析纯化融合蛋白CTB-UA,获得高纯度(94.8%)的融合蛋白CTB-UA。并进一步通过腹腔注射免疫BALB/c小鼠,鉴定Hp表位疫苗CTB-UA的免疫学活性,经间接ELISA鉴定小鼠能够产生针对CTB和表位肽U21的高滴度特异性抗体。结果证明,Hp表位疫苗CTB-UA具有科学合理的结构,能在大肠杆菌表达系统中获得较高水平的表达,且具有较高的免疫学特异性,为研发防治Hp感染的表位疫苗奠定一定的实验基础。

细菌尿素酶的生化和分子生物学特点

尿素酶属于镍金属酶,能够分解尿素成氨和二氧化碳。细菌尿素酶在氮素循环和致病性方面有重要的作用。本文讨论了细菌尿素酶的生物化学和分子生物学性质,并就尿素酶的活化和调控方式以及生物学效应进行阐述。

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的 建立一种有效的方法，从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）。方法重组大肠杆菌发酵后，表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性，采用Q Sepharose Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化。使用 SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用 ELISA和 Western－bloning对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后，rUreB的纯度＞70％。包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95％。rUreB纯品具有良好的生物学活性。结论 建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺，为进一步的研究打下了基础。

尿素酶预处理-气相色谱-质谱法在多种羧化酶缺陷病诊断治疗中的应用

目的 多种羧化酶缺陷病临床表现特异性不强 ,然而却是一种可用生物素治疗的遗传性代谢病。该文旨在探讨尿素酶预处理气相色谱 质谱法分析尿液成分在多种羧化酶缺陷病诊断和治疗中的应用价值。方法 尿素酶预处理气相色谱 质谱法分析 3例多种羧化酶缺陷病患儿生物素治疗前后的尿液成分 ,并整理分析其临床表现、诊治经过及预后等。结果 3例患儿临床表现特异性不强 ,但其尿液中均含有大量的 3 羟基异戊酸、3 甲基巴豆酰甘氨酸、3 羟基丙酸和甲基枸橼酸 ,其中 2例乳酸含量也高于正常对照。依据以上结果诊断多种羧化酶缺陷病 ,以生物素治疗后临床表现明显改善 ,尿液复查上述异常产物恢复到正常水平。结论 尿素酶预处理气相色谱 质谱法分析尿液成分是多种羧化酶确诊的重要方法 ,对于判断生物素疗效 ,调整用药剂量也有一定参考价值。

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的应用基因工程方法构建表达幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的菌株．方法用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ上扩增出ＵｒｅＢ基因片段，将其克隆至ｐＳＫ（＋）质粒上，然后插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达．结果经测序ＵｒｅＢ片段有１７０７ｂｐ组成，为编码５６９个氨基酸残基的多肽．ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析检测发现，ＵｒｅＢ基因表达的蛋白质分子质量为６５０００Ｕ，并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别，同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体．结论重组的ＵｒｅＢ可以作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗．

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。

中国人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的基因克隆及序列分析

目的克隆人幽门螺杆菌 (helicobacter pylori,Hp)尿素酶 B基因 (ure B) ,并分析其核苷酸序列的特性。方法用PCR技术从临床分离的 Hp菌株基因组中扩增出 ure B基因 ,将其克隆至 p HP质粒上进行序列分析。结果克隆得到的 ure B基因长度为 1713bp,其核苷酸序列与 Gen Bank公布的序列有 6 1个碱基存在差异 ,同源为 96 .44 % ,推定的氨基酸序列同源性为99.6 5 %。结论我们所克隆的 ure B基因可用于 Hp保护性抗原 Ure

大肠杆菌表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份

目的重组表达人幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位跨膜区成份。方法采用 DNA重组技术将尿素酶 B亚单位 3'端732 bp基因片段克隆至 p ET11C载体上 ,转化宿主菌 BL 2 1(DE3) E.coli,IPTG诱导 ,SDS- PAGE及 Western- blot分析表达情况。结果成功构建了含 Ure B0 .7kb片段的重组质粒 p ET- Ure B0 .7,并表达了具有免疫反应性的分子量约 2 80 0 0 u的重组蛋白 ,表达率为 19.8%。结论重组的尿素酶 B亚单位跨膜区成份为研究其相关生物学特性奠定了重要基础 ,亦可作为 Hp疫苗的成分用于

一株尿素酶阴性产气巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

本研究从猪流产胎儿中分离到一株形似产气巴氏杆菌菌株并命名为ZY14013,对其进行生化鉴定、16S rDNA序列分析和药物敏感性分析。生化鉴定结果表明,ZY14013除尿素酶阴性外,其它生化特征与产气巴氏杆菌模式菌株ATCC 27883以及其它分离株具有相似生化特征。遗传进化分析表明ZY14013与ATCC 2788以及16株现存分离株16S rDNA核苷酸同源性分别为99.2%和99.6%~99.9%,在进化树中形成同一个群。药敏试验表明,分离株ZY14013对青霉素、氟苯尼考和头孢类抗生素敏感,对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素和氧氟沙星耐药。本研究首次证实了猪产气巴氏杆菌感染在中国大陆的存在,同时,本研究在世界首次分离到尿素酶阴性产气巴氏杆菌,丰富了产气巴氏杆菌的生化特征,为研究尿素酶在产气巴氏杆菌致病性中的作用提供了自然突变体。

尿素酶预处理-气相色谱-质谱法选择性筛查遗传代谢病高危患儿327例初步研究

目的 通过对遗传代谢病高危患儿尿液成分进行生化分析 ,筛查遗传代谢病 ,为临床诊断和治疗提供实验依据。方法 收集遗传代谢病高危患儿尿液标本 ,经去尿素、加内标、除蛋白、真空干燥、三甲基硅烷基衍生等处理后 ,应用气相色谱 -质谱联用仪分析尿液中有机酸、氨基酸、糖类、多醇、嘌呤、嘧啶等成分。这一流程在国际上被称为尿素酶预处理 气相色谱 质谱法。结果 对来自中国大陆 6省、区和直辖市的 3 2 7例遗传代谢病高危患儿的尿液标本进行检测 ,共筛查出遗传代谢病 16种 2 7例 ,阳性率为 8.2 6% ,其中高苯丙氨酸血症、甘油尿症和Leigh综合征各 3例 ,丙酸血症、甲基丙二酸尿症、vonGierke病、果糖 1,6 二磷酸酶缺陷病、果糖尿症各 2例 ,多种羧化酶缺陷病、戊二酸血症Ⅰ型、枫糖尿病、高甘氨酸血症、3 氨基异丁酸尿症、半乳糖血症、瓜氨酸血症Ⅱ型及Fanconi综合征各 1例。经临床干预虽然仍有部分患儿预后不良 ,但多种羧化酶缺陷病、甲基丙二酸尿症、半乳糖血症等患儿获得较好的治疗效果。其余患儿的病情有待追踪观察。结论 应用尿素酶预处理 气相色谱 质谱法分析尿液成分 ,是筛查某些遗传代谢病的有效方法 ,检测结果可为患儿的诊断和治疗提供有效指导。

尿素酶预处理-气相色谱-质谱法在甲基丙二酸尿症诊断中的应用

目的探讨尿素酶预处理-气相色谱-质谱法（UP-GC-MS）在甲基丙二酸尿症（MMA）诊断、治疗中的价值。方法留取8例MMA患儿和15例同年龄健康儿童晨尿2mL,尿液标本经尿素酶去尿素、加内标正十七酸、除蛋白、真空干燥处理,残余物用双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺/三甲基氯硅烷（BSTFA/TMCS）衍生后进样,分析仪器为Finnigan GC-MS联用仪,每次取样0.5-1.0μL,扫描模式为全扫描加选择离子扫描模式,分流比10∶1,起始温度60℃,然后以17℃/min的速度升温至320℃。质谱电离方式为电子解离模式,扫描范围为m/z50-m/z650。应用SPSS12.0软件进行t检验。结果患儿尿液中可检测到明显的甲基丙二酸、甲基枸橼酸等MMA患儿尿液标志物信号。在总离子流图上,其绝对保留时间（相对保留时间）分别是6.78min（0.396min）和11.53min（0.24min）。在质谱图上,甲基丙二酸的特征离子（三甲基硅烷化后质荷比,TMSm/z）分别为73、147、247。8例MMA患儿尿液甲基丙二酸水平为1.72-18.2nmol/mgCr;健康对照组15例儿童为0.001-0.202nmol/mgCr。经过lg（x＋5）对数转换后（其中x为原始数据）,病例组尿液甲基丙二酸水平为（0.703±0.005）,健康对照组为（0.973±0.184）,二组比较差异具有统计学意义（t=4.10P〈0.01）。结论建立UP-GC-MS分析尿液代谢成分超越了有机酸萃取法的一些局限,是MMA确诊的重要方法。

幽门螺杆菌UreB单克隆抗体的制备及尿素酶活性抑制能力的研究

目的制备抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体,并检测其对尿素酶活性的抑制能力。方法以重组UreB蛋白为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗UreB单克隆抗体,用ELISA检测mAb的效价、亲和常数;用Westernblot检测mAb的特异性。将尿素酶与单克隆抗体预孵育后加入含有尿素和酚红的缓冲液,于550nm测定单克隆抗体对尿素酶活性的抑制能力。结果得到5株稳定分泌抗UreB的单克隆抗体的杂交瘤细胞1D5、9E1、3A2、1D6、6E6。测定抗体亚型1D5,9E1,3A2为IgG1,1D6、6E6为IgG2a,亲和常数分别为4×108、4.6×108、2.8×108、2×109、3×109L/mol。Westernblot鉴定5种单克隆抗体均能和重组UreB及全菌蛋白中的UreB抗原发生特异性结合,且均不与肠道常见菌发生交叉反应。5株单克隆抗体中只有6E6具有对尿素酶活性的抑制作用,且抑制率与单克隆抗体剂量相关。结论制备了5株稳定分泌抗UreB抗体的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体效价高且特异性好,其中6E6能抑制尿素酶活性。本研究为探讨尿素酶的作用机制、UreB的纯化及Hp的临床诊断和治疗奠定了基础。

4-(4-羟基苯基)乙基儿茶酚作为尿素酶抑制剂的机理

4-(4-羟基苯基)乙基儿茶酚是一种新型幽门螺旋杆菌尿素酶抑制剂,运用酶动力学研究方法,对它的抑制机理、抑制类型进行探讨.实验结果表明,4-(4-羟基苯基)乙基儿茶酚是尿素酶的竞争性抑制剂,抑制常数Ki为1.48μmol/L,为其在抗胃炎、胃溃疡方面的应用以及进一步的结构优化奠定了理论基础.

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位功能片段的纯化及活性研究

目的建立一种有效的尿素酶功能片段的纯化方法。方法应用已构建的尿素酶B功能片段表达载体,IPTG诱导表达,包涵体鉴定试验判断目的蛋白表达形式,AKTA100上分别采用亲和层析和离子层析等多级纯化方式优化纯化条件,HPLC检测纯化蛋白纯度,尿素酶活性阻断试验对纯化后功能片段进行活性鉴定。结果IPTG诱导后目的蛋白高表达,包涵体鉴定试验证实目的蛋白以可溶形式存在宿主细胞中,优化后方案得到目的蛋白纯度>90%且能被尿素酶B免疫的兔血清识别,纯化后蛋白免疫家兔后产生兔抗血清能够特异性中和Hp尿素酶活性。结论成功建立了尿素酶功能片段的纯化方法。

茅苍术挥发油对幽门螺杆菌及其尿素酶B表达的影响

目的研究茅苍术挥发油对幽门螺杆菌(HP)的抑制作用以及亚最小抑菌浓度(sub-MIC)挥发油对HP毒力因子尿素酶B(Ure B)表达的影响。方法将实验分为阳性对照组(加入100μL HP菌悬液),溶剂对照组(加入100μL HP菌悬液和0.25μL二甲基亚砜),30.000、15.000、7.500、3.750、1.875、0.938、0.469 g·L^(-1)茅苍术组(分别加入30.000、15.000、7.500、3.750、1.875、0.938、0.469 g·L^(-1)茅苍术挥发油和100μL HP菌悬液)和空白对照组(加入培养基),运用常规肉汤稀释法测定茅苍术挥发油对HP的抑制作用。将2×1010CFU·L^(-1)HP接种于布氏肉汤液体培养基,然后分为实验组和空白对照组,实验组加入茅苍术挥发油使其终浓度为0.5×最小抑菌浓度,对照组不加茅苍术探发油,微需氧培养72 h后,采用实时定量荧光聚合酶链式反应检测2组尿素酶B(Ure B)mRNA的表达。结果溶剂对照组和0.469 g·L^(-1)茅苍术组抑制率与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。30.000、15.000、7.500、3.750、1.875 g·L^(-1)茅苍术组抑制率高于阳性对照组,0.938 g·L^(-1)茅苍术组抑制率低于阳性对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组Ure B mRNA表达量为0.036±0.001,低于对照组的0.100±0.001,差异有统计学意义(P<0.01)。结论一定浓度的茅苍术挥发油可抑制HP生长,亚抑菌浓度挥发油可下调Ure B mRNA表达。